狂犬病病毒(RABV)感染小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)Bif-1蛋白表達(dá)的影響

李武建,金宏麗,焦翠翠,時(shí)智康,張 穎,黃 培,伊淑帥,閆飛虎,趙永坤,高玉偉,楊松濤*,王化磊*,夏咸柱

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130122；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118；4.東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

Bif-1(Bax-interacting factor-1)又稱Endophilin-B1,是CUDDEBACK等[1]在2001年發(fā)現(xiàn)的一種新的Bax綁定蛋白。Bif-1是一種進(jìn)化上保守的、位于胞漿的多功能蛋白質(zhì),參與細(xì)胞自噬[2-3]、細(xì)胞凋亡[4]以及線粒體動(dòng)力學(xué)[5]等生理過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明Bif-1參與調(diào)節(jié)骨平衡[6]、癌癥[7]、缺血性中風(fēng)[8]、脂滴降解[9]及神經(jīng)性疾病[10]等多種過(guò)程。

研究表明,Bif-1的氨基端含有1個(gè)N-BAR(bin-amphiphysin-rvs)結(jié)構(gòu)域,具有膜綁定、彎曲活性；羧基端含有1個(gè)SH3(src homology 3)結(jié)構(gòu)域,能與脯氨酸富集區(qū)結(jié)合。Bif-1各亞型具有相同的SH3結(jié)構(gòu)域,由于mRNA的選擇性剪切,使Bif-1b/c的N-BAR結(jié)構(gòu)域發(fā)生了改變[11]。Bif-1不同亞型在不同細(xì)胞內(nèi)功能不盡相同。Bif-1a是非神經(jīng)元細(xì)胞的主要剪切異構(gòu)體,研究顯示其具有促進(jìn)凋亡的作用；“神經(jīng)特異性”的Bif-1c在多種疾病中對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)性作用。

在自然條件下,狂犬病病毒(rabies virus,RABV)主要侵襲動(dòng)物或人的神經(jīng)系統(tǒng),尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。有研究表明,引起狂犬病的主要原因是神經(jīng)元功能異常,而不是神經(jīng)元死亡。雖然狂犬病臨床癥狀嚴(yán)重,但中樞神經(jīng)元細(xì)胞缺乏明顯的病理學(xué)變化,限制了RABV致病機(jī)制相關(guān)研究。本試驗(yàn)通過(guò)建立RABV CVS-11株感染原代神經(jīng)元細(xì)胞模型,并利用該模型檢測(cè)RABV感染對(duì)Bif-1蛋白表達(dá)水平的影響,為進(jìn)一步研究Bif-1蛋白在RABV致病中的作用及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)粒pcDNA3.1-N,RABV CVS-11株由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒學(xué)與特種動(dòng)物疫病學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。10周齡ICR小鼠、懷孕14～16 d ICR孕鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑Neurobasal-A無(wú)血清培養(yǎng)基、B-27補(bǔ)充物、L-谷氨酰胺(L-Gln)、胎牛血清、青鏈霉素混合液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DNase Ⅰ、Poly-D-Lysine、Ara-C購(gòu)自Sigma公司；RABV N蛋白抗體,小鼠抗Bif-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus公司；FITC標(biāo)記的RABV N蛋白單克隆抗體購(gòu)自日本FUJIREBIO公司；兔抗MAP2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；小鼠抗β-actin抗體購(gòu)自北京銳抗生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購(gòu)自Sigma公司；Alexa Fluor 594羊抗兔lgG熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 RABV感染小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞

1.3.1小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 麻醉懷孕14～16 d ICR小鼠,取出胎鼠,置于預(yù)冷的DMEM液體培養(yǎng)基中，在光學(xué)解剖顯微鏡下剝?nèi)〈竽X皮質(zhì)組織,仔細(xì)剝除軟腦膜及血管等，在60 mm×15 mm培養(yǎng)皿中,使用預(yù)冷的DMEM液體培養(yǎng)基洗滌組織3次,4 000 r/min離心5 min，沉淀洗滌3次；最后1次用0.25%胰酶重懸,補(bǔ)足0.25% EDTA胰蛋白酶至20 mL(含DNase Ⅰ 0.1 g/L),37℃條件下?lián)u床消化30 min；向組織懸液加入少許胎牛血清終止消化后,依次經(jīng)過(guò)70，40 μm孔徑細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾得到細(xì)胞懸液；2 000 r/min離心5 min后,棄上清，加入 Neurobasal-A完全培養(yǎng)基(2% B-27+1%L-Gln+1%抗生素)重懸細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)并稀釋,按每孔1×106個(gè)接種于預(yù)先經(jīng) 0.1 g/L PDL包被液包被的6孔板中，37℃、5% CO2分離培養(yǎng)；24 h后全量換液,同時(shí)加入0.01 mmol/L Ara-C抑制膠質(zhì)細(xì)胞貼壁或生長(zhǎng)，每48 h半量換液1次，體外培養(yǎng)5～7 d，依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)用于后續(xù)研究。

