COPD 大鼠高凝狀態(tài)與 HIF-1α、EPO、RBC 和 HGB 水平的相關(guān)性研究

武 杰， 張 瑞， 許 旺， 張少華， 陳麗君

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，銀川 750001； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，銀川 750001）

最新研究顯示，我國40 歲以上人群慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患病率為13.7%[1]。COPD 患者常伴有凝血-纖溶功能異常，導(dǎo)致機(jī)體處于高凝或血栓前狀態(tài)，這種病理改變使患者易發(fā)生血栓性疾病或誘發(fā)慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD），頻繁急性加重會加速疾病進(jìn)展并導(dǎo)致患者死亡[2-5]。由此可見，COPD 具有高患病率和高病死率，已嚴(yán)重危害人類身體健康。COPD 的主要病理學(xué)表現(xiàn)為肺氣腫和慢性支氣管炎，隨著病情進(jìn)行性加重，最終可導(dǎo)致通氣及換氣功能障礙，造成機(jī)體缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是目前發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下可以發(fā)揮活性的唯一一個(gè)高度特異性核轉(zhuǎn)錄因子，缺氧下快速表達(dá)，常氧下迅速降解，與人類眾多缺氧性疾病密切相關(guān)[6]。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，COPD 患者外周靜脈血中HIF-1α 水平高于健康者，并與機(jī)體缺氧程度相關(guān)，表明 HIF-1α 與COPD 的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是 HIF-1α 的下游靶基因之一，具有促進(jìn)紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）增殖、分化及成熟的生理學(xué)功能[8]。EPO 的過量表達(dá)，可引起體內(nèi) RBC 總數(shù)和血紅蛋白（hemoglobin，HGB）表達(dá)量增多，導(dǎo)致血液黏滯。本文通過脂多糖疊加煙熏的方法建立COPD 大鼠模型，首次探討HIF-1α、EPO、RBC、HGB 與 COPD 髙凝狀態(tài)之間的關(guān)系，以期為臨床有效預(yù)防COPD 疾病進(jìn)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF 級雄性SD 大鼠20只，平均體質(zhì)量（200±20）g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（SYXK 寧2015-0001），隨機(jī)分為COPD 組和對照組，每組各10 只，均飼養(yǎng)于SPF級清潔環(huán)境。

1.1.2 試劑與儀器 脂多糖（美國Sigma：L2880），紅河牌卷煙（云南省紅云紅河煙草有限公司），D-D、FIB、EPO 的 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），Total RNA 提取試劑盒（Omega：R6834-01），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara：RR036A），QPCR 試劑盒（Takara：RR820A），引物（上海生工有限公司）；自制染毒箱（70 cm×55 cm×35 cm），煙霧發(fā)生器（美國 Buxco），小動物肺功能儀（美國 Buxco），血常規(guī)分析儀（德國 SIEMENS），全自動凝血分析儀（德國 BE-Compact），紫外可見分光光度計(jì)（美國 Thermo），酶標(biāo)儀（瑞士TECAN），熒光定量PCR 儀（美國 Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 COPD 大鼠模型制備 采用脂多糖疊加煙熏法制備 COPD 大鼠模型，第 1、14 天 COPD組大鼠氣管內(nèi)注入脂多糖（200 μg/次）；第 2～13、15～60 天將大鼠放入自制染毒箱被動吸煙（每天2 次，每次 75 min，兩次間隔時(shí)間>3 h，每次 9 支香煙）；第61～90 天將大鼠放入自制染毒箱內(nèi)被動吸煙（每天1 次，每次50 min，每次7 支香煙）；造模共90 d，對照組大鼠不做特殊處理。

1.2.2 大鼠肺功能測定 大鼠稱重，給予2%戊巴比妥納（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，于頸部正中切開氣管，插入氣管接管，放入體描箱，使用小動物肺功能儀測定肺總量（total lung capacity，TLC）、功能殘氣量（functional residual capacity，F(xiàn)RC）、200 ms 用力呼氣量與用力肺活量比值（FEV200/FVC）、吸氣阻力（airway resistance，RI）等參數(shù)。

1.2.3 大鼠血漿中 HIF-1α、EPO、APTT、PT、FIB、D-D 濃度檢測 麻醉大鼠，固定于解刨板，心臟采血，使用枸櫞酸鈉抗凝管收集2 mL 血液，立即4000 r·min-1離心 10 min，取上層血漿，采用 BECompact 全自動凝血分析儀檢測凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血酶原時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）表達(dá)量，采用ELISA 試劑盒按照說明書檢測HIF-1α、EPO、血漿纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）、D 二聚體（D-dimer，D-D）表達(dá)量。

1.2.4 大鼠全血中RBC、HGB 濃度檢測 麻醉大鼠，心臟采血，使用EDTA 抗凝管收集2 mL 血液，立即顛倒混勻防止凝血，采用血常規(guī)分析儀檢測大鼠RBC、HGB 表達(dá)量。

