致細(xì)胞病變型新疆BVDV基因2型毒株的分離鑒定及其致病性

李 禎，郭妍婷，陳俊貞，胡新艷，趙新艷，董文麗，賀淵秀，王萬順，李澤宇，姚 剛，冉多良，付 強(qiáng)，史慧君

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)，簡稱牛病毒性腹瀉病，是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的接觸性傳染病，感染動物常表現(xiàn)出高熱、腹瀉、白細(xì)胞減少、免疫抑制、黏膜充血等臨床癥狀，還能引起奶牛產(chǎn)奶量下降、孕牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及牛的持續(xù)性感染[1-3]。BVDV可通過血液、排泄物等多種途徑水平傳播，感染BVDV的牛發(fā)病率高、病死率低，牛群中相當(dāng)一部分是BVDV的攜帶者。BVDV還可垂直傳播，感染孕牛產(chǎn)下的犢牛終身帶毒，持續(xù)排毒，是重要傳染源，同時也是生物制品、血清、凍精的主要污染源，對養(yǎng)牛業(yè)危害極大[4]。

BVDV毒株有2種生物型，分別為非致細(xì)胞病變(non cytopathic,NCP)生物型和致細(xì)胞病變(cytopathic,CP)生物型[5]。CP型BVDV接種細(xì)胞可使細(xì)胞出現(xiàn)病變，具體表現(xiàn)為細(xì)胞聚集、拉網(wǎng)、空泡、核固縮等現(xiàn)象。BVDV 5′UTR的核苷酸序列呈高度保守性，常利用其核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物，以此對BVDV進(jìn)行檢測和分型鑒定。

本試驗(yàn)在分離BVDV新疆地方株的基礎(chǔ)上，對5′UTR基因進(jìn)行克隆與序列分析，從而了解BVDV新疆株基因型及致病性，為疫病的診斷及致病機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、病毒株及樣品MDBK細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；BVDV-TC新疆塔城分離株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院冉多良教授惠贈[6]；樣品為新疆博樂地區(qū)某養(yǎng)牛場出現(xiàn)腹瀉癥狀的病牛新鮮糞便樣品，-80℃保存。

1.2 主要試劑及儀器馬血清HS、Trypsin及高糖DMEM、青-鏈抗生素均購自BI試劑公司；TRIzol購自Invitrogen公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖、0.33%中性紅染液購自Sigma公司；Anti-dsRNA mAB J2(10010200)購自美國SCICONS公司；抗熒光淬滅PVP封片液購自Beytime公司；0.2%磷鎢酸購自Hitachi公司；超濾離心管(100 kDa)、0.45 μm濾器購自Merck Millipore公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(CW2569M)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Eppendorf，Glaxy 170R)、PCR儀(BIO-RAD，C1000)、照膠儀(BIO-RAD，721BR11152)、激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，LSM 510)和透射電子顯微鏡(Hitachi，HT7700)。

1.3 RT-PCR鑒定將糞便樣本加入3倍體積的PBS振蕩混勻，4℃離心10 min；取500 μL上清液加入TRIzol 500 μL，充分混勻，加入200 μL氯仿，離心15 min；轉(zhuǎn)移上層液相至新的離心管，加入等體積異丙醇，4℃離心10 min后棄上清；加入75%乙醇 500 μL，4℃離心10 min后棄上清，室溫干燥5 min；加入20 μL RNase-free水，反轉(zhuǎn)錄后-80℃長期保存。反轉(zhuǎn)錄步驟參照康為世紀(jì)反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

參照文獻(xiàn)[7]及Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)BVDV檢測通用引物5′UTR(F：5′-CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′；R：5′-GGAACTCCA-TGTGCCATGTACA-3′)由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。RT-PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

1.4 病毒的傳代將病毒處理液接種至80%～90%單層MDBK細(xì)胞，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；接毒后24，36，48，72 h觀察細(xì)胞病變情況，收集上清液，-80℃保存。