1.3.2RABV感染及鑒定 將培養(yǎng)5～7 d且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代神經(jīng)元細(xì)胞棄去培養(yǎng)基,PBS洗2次；將RABV按MOI=0.1接種于原代神經(jīng)元細(xì)胞,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；棄去病毒液,加入完全培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2中培養(yǎng)48 h；棄上清,PBS洗滌2次,加入4%多聚甲醛固定15 min；去除固定液,使用5% BSA 37℃封閉1 h；PBS洗滌5次，加入PBST稀釋的兔抗MAP2抗體(1∶200),4℃過(guò)夜；PBST洗滌5次，加入PBST稀釋的FITC標(biāo)記的RABV-N蛋白單抗(1∶200)、伊文斯蘭(1∶300),Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔lgG(1∶1 000),37℃溫箱孵育1 h；PBST洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 RABV在小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞中的復(fù)制

1.4.1直接免疫熒光觀察RABV增殖情況 將分離的原代神經(jīng)元細(xì)胞接種于48孔板培養(yǎng)5～7 d,待原代神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),棄去培養(yǎng)基,PBS洗2次；將RABV以MOI=0.1的劑量接種于細(xì)胞,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；棄去病毒液,加入完全培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；接毒后，每隔12 h做1次直免,觀察病毒復(fù)制情況，直至72 h；首先棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔加-20℃預(yù)冷的80%丙酮溶液300 μL/孔,室溫固定30 min；棄去固定液,加入PBST 300 μL/孔,室溫?fù)u床洗滌3次,每次5 min；避光條件下,用PBST將FITC標(biāo)記的RABV-N蛋白單抗200倍稀釋,伊文斯蘭300倍稀釋,按100 μL/孔加入48孔板內(nèi),避光置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；棄去抗體,PBST搖床洗滌3次,每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.2Western blot檢測(cè)RABV-N蛋白的表達(dá) 將RABV以MOI=0.1的劑量接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代神經(jīng)元細(xì)胞,每12 h提取細(xì)胞總蛋白,直至72 h；將原代神經(jīng)元細(xì)胞用RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑)冰上裂解40 min；用細(xì)胞刮刀小心刮取細(xì)胞樣品，14 000×g離心10 min,吸取上清。蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后,電轉(zhuǎn)至NC膜,室溫封閉120 min；加入Bif-1一抗(1∶1 000稀釋),4℃孵育過(guò)夜；PBST洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶20 000稀釋),室溫孵育90 min；PBST洗滌5次，加入顯色液，化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光，回收NC膜,用二蒸水洗滌5 min；使用一、二抗去除液室溫孵育NC膜10 min,PBST洗滌5次；重新封閉,并孵育抗體，其中一抗為β-actin內(nèi)參抗體(1∶10 000稀釋)。

1.4.3染料法熒光定量PCR擴(kuò)增RABV基因組 將RABV以MOI=0.1的劑量接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代神經(jīng)元細(xì)胞,每12 h反復(fù)凍融收取病毒上清液,直至72 h；使用TianGen病毒RNA提取試劑盒提取總RNA；參照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL,RV-N-F(10 μmol/L) 1 μL,RV-N-R(10 μmol/L) 1 μL,cDNA(500 ng)2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。在檢測(cè)樣本的同時(shí)以已知濃度的pcDNA3.1-N質(zhì)粒為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,記錄每個(gè)樣品的Ct值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中,換算成RABV基因組拷貝數(shù),結(jié)果以拷貝數(shù)/500 ng 病毒RNA表示。

1.4.4RABV TCID50測(cè)定 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NA細(xì)胞正常傳代,將細(xì)胞按100 μL/孔鋪至96孔板內(nèi),置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱備用。將待檢的病毒液用含10% FBS的DMEM進(jìn)行10倍倍比稀釋,每個(gè)樣品做4組重復(fù)；將稀釋好的病毒液按50 μL/孔加入96孔板內(nèi),置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加-20℃預(yù)冷的80%丙酮溶液150 μL/孔,室溫固定30 min；棄去固定液,加入PBST 150 μL/孔,室溫?fù)u床洗滌3次,每次5 min；PBST稀釋FITC標(biāo)記的RABV-N蛋白單抗(1∶200)、伊文斯蘭(1∶300),按50 μL/孔加入96孔板內(nèi),避光置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；棄去抗體,PBST洗滌3次,每次5 min；最后一次將PBST拍凈，置于熒光顯微鏡下觀察,用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度,結(jié)果以lg TCID50/mL表示。

