脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體的制備及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立

孫亞寧，李青梅，楊蘇珍，胡驍飛，楊繼飛，張穎碩，陳琳琳，邢云瑞，鄧瑞廣，張改平,2*

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)，是一種主要由曲霉、青霉及鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族真菌毒素，在大麥、玉米、小麥、燕麥、黑麥等谷物、谷物制品及飼料中廣泛存在[1-2]，主要與小麥赤霉病和玉米穗腐病的發(fā)生有關(guān)，在我國長(zhǎng)江、淮河、黃河等流域呈現(xiàn)多發(fā)態(tài)勢(shì)[3]，普通的加工和烹飪對(duì)其濃度沒有顯著影響[4]。DON的毒害作用主要干擾蛋白質(zhì)和DNA的合成[5]，引起動(dòng)物厭食癥、嘔吐、肌肉及腸出血、細(xì)胞毒性和免疫毒性等[6]，且與黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素有協(xié)同毒性[7]，嚴(yán)重危害動(dòng)物[8]和人類身體健康，影響我國農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及食品安全的健康發(fā)展。很多國家對(duì)DON制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)谷物及其制品中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)為不大于1 000 μg/kg[9]。能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)DON污染，是控制其危害的最有效手段。DON常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法、高效液相色譜等大型儀器法及免疫學(xué)快速檢測(cè)方法等。薄層色譜法[10]主要用于快速定性檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度較低；高效液相色譜等[11]大型儀器法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，為我國國標(biāo)規(guī)定的仲裁法，但耗時(shí)較長(zhǎng)且價(jià)格昂貴，不適合快速篩查；免疫學(xué)快速檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)[12]、免疫層析法[13]、免疫傳感器法[14]等，由于具有快速、靈敏、特異、穩(wěn)定、特別是操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，已經(jīng)普遍應(yīng)用于真菌毒素的快速檢測(cè)中[15-16]。建立DON免疫學(xué)快速檢測(cè)方法，制備敏感、特異的DON單克隆抗體是關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過N,N′-羰基二咪唑法制備人工抗原，優(yōu)化免疫程序，通過單克隆抗體技術(shù)，控制關(guān)鍵點(diǎn)，制備靈敏、特異的單克隆抗體，并初步建立DON ELISA快速檢測(cè)方法，為DON免疫學(xué)快速檢測(cè)新技術(shù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑DON、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON)、黃曲霉毒素B1，青島普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，美國Amresco公司；雞卵清蛋白(OVA)，日本W(wǎng)ako公司；玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A(OTA)、伏馬菌素(FB1)、小鼠單抗亞型檢測(cè)試劑盒，美國Sigma公司；N,N′-羰基二咪唑，美國Aldrich公司；無水四氫呋喃，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640、選擇培養(yǎng)基HAT、HT、PEG-1500，美國Invitrogen公司；羊抗鼠酶標(biāo)二抗(GAM-IgG-HRP)，美國Jackson公司；試驗(yàn)用水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；NaOH等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備3K-18高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；Bio-Rad-550型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司；HI9321酸度計(jì)，美國Hanna公司；超凈工作臺(tái)，美國Forma Scientific公司；AE260電子天平，德國Mettler公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；PURELAB Classic UVF超純水儀，英國ELGA LabWater公司；93-3定時(shí)恒溫雙向磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)8周齡雌性BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)；小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.4 人工抗原的制備及鑒定分析DON分子結(jié)構(gòu)(圖1)，選擇CDI法利用羥基偶聯(lián)蛋白制備人工抗原。稱取1.8 mg DON，加入400 μL無水四氫呋喃溶解，然后加入18 mg CDI，70℃控溫回流加熱至完全溶解；室溫反應(yīng)1 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，產(chǎn)物用100 μL 二甲基甲酰胺(DMF)溶解。稱取7 mg BSA溶解于500 μL PBS中，緩慢加入上述溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h，PBS流動(dòng)透析72 h，4℃、5 000 r/min離心10 min，去沉淀，上清液即為DON-BSA，-20℃保存?zhèn)溆茫ê铣蒁ON-OVA。參照文獻(xiàn)[17]紫外掃描法鑒定人工抗原。