1.2.5 大鼠肺組織取材及病理學(xué)觀察 采用空氣栓塞法處死大鼠，開胸取左側(cè)肺浸泡于10%中性福爾馬林液，固定24 h，磷酸鹽緩沖液沖洗，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，行HE 染色。取大鼠右側(cè)肺上葉置于凍存管，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 大鼠肺組織中 HIF-1α、EPO mRNA 濃度測定 取凍存組織，按Total RNA Kit 試劑盒說明書提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定OD260/280 在1.8～2.0。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。使用qPCR 試劑盒測定mRNA 濃度。HIF-1α 引物序列：上游 5"-CCTTCATCGGAAACTCCA-3"，下游 5"-CTGGGGCATGGTAAAAGA-3"；EPO 引物序列參考文獻(xiàn)[9-10]，EPO 引物序列：上游 5"-CCCTGCTGCTTTTACTA-3"，下游 5"-ACATTTTCTGCCTCCTT-3"；內(nèi)參 ACTB 引物序列：上游 5"-GAGAGGGAAATCGTGCGT-3"，下游5"-GGAGGAAGAGGATGCGG-3"。PCR 反應(yīng)體系為 20 μL，TB Green Premix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，DNA 模板 2 μL，滅菌水6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，按下列程序循環(huán) 40 次：95 ℃變性 5 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min。采用儀器自帶溶解曲線，以ACTB 作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法測定 HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，各參數(shù)間相關(guān)分析采用Pearson 相關(guān)性分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肺功能參數(shù)比較

COPD 組大鼠 TLC、FRC、RI 均高于對照組，F(xiàn)EV200/FVC 低于對照組（P 均＜0.05），見表 1。

表1 兩組大鼠肺功能參數(shù)比較（）

表1 兩組大鼠肺功能參數(shù)比較（）

組別nTLC/mLFRC/mLFEV200/FVCRI/［cmH2O·（mL·s）-1］對照組 10 25.81±2.20 8.52±0.72 0.75±0.14 0.26±0.07 COPD 組 10 32.16±4.56 11.25±2.89 0.62±0.10 0.33±0.05 t 值 3.966 2.891 -2.461 2.774 P 值 0.002 0.016 0.024 0.013

2.2 兩組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB、APTT、PT、FIB、D-D 比較

COPD 組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB、FIB、D-D 均較對照組升高，APTT、PT 均較對照組縮短（P 均＜0.05），見表 2。

2.3 兩組大鼠肺組織病理學(xué)對比

與對照組大鼠相比，COPD 組大鼠肺組織HE 染色后表現(xiàn)為肺氣腫和慢性支氣管炎：肺泡明顯擴(kuò)張，肺泡間隔破裂并融合成大的囊腔，支氣管壁周圍可見大量炎細(xì)胞浸潤，見圖1A、圖1B、圖 1C。

2.4 兩組大鼠肺組織中 HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相對表達(dá)量比較

與對照組比較，COPD 組大鼠肺組織中HIF-1α mRNA 和 EPO mRNA 表達(dá)量均升高（t=2.294、4.314，P 均＜0.05），見圖 2A、圖 2B。

2.5 大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 與 APTT、PT、FIB、D-D 的相關(guān)性分析

COPD 組大鼠血漿EPO 表達(dá)量與血漿HIF-1α、全血 RBC、全血 HGB 及血漿 D-D 表達(dá)量呈正相關(guān)（P 均＜0.05），與血漿 APTT、PT、FIB 表達(dá)量無相關(guān)性（P 均＞0.05），見表 3、表 4。COPD 組大鼠血漿 HIF-1α 表達(dá)量與血漿 FIB、D-D 表達(dá)量呈正相關(guān)（P 均＜0.05），與血漿 APTT、PT 表達(dá)量無相關(guān)性（P 均＞0.05）；COPD 組大鼠全血 RBC、HGB 表達(dá)量與血漿D-D 表達(dá)量均呈正相關(guān)（P均＜0.05），與血漿 APTT、PT、FIB 表達(dá)量均無相關(guān)性（P 均＞0.05），見表 4。

3 討論

近年來國內(nèi)多采用單純煙熏或煙熏聯(lián)合脂多糖的方法建立COPD 大鼠模型，但造模時(shí)間尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。顧延會等[11]采用滴加2 次脂多糖聯(lián)合煙熏28 d 的方法建立COPD 大鼠模型。本次造模過程中發(fā)現(xiàn)，造模1 個(gè)月時(shí)該組大鼠肺部未出現(xiàn)典型COPD 病理改變，僅有少量炎細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為細(xì)支氣管炎癥，這表明造模時(shí)間過短可能無法得到穩(wěn)定或典型的COPD 大鼠模型。造模3 個(gè)月時(shí)該組大鼠肺部出現(xiàn)典型COPD 特征性病理改變，肺泡明顯擴(kuò)張，肺泡間隔破裂并融合成大的囊腔，細(xì)支氣管管壁可見大量炎細(xì)胞浸潤，符合人類COPD 的主要病理學(xué)改變，說明造模時(shí)間越長，建立的COPD 大鼠模型越符合人類COPD 的病理改變。本文結(jié)果顯示，COPD 組大鼠TLC、FRC、RI 均高于對照組，F(xiàn)EV200/FVC 低于對照組，證明COPD 組大鼠存在阻塞性通氣功能障礙。由此可見，煙熏聯(lián)合脂多糖3 個(gè)月的造模方法，可成功建立符合人類COPD 病理生理改變的COPD 大鼠模型。