1.5 Bif-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)將RABV以MOI=0.1的劑量接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代神經(jīng)元細(xì)胞,每12 h提取細(xì)胞總蛋白,直至72 h；將原代神經(jīng)元細(xì)胞用RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑)冰上裂解40 min；用細(xì)胞刮刀小心刮取細(xì)胞樣品,14 000×g離心10 min,吸取上清。蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后,電轉(zhuǎn)移至NC膜,室溫封閉120 min；加入Bif-1一抗(1∶1 000稀釋),4℃孵育過(guò)夜；PBST洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的抗鼠二抗(1∶20 000稀釋),室溫孵育90 min；PBST洗滌5次，回收NC膜,用二蒸水洗滌5 min；使用一、二抗去除液室溫孵育NC膜10 min,PBST洗滌5次，重新封閉,并重新孵育抗體,其中一抗為β-actin內(nèi)參抗體(1∶10 000稀釋)。

2 結(jié)果

2.1 RABV感染小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞將胎鼠大腦皮質(zhì)分離獲得的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并于2，4，6 d觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)2 d后(圖1A),可見少量細(xì)胞軸突變長(zhǎng),并生長(zhǎng)出許多樹突,且胞體膨大。培養(yǎng)至4 d后(圖1B),膠質(zhì)細(xì)胞脫落,貼壁細(xì)胞軸突增多、伸長(zhǎng),細(xì)胞間開始出現(xiàn)少量連接,逐漸形成神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)6 d后(圖1C),細(xì)胞胞體變大,軸突樹突相互連接,形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),立體感較強(qiáng)。

A.培養(yǎng)2 d;B.培養(yǎng)4 d；C.培養(yǎng)6 d;D.MAP2標(biāo)記的紅色細(xì)胞即為原代神經(jīng)元細(xì)胞；E.FITC標(biāo)記RABV-N蛋白抗體

將RABV按MOI=0.1接種于神經(jīng)元細(xì)胞,并用神經(jīng)元細(xì)胞特異性抗體MAP2進(jìn)行鑒定,觀察病毒感染情況及分布。MAP2標(biāo)記的紅色細(xì)胞即為原代神經(jīng)元細(xì)胞(圖1D)。FITC標(biāo)記的RABV-N蛋白抗體檢測(cè)RABV感染情況及病毒分布，結(jié)果顯示，RABV能夠感染原代神經(jīng)元細(xì)胞,在胞體及軸突均有分布,且神經(jīng)元軸突出現(xiàn)串珠樣神經(jīng)病變(圖1E)。

2.2 RABV在神經(jīng)元細(xì)胞中的復(fù)制將RABV以MOI=0.1的劑量感染原代神經(jīng)元細(xì)胞,經(jīng)熒光顯微鏡觀察,病毒感染12 h后,無(wú)明顯熒光斑點(diǎn)；在24～48 h 熒光斑點(diǎn)逐漸增多、變大,并在48 h達(dá)到較高水平；病毒在60～72 h進(jìn)一步復(fù)制,熒光斑點(diǎn)遍布整個(gè)視野(圖2A)。Western blot結(jié)果顯示,在接毒36 h后,可檢測(cè)出RABVN蛋白條帶,且72 h處灰密度較高(圖2B)；接種病毒后檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞中病毒N蛋白mRNA水平(圖2C)及上清中子代(圖2D)病毒載量,結(jié)果顯示,接毒后24 h細(xì)胞中病毒基因組及子代病毒滴度均逐漸上升,48 h顯著升高。

A.熒光顯微鏡觀察；B.Western blot結(jié)果；C.N蛋白mRNA水平；D.上清中子代病毒載量

2.3 Bif-1蛋白的表達(dá)分析通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)提取的蛋白樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)(圖3A)并對(duì)檢測(cè)條帶進(jìn)行灰度值分析(圖3B)。結(jié)果顯示,RABV感染原代神經(jīng)元細(xì)胞后,隨著RABV的復(fù)制,Bif-1蛋白表達(dá)在病毒感染24 h內(nèi)出現(xiàn)短期上升后,在36 h出現(xiàn)短暫下降后上升,并在48 h處趨于正常水平；在病毒感染60～72 h后Bif-1蛋白及內(nèi)參蛋白均出現(xiàn)明顯降低,且Bif-1蛋白在72 h無(wú)明顯條帶。在病毒感染72 h后,β-actin表達(dá)量降低,該結(jié)果提示，RABV CVS-11株對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞具有較強(qiáng)的神經(jīng)噬性,從而破壞了細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的完整性。