圖1 DON的分子結(jié)構(gòu)圖

1.5 動(dòng)物免疫及融合備用鼠篩選取SPF級(jí)8周齡雌性BALB/c小鼠3只，采用皮下多點(diǎn)注射法免疫人工抗原DON-BSA，共免疫4次，免疫劑量為50 μg/只 200 μL，免疫間隔3周。首次免疫選用FCA與無菌PBS配制的人工抗原等量混合，乳化，后3次免疫佐劑改用FIA。4免1周后，小鼠斷尾采血，選用PBS 1∶100稀釋。用CBS稀釋包被原DON-OVA 為2 mg/L，50 μL/孔包被，37℃溫育2 h，PBST洗板4次(下同)；用5%豬血清PBST封閉，200 μL/孔，37℃溫育1 h，洗板；晾干密封后于4℃避光保存。間接ELISA鑒定小鼠多抗血清(pAb)中DON抗體的效價(jià)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗體對(duì)DON的靈敏度。

1.5.1pAb效價(jià)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18]間接ELISA方法測(cè)定pAb效價(jià)，加樣體積為100 μL/孔。取DON-OVA包被的酶標(biāo)板，用5%豬血清PBST鋪底，第1孔加1∶100倍pAb，倍比稀釋至第7孔，設(shè)陰性對(duì)照(NC)，37℃溫育15 min，洗板；加GAM-IgG-HRP(1∶1 000倍用5%豬血清PBST稀釋)，37℃溫育30 min，洗板；加TMB顯色液室溫避光顯色5 min；2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取D450值；以待測(cè)孔D450值≥陰性對(duì)照D450值的2.1倍(P/N≥2.1)，判為陽性。

1.5.2pAb敏感性鑒定 參照文獻(xiàn)[18]間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法鑒定其敏感性，加樣體積為100 μL/孔。取DON-OVA包被的酶標(biāo)板，加D450值為1.3左右的小鼠血清和DON標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量濃度為10.00,5.00,2.50,1.25,0.63,0.31,0.00 μg/L)作抑制劑，設(shè)陰性對(duì)照，37℃溫育15 min，洗板；加GAM-IgG-HRP(1∶1 000倍用5%豬血清PBST稀釋)，37℃溫育30 min，洗板；加TMB顯色液顯色5 min；2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取D450值；計(jì)算抑制率(B/B0，B0為DON標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)D值，B為DON標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的D值),評(píng)價(jià)多抗血清靈敏度。

分析多抗血清ELISA檢測(cè)結(jié)果，增加第5次免疫，并檢測(cè)小鼠血清DON抗體效價(jià)及靈敏度，確定融合備用鼠。5免3周后對(duì)融合備用鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取免疫原DON-BSA無菌PBS稀釋，免疫劑量為50 μg/只 200 μL，腹腔注射。免疫1周后小鼠斷尾采血，評(píng)價(jià)血清效價(jià)及靈敏度方法同上，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1×104及以上時(shí)安排細(xì)胞融合。

1.6 單克隆抗體制備確定融合備用鼠后準(zhǔn)備細(xì)胞融合。首先進(jìn)行SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇及擴(kuò)大培養(yǎng)，選用 RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)；細(xì)胞融合前3 d，再次對(duì)融合備用鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫方法及計(jì)量同1.5。融合前1～2 d制備小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞；小鼠加強(qiáng)免疫后3～4 d，摘眼球分離陽性血清，脫頸致死小鼠。參照文獻(xiàn)[18]方法，選用50% PEG-1500為融合劑進(jìn)行細(xì)胞融合；融合后用HAT培養(yǎng)基重懸，50 μL/孔 加入到提前準(zhǔn)備的96孔飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板上，共鋪設(shè)5板，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d左右半量換液，7～10 d 取上清液進(jìn)行陽性篩選。