表 2 兩組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 及凝血指標(biāo)變化（）

表 2 兩組大鼠 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 及凝血指標(biāo)變化（）

組別nHIF-1α/（pg·mL-1）EPO/（μg·L-1） RBC/（×1012/L）HGB/（g·L-1）APTT/sPT/sFIB/（g·L-1） D-D/（mg·L-1）對照組 10 27.10±10.27 2.66±1.30 8.67±0.49 153.10±10.29 25.47±2.44 10.25±0.70 4.94±0.93 0.51±0.13 COPD 組 10 41.97±12.82 4.56±1.43 10.02±0.53 168.30±9.17 21.55±2.23 9.20±0.27 6.34±1.11 0.64±0.14 t 值 2.862 3.110 5.870 3.488 -3.754 -4.435 3.053 2.252 P 值 0.010 0.006 ＜0.001 0.003 0.001 ＜0.001 0.007 0.037

圖1 兩組大鼠肺組織HE 染色圖片（×100）

圖2 兩組大鼠肺組織HIF-1α mRNA、EPO mRNA 相對表達(dá)量比較

表 3 EPO 與 HIF-1α、RBC、HGB 的相關(guān)性分析

表 4 HIF-1α、EPO、RBC、HGB 與凝血指標(biāo)的相關(guān)性分析

在生理狀態(tài)下，血液中存在凝血系統(tǒng)、抗凝血系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡，以保證血液在循環(huán)系統(tǒng)中的正常流動。血液的高凝狀態(tài)是由于凝血功能亢進(jìn)和（或）纖溶功能降低所致[12]。臨床上常用APTT 反映內(nèi)源性凝血功能，PT 反映外源性凝血功能，APTT、PT 時(shí)間縮短通常表示機(jī)體處于高凝狀態(tài)。FIB 即凝血因子Ⅰ，可與凝血酶結(jié)合，交聯(lián)形成纖維蛋白，導(dǎo)致血小板及紅細(xì)胞聚集，高水平FIB 往往預(yù)示機(jī)體處于高凝狀態(tài)[13]。D-二聚體是纖維蛋白原的降解產(chǎn)物，其水平升高，通常反映機(jī)體處于高凝及繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)狀態(tài)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠比較，COPD 組大鼠 APTT、PT 縮短，D-D、FIB 升高，與徐祎等[15-17]研究結(jié)果一致，說明COPD 疾病可以導(dǎo)致機(jī)體處于高凝狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，COPD 組大鼠 HIF-1α、RBC、HGB 表達(dá)水平較對照組升高。HIF-1α 濃度升高表明機(jī)體處于缺氧狀況。本研究中COPD 組大鼠血漿及肺組織中EPO 表達(dá)水平較對照組高，說明在缺氧條件下EPO 表達(dá)量增加。相關(guān)性分析顯示，COPD 組大鼠血漿EPO 與全血 RBC、HGB及血漿HIF-1α 均呈正相關(guān)。Yu 等[18]在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也證明，EPO 是 HIF-1α 的下游靶基因，缺氧條件下受其調(diào)控表達(dá)量增加。COPD 缺氧導(dǎo)致HIF-1α 表達(dá)水平升高，從而上調(diào)下游靶基因EPO 的高表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致RBC、HGB 濃度升高，血液黏稠度增加，而血液高黏是導(dǎo)致肺動脈壓升高的原因之一。因此，EPO、RBC、HGB 的改變促進(jìn)了COPD 疾病的進(jìn)展。

相關(guān)性分析還顯示，COPD 組大鼠血漿D-D與血漿 HIF-1α、EPO、全血 RBC 及 HGB 呈正相關(guān)，血漿 FIB 與血漿 HIF-1α 呈正相關(guān)。HIF-1α、EPO、RBC、HGB 均與凝血指標(biāo)存在相關(guān)性，說明HIF-1α、EPO、RBC、HGB 表 達(dá) 量 增 加 可 能 與COPD 凝血-纖溶功能異常相關(guān)，導(dǎo)致機(jī)體處于高凝或血栓前狀態(tài)?？赡茉陂L期缺氧刺激下，HIF-1α-EPO 通路引起繼發(fā)性紅細(xì)胞增多，導(dǎo)致血液黏滯，紅細(xì)胞變形性降低并聚集成團(tuán)形成血栓，促進(jìn)血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和聚集，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，啟動血液凝血過程，從而導(dǎo)致COPD 高凝狀態(tài)的發(fā)生[10]。

綜上所述，脂多糖疊加煙熏3 個(gè)月造模，可成功建立符合人類COPD 病理生理改變的COPD大鼠模型。COPD 大鼠處于高凝狀態(tài)，體內(nèi)HIF-1α、EPO、RBC、HGB 高表達(dá)且均與凝血指標(biāo)（PT、APTT、FIB、D-D）存在相關(guān)關(guān)系，其可能參與COPD 大鼠高凝狀態(tài)的發(fā)生。