1.5 蝕斑純化試驗(yàn)使用DMEM對病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋,將稀釋液接種于單層MDBK細(xì)胞中；將無菌的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2% HS DMEM培養(yǎng)液按照體積比1∶1比例混勻后加入到細(xì)胞和病毒中，厚度約為2 mm,待凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞出現(xiàn)病變，用0.001%的中性紅染色，肉眼可見明顯的蝕斑；選擇清晰的單個蝕斑重培養(yǎng)，RT-PCR鑒定后進(jìn)行下一輪的蝕斑純化，如此反復(fù)操作5次后得到純化的病毒。

1.6 病毒的毒力測定取相同TCID50的純化病毒和BVDV TC株，分別進(jìn)行10-1～10-8梯度稀釋后接種至80%單層MDBK細(xì)胞中，設(shè)立陰性對照組；分別于病毒感染后12，24，36 h收取細(xì)胞和病毒液，反復(fù)凍融3次后測定病毒滴度(方法同上)，逐日觀察5 d，記錄每個稀釋度出現(xiàn)病變的孔數(shù),按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.7 理化性質(zhì)鑒定為了測定分離毒株對乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸性條件、堿性條件、溫度、紫外線的敏感程度，分別使用20%乙醚、20%氯仿、0.25%胰蛋白酶、pH 3.0酸性條件、pH 10.0堿性條件、溫度條件(56℃作用30 min)、紫外線對分離毒株進(jìn)行處理，依照上述方法測定病毒滴度。

1.8 免疫熒光試驗(yàn)將純化病毒接種至MDBK細(xì)胞(設(shè)立陰性對照)，待細(xì)胞病變后用4%多聚甲醛固定；用BVDV p7蛋白免疫血清(稀釋比例1∶50)和Anti-dsRNA RNA antibody(稀釋比例1∶1 200 4℃孵育過夜，熒光二抗標(biāo)記驢抗鼠IgG(H+L)常溫孵育，PI核染，抗熒光淬滅PVP封片液封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.9 透射電鏡試驗(yàn)將濃縮病毒液滴在200目碳支持膜銅網(wǎng)上，靜置3～5 min，2%磷鎢酸負(fù)染3次，2～3 min/次，室溫干燥后透射電子顯微鏡下觀察。

1.10 病毒核苷酸分析BVDV 5′UTR基因擴(kuò)增的方法同上。用DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其與克隆載體pMD19-T在4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至氨芐青霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～16 h后使用PCR鑒定單克隆菌落，將陽性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的BVDV基因序列進(jìn)行Blast比對分析，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.11 小鼠致病性試驗(yàn)選取4～5月齡健康BALB/c小鼠6只，隨機(jī)分成對照組和試驗(yàn)組2個組別；試驗(yàn)組通過尾靜脈注射108IU/mL病毒液，對照組通過尾靜脈注射等體積的DMEM；每隔2 d注射1次，共注射5次后取小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及十二指腸等組織，制備病理切片，觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 BVDV 5′UTR擴(kuò)增RT-PCR擴(kuò)增BVDV 5′UTR基因片段，檢測腹瀉牛的糞便樣本,結(jié)果1號樣本的PCR產(chǎn)物約為267 bp，表明該樣本為BVDV陽性(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker；1～4.不同的樣品；5.BVDV-TC株；6.陰性對照

2.2 病毒的分離培養(yǎng)將盲傳15代的分離病毒株接種于MDBK細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)，設(shè)立陰性對照組和BVDV-TC株陽性對照組；分別于病毒接種后12，24，36 h時觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒接種24 h時，MDBK細(xì)胞出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為皺縮、變圓、碎裂、脫落、聚集后產(chǎn)生合胞體和巨細(xì)胞等現(xiàn)象(圖2)，表明BVDV-BL314株為CP型。

圖2 正常細(xì)胞及感染病毒后細(xì)胞形態(tài)(20×)