陽性雜交瘤細(xì)胞株選用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選，用PBS將細(xì)胞上清1∶4倍稀釋進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，選取D450≥1.0的孔為陽性孔；然后對(duì)陽性孔細(xì)胞上清進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，選取靈敏度較好的孔轉(zhuǎn)孔擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)2～3次亞克隆后，篩選效價(jià)高、靈敏度好、生長(zhǎng)旺盛的雜交瘤細(xì)胞株為DON單克隆細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

選用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)DON單克隆抗體(mAb)[20]，用辛酸/飽和硫酸銨法純化mAb[21]。

1.7 單克隆抗體免疫學(xué)性質(zhì)鑒定及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法建立

1.7.1單克隆抗體亞型鑒定 用小鼠單抗亞型檢測(cè)試劑盒對(duì)DON單克隆抗體亞型進(jìn)行鑒定[19]。

1.7.2單克隆抗體效價(jià)及靈敏度鑒定 鑒定DON單克隆抗體的效價(jià)和靈敏度首先應(yīng)優(yōu)化ELISA檢測(cè)方法的包被質(zhì)量濃度，不同的包被質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出單克隆抗體的免疫學(xué)性質(zhì)不同。選擇包被原DON-OVA分別以6.00,3.00,1.50,0.75,0.40,0.20 mg/L的量包被酶標(biāo)板，分別測(cè)定不同包被質(zhì)量濃度下抗體效價(jià)，選擇D450值在1.3左右的孔對(duì)應(yīng)的抗體濃度作為抗體稀釋濃度，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(方法同1.5)檢測(cè)抗體對(duì)DON的靈敏度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IC50。選擇靈敏度最佳的抗原包被質(zhì)量濃度為該ELISA檢測(cè)方法的包被質(zhì)量濃度，抗體濃度為該ELISA檢測(cè)方法的抗體工作濃度，該包被質(zhì)量濃度下相對(duì)應(yīng)的抗體效價(jià)為DON單克隆抗體效價(jià)，包被質(zhì)量濃度下測(cè)定的抗體靈敏度為DON單克隆抗體的靈敏度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍(以抗體對(duì)DON的20%～80%抑制濃度范圍評(píng)價(jià)即IC20～I(xiàn)C80)[22]。

1.7.3單克隆抗體親和力的測(cè)定 選用BATTY等[23]建立的方法測(cè)定DON mAb親和常數(shù)(Ka)。選擇包被原DON-OVA 1.50，0.75 mg/L的質(zhì)量濃度分別包被酶標(biāo)板并用間接ELISA測(cè)定mAb效價(jià)，以mAb濃度為橫坐標(biāo)，D450值為縱坐標(biāo)，繪制間接ELISA反應(yīng)曲線，按照公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)，其中n=[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t為2個(gè)不同的包被原質(zhì)量濃度，[Ab]t、[Ab′]t為各包被原質(zhì)量濃度下50%D450值對(duì)應(yīng)的抗體濃度[24]。

1.7.4單克隆抗體特異性鑒定 選取DON的結(jié)構(gòu)類似物3-AcDON和15-AcDON，以及其他的真菌毒素AFB1、OTA、ZEN、FB1作為交叉反應(yīng)靶標(biāo)物，各靶標(biāo)物用甲醇配置成1 g/L的母液，PBS稀釋為所需質(zhì)量濃度。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗體靈敏度，計(jì)算各靶標(biāo)物IC50，根據(jù)公式CR=IC50/IC50′×100%計(jì)算各靶標(biāo)物交叉反應(yīng)率，其中IC50為抗體對(duì)DON的靈敏度，IC50′為抗體對(duì)各交叉反應(yīng)靶標(biāo)物的靈敏度[25]。