A.Western blot檢測(cè)；B.條帶灰度值分析(#示P>0.05；*示P<0.05，**示P<0.01，***示P< 0.001)

3 討論

RABV屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridaefamily)RABV屬(Lyssavirusgenus),是極具致命性的嗜神經(jīng)性病毒。RABV能夠特異性感染神經(jīng)元并通過(guò)逆行軸突運(yùn)輸在宿主神經(jīng)系統(tǒng)中傳播。SUNDARAMOORTHY等[12]發(fā)現(xiàn)SARM1能夠促進(jìn)狂犬病誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的突觸變性,而這種突觸變性阻礙了RABV在神經(jīng)細(xì)胞間的傳播。AHMAD等[13-14]發(fā)現(xiàn)RABV感染使微管和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白下調(diào),從而破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的完整性,造成神經(jīng)元變性,引起突觸功能障礙,表現(xiàn)出神經(jīng)功能異常。FABER等[15]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)RABV G蛋白使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡程度增加,且凋亡程度直接決定抗體反應(yīng)程度。PULMANAUSAHAKUL等[16]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)細(xì)胞色素C使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡程度增加,降低了RABV的致病性,并增強(qiáng)了抗病毒免疫反應(yīng)。

Bif-1是吞蛋白B蛋白家族(the endophilin protein family)的一員,由基因SH3GLB1編碼產(chǎn)生。研究表明,由于mRNA的選擇性剪接,Bif-1至少存在a、b、c、d、e五種亞型[5]。目前關(guān)于Bif-1a、Bif-1b、Bif-1c三種亞型的研究較多。研究表明,Bif-1是一種促凋亡蛋白[1，4],具有促進(jìn)線粒體分裂的作用[17-18]。TAKAHASHI等[2，18]發(fā)現(xiàn)Bif-1a通過(guò)調(diào)節(jié)PI3KC3信號(hào)通路參與細(xì)胞自噬；過(guò)表達(dá)Bif-1a能夠改變Bax蛋白構(gòu)象,激活Caspase-3蛋白,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。WANG等[5]發(fā)現(xiàn)“神經(jīng)特異性”Bif-1b/c能夠維持線粒體的形態(tài)并促進(jìn)神經(jīng)元的存活；Bif-1b/c與阿爾茨海默病的病理有關(guān),Bif-1b/c缺失能夠?qū)е娄?淀粉樣蛋白沉積、斑塊形成、突觸變性、tau過(guò)度磷酸化；過(guò)表達(dá)Bif-1b/c能夠降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及β-淀粉樣蛋白的毒性,從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活[10]。GAN等[7]發(fā)現(xiàn)Bif-1a在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中具有促凋亡作用；Bif-1b/c具有抵抗由抗癌治療而產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡作用,使轉(zhuǎn)移性前列腺癌向治療性神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌轉(zhuǎn)變。因此,Bif-1a和Bif-1b/c在不同細(xì)胞中的“特異性”使其在癌癥、神經(jīng)性疾病的治療方面極具前景。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,在NA細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)Bif-1c能夠抑制RABV的復(fù)制；過(guò)表達(dá)Bif-1c亞型促進(jìn)RABV(CVS-11株)誘導(dǎo)的不完整自噬流并抵抗其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。但目前尚無(wú)在原代神經(jīng)元細(xì)胞上研究RABV與Bif-1蛋白相互關(guān)系的報(bào)道。因此本試驗(yàn)建立了RABV CVS-11株感染小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞模型，經(jīng)Western blot檢測(cè),RABV感染原代神經(jīng)元細(xì)胞后,Bif-1蛋白水平表達(dá)有所變化,推測(cè)在原代神經(jīng)元細(xì)胞中,Bif-1可能參與了RABV的感染過(guò)程。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RABV感染使神經(jīng)細(xì)胞GAPDH、β-actin、β-tubulin的表達(dá)降低,該結(jié)果提示RABV感染破壞了神經(jīng)元細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的完整性,與相關(guān)研究報(bào)道[13-14，20-21]結(jié)果相似。下一步將通過(guò)Bif-1蛋白的過(guò)表達(dá)及基因敲除探索Bif-1對(duì)RABV復(fù)制的影響,為RABV致病機(jī)制和救治藥物研究奠定基礎(chǔ)。