2.3 病毒的蝕斑純化以低熔點(diǎn)瓊脂糖作為覆蓋物，使用蝕斑方法對分離的病毒進(jìn)行純化。經(jīng)過中性紅染色后低熔點(diǎn)瓊脂糖上可見透明或乳白色的病毒蝕斑(圖3)；挑取單個蝕斑接種到正常的MDBK細(xì)胞上增殖，經(jīng)RT-PCR鑒定呈陽性(圖4)。

圖3 病毒蝕斑

M.DL2000 DNA Marker；1～6.不同的病毒蝕斑；7.BVDV-TC株；8.陰性對照

2.4 病毒毒力測定使用Reed-Muench方法測定BL314分離株和BDVD-TC株的病毒毒力。病毒感染后24 h，BL314分離株病毒滴度顯著性高于BVDV-TC株(*示P<0.05，**示P<0.01)，表明BL314分離株的毒力強(qiáng)于BVDV-TC株(圖5)。

注：*P<0.05；**P<0.01。下同

2.5 理化性質(zhì)鑒定結(jié)果分別使用乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸/堿性條件、高溫條件、紫外線等處理病毒并測定其滴度變化。乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸、堿、高溫、紫外線處理后病毒滴度顯著性降低(**示P<0.01)，表明分離毒株對乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑敏感，對胰蛋白酶敏感，56℃作用30 min病毒毒力降低，紫外線照射30 min可使其失活(表1，圖6)。

圖6 不同條件處理后病毒滴度測定

表1 病毒理化特性結(jié)果

2.6 免疫熒光試驗(yàn)接種分離毒株感染單層MDBK細(xì)胞(設(shè)立陰性對照)，分別使用BVDV p7蛋白免疫血清和Anti-dsRNA 4℃孵育過夜，驢抗鼠熒光二抗常溫孵育后，胞漿中可見綠色熒光，PI核染為紅色熒光(圖7)。

圖7 BVDV-BL314免疫熒光鑒定(200×)

2.7 免疫透射電鏡試驗(yàn)病毒吸附銅網(wǎng)后經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染，置于透射電鏡下觀察，可見直徑為40～60 nm的球形、外被囊膜的病毒顆粒(黑色箭頭所指)(圖8)。

圖8 BL314分離株形態(tài)的電鏡觀察結(jié)果

2.8 BVDV 5′UTR基因克隆與序列分析擴(kuò)增BVDV 5′UTR基因片段，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物約為267 bp(圖9)。根據(jù)分離株5′UTR基因部分區(qū)域與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的BVDV基因序列進(jìn)行Blast分析，建立遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，該分離株與BVDV-2a型125c株的遺傳距離較近(圖10)，因此BL314分離株為BVDV-2a基因亞型。

M.DL2000 DNA Marker；1.BL314；2.陰性對照

圖10 BVDV-BL314分離株與其他BVDV株的5′UTR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.9 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果將病毒尾靜脈注射BALB/c小鼠5次后，取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及十二指腸，觀察其病理變化。結(jié)果顯示，脾臟、肺臟和心臟不同程度腫大，有散在的出血點(diǎn)，質(zhì)地變脆，邊緣鈍圓，無光澤；肺臟水腫，表面有出血斑點(diǎn)；心臟心肌肥大，血管不明顯，心包和心外膜有纖維性肥厚和渾濁，心肌纖維變性、壞死；腎臟邊緣變脆、趨向于透明(圖11)。取部分病變組織制作石蠟切片，HE染色后觀察其病理變化。結(jié)果顯示，脾臟、肺臟和十二指腸病變較明顯，脾臟紅髓部分出血嚴(yán)重；肺臟肺泡擴(kuò)張，肺泡壁增厚且有明顯的出血；小腸絨毛代償性變寬，腸絨毛上皮細(xì)胞由單層變?yōu)槎鄬?，隱窩形態(tài)發(fā)生變化；心臟和肝臟血管周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤，肝臟