1.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)選用PBS配置DON標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L，取陰性小麥樣品5份，粉碎后加入DON標(biāo)準(zhǔn)品，配置DON含量為1 000 μg/kg的小麥陽性樣品(國標(biāo)限量)。小麥陽性樣品各取1 g/份于5 mL離心管中，加入2 mL PBS充分振蕩提取15 min，10 000 r/min離心3 min，上清液用PBS稀釋10倍后按照間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3次求取平均值計(jì)算小麥樣品中所含DON濃度，根據(jù)公式計(jì)算添加回收率(%)=檢測(cè)靶標(biāo)物濃度/添加靶標(biāo)物濃度×100%，回收率在100%±20%范圍內(nèi)，變異系數(shù)(CV)小于15%，認(rèn)為該檢測(cè)方法準(zhǔn)確率高、穩(wěn)定性好。

2 結(jié)果

2.1 人工抗原鑒定紫外掃描法鑒定人工抗原DON-BSA及DON-OVA，結(jié)果見圖2，與偶聯(lián)后的人工抗原紫外吸收曲線相比BSA蛋白紫外吸收曲線有所改變，偶聯(lián)后吸收峰具備了DON在220 nm處吸收峰的特點(diǎn)，而且在240～280 nm的吸收峰也有所增加，從而初步斷定DON人工抗原偶聯(lián)成功。

圖2 人工抗原紫外掃描圖譜

2.2 小鼠多抗血清測(cè)定間接ELISA法檢測(cè)小鼠多抗血清效價(jià)結(jié)果見表1，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)小鼠血清對(duì)DON靈敏度結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，4免1周后3只小鼠均產(chǎn)生了針對(duì)DON的抗體，從而說明DON人工抗原制備成功。但3只小鼠效價(jià)均不高，1號(hào)鼠效價(jià)最高也僅有1∶3 200，若此時(shí)融合成功概率較小，為提高融合效率對(duì)小鼠進(jìn)行5免，方法及劑量同4免。5免1周后采血鑒定血清效價(jià)及靈敏度，結(jié)果見表1，2，結(jié)果小鼠5免后抗體水平及抗體靈敏度均沒有明顯變化。3只小鼠中1號(hào)小鼠效價(jià)較高，抗體針對(duì)DON靈敏度較好，選擇1號(hào)小鼠進(jìn)行免疫嘗試。將1號(hào)小鼠采用腹腔注射的方法加強(qiáng)免疫，1周后采血檢測(cè)血清效價(jià)及靈敏度，結(jié)果見表1，結(jié)果小鼠血清效價(jià)提升至1∶104，滿足細(xì)胞融合條件，但抗體靈敏度無明顯變化。小鼠腹腔免疫1個(gè)月后進(jìn)行再次腹腔免疫，3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合，小鼠摘眼球采血收集血清檢測(cè)效價(jià)，結(jié)果顯示效價(jià)再次提高1個(gè)梯度。

表1 間接ELISA測(cè)定血清效價(jià) D450值

表2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定血清靈敏度 D450值

2.3 單克隆抗體的制備

2.3.1雜交瘤細(xì)胞株篩選 細(xì)胞融合9 d后進(jìn)行陽性孔篩選，間接ELISA檢測(cè)1∶4倍PBS稀釋的細(xì)胞上清，篩選D450值大于1.0的孔23孔，對(duì)23孔進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，獲得陽性孔13孔。將陽性孔擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)3次亞克隆后獲得2A3-E11單克隆細(xì)胞1株，經(jīng)多次傳代，該細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌DON單克隆抗體。

2.3.2單克隆抗體的制備 選用體內(nèi)誘生腹水法制備DON單克隆抗體，注射小鼠3只，收獲腹水約10 mL。辛酸/硫酸銨法純化，PBS透析，-40℃凍存。

2.4 單克隆抗體免疫學(xué)性質(zhì)鑒定

2.4.1單克隆抗體亞型鑒定 用小鼠單抗亞型檢測(cè)試劑盒對(duì)DON單克隆抗體亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示DON 2A3-E11株單克隆抗體為IgG1型。

2.4.2單克隆抗體效價(jià)及靈敏度測(cè)定 分別用6.00,3.00,1.50,0.75,0.40,0.20 mg/L的包被原DON-OVA包被酶標(biāo)板，不同包被質(zhì)量濃度下DON單克隆抗體效價(jià)結(jié)果見表3，不同包被質(zhì)量濃度下DON單抗靈敏度檢測(cè)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)包被質(zhì)量濃度為0.20，0.40 mg/L 時(shí)抗體靈敏度最好，但0.20 mg/L包被時(shí)抗體效價(jià)偏低，故選擇0.40 mg/L 為最佳包被質(zhì)量濃度。該質(zhì)量濃度下DON單克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶1 024 000；一抗工作濃度為45 000倍稀釋。

表3 不同酶標(biāo)板包被質(zhì)量濃度下DON單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果 D450值

圖3 不同包被質(zhì)量濃度下DON單克隆抗體靈敏度

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)DON單克隆抗體靈敏度結(jié)果見圖4，以DON標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=-0.454 7x+1.105 0，回歸系數(shù)R2=0.990 7，根據(jù)回歸方程計(jì)算IC50為21.507 9 μg/L，檢測(cè)范圍為4.696 8～98.490 0 μg/L。

圖4 DON單克隆抗體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.3單克隆抗體親和力鑒定 DON單克隆抗體親和力測(cè)定結(jié)果見圖5，經(jīng)計(jì)算[Ab]t、[Ab′]t分別為3.16×10-10,8.044×10-11mol/L，親和常數(shù)為9.064×108mol/L，說明本試驗(yàn)制備的DON單克隆抗體具有很好的親和力。

圖5 DON單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定曲線

2.4.4單克隆抗體特異性鑒定 DON單克隆抗體特異性結(jié)果見表4。結(jié)果獲得的單克隆抗體與15-AcDON有233.70%的交叉反應(yīng)，與3-AcDON及其他常見的真菌毒素?zé)o明顯交叉反應(yīng)，說明制備的DON單克隆抗體具有很好的特異性。

表4 DON單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)DON間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表5，檢測(cè)小麥樣品5份，添加回收率為90.509%～116.016%，平均值為103.989%；CV為3.081%～7.928%，平均值為5.633%，說明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確率高、結(jié)果可靠。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

DON屬于真菌毒素，其相對(duì)分子質(zhì)量為296.32屬于小分子抗原，只具有反應(yīng)原性，無免疫原性，因此稱為半抗原。獲得半抗原的單克隆抗體首先需要將小分子與大分子的蛋白質(zhì)依靠化學(xué)鍵連接在一起形成人工抗原，制備的人工抗原既包含小分子的結(jié)構(gòu)，又具有免疫原性。CDI是咪唑的衍生物，能與氨、醇、酸等官能團(tuán)反應(yīng)，且具有高度的選擇性[26]。本研究將DON與常用的載體蛋白BSA和OVA利用CDI法僅一步進(jìn)行偶聯(lián)，避免了改造過程中的副反應(yīng)影響[27]，偶聯(lián)過程簡(jiǎn)單高效，經(jīng)鑒定成功制備了DON的人工抗原，且具有很好的免疫原性及反應(yīng)原性。由于CDI遇水分解，因此人工抗原制備過程中水的存在對(duì)偶聯(lián)影響較大，應(yīng)注意試劑及環(huán)境中水份的控制。

本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的弗氏佐劑與DON人工抗原乳化后進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射法免疫小鼠，經(jīng)過4次免疫后抗體效價(jià)偏低，如果繼續(xù)融合可能會(huì)導(dǎo)致融合失敗，因此進(jìn)行了第5次常規(guī)免疫，但抗體水平?jīng)]有明顯提升。因皮下注射抗原緩慢釋放形成持久刺激，同樣劑量和手段進(jìn)行再次免疫不能對(duì)免疫細(xì)胞形成刺激提高效價(jià)。有資料顯示腹腔注射在短時(shí)間內(nèi)大量注入抗原會(huì)刺激B淋巴細(xì)胞迅速增殖產(chǎn)生大量抗體使多抗血清效價(jià)升高[28]，因此為了提高小鼠抗體效價(jià)，提高融合成功率，本試驗(yàn)嘗試腹腔無佐劑注射來提高小鼠抗體效價(jià)。經(jīng)2次腹腔免疫后多抗血清效價(jià)提高了3～4個(gè)梯度獲得了較好的結(jié)果，為單克隆抗體制備過程中小鼠效價(jià)低的問題提供了較好的解決途徑，對(duì)單克隆抗體制備方法的改進(jìn)及完善具有重要的意義。

近年來，很多國內(nèi)學(xué)者制備DON單克隆抗體，曹娟[29]制備的DON單克隆抗體IC50為1.05 mg/L；張勛[30]制備的DON單克隆抗體IC50為31.6 μg/L；張榮升[31]制備的DON單克隆抗體IC50為119.4 μg/L。本試驗(yàn)制備的DON單克隆抗體對(duì)DON的IC50為21.501 9 μg/L，靈敏度有了較大地提升。本試驗(yàn)免疫小鼠的多抗血清對(duì)DON的IC50約為1 mg/L，而經(jīng)過雜交瘤細(xì)胞的篩選后，獲得的靈敏度提高了約50倍，結(jié)果表明，多克隆抗體的靈敏度較差時(shí)也有可能篩選出靈敏度較好的單克隆抗體，本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)單克隆抗體的篩選過程具有一定的參考價(jià)值。

DON有兩種乙酰化結(jié)構(gòu)類似物3-AcDON和15-AcDON，可以通過抗體與兩種結(jié)構(gòu)類似物的反應(yīng)推測(cè)單抗的抗原結(jié)合位點(diǎn)。張榮升[31]用琥珀酸酐法制備的人工抗原3-HS-BSA免疫小鼠制備的DON抗體與3-AcDON有很好的反應(yīng)性，而與15-AcDON未見明顯反應(yīng)。本試驗(yàn)制備的DON單克隆抗體與15-AcDON有233.70%的交叉反應(yīng)，則可印證本試驗(yàn)改造的可能是DON上C15位羥基，因此人工抗原與15-AcDON結(jié)構(gòu)更為相似，制備的抗體與15-AcDON有更好的靈敏度；而與3-AcDON未見明顯交叉反應(yīng)，說明制備的抗體可以有效識(shí)別C3位置上的羥基，這個(gè)基團(tuán)為DON的主要致毒基團(tuán)[32]，因此本試驗(yàn)制備的抗體可以較好地識(shí)別具有毒性的DON結(jié)構(gòu)，當(dāng)DON上C3位羥基發(fā)生改變后抗體與它的反應(yīng)能力下降或不再反應(yīng)，因此該抗體在DON脫毒等領(lǐng)域也將有廣泛的應(yīng)用[33]。

本試驗(yàn)采用CDI一步法將DON與載體蛋白偶聯(lián)成功制備了人工抗原，并研究了不同的免疫方式對(duì)小鼠多抗血清效價(jià)的影響，發(fā)現(xiàn)了可以在免疫后期提高小鼠多克隆抗體效價(jià)的有效免疫手段。通過單克隆抗體技術(shù)獲得對(duì)DON特異、敏感、親和力高的單克隆抗體細(xì)胞1株，該細(xì)胞株分泌的抗體與之前報(bào)道的DON單克隆抗體相比具有較高的靈敏度(IC50為21.507 9 μg/L)，且可以有效識(shí)別DON的主要致毒基團(tuán)C3位置上的羥基?；谠摽贵w建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)范圍為4.696 8～98.490 0 μg/L，可以實(shí)現(xiàn)DON的痕量檢測(cè)；小麥樣品中加標(biāo)回收試驗(yàn)證明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確率高、結(jié)果可靠，可進(jìn)一步應(yīng)用于小麥等谷物樣品中DON污染的檢測(cè)，為DON脫毒研究及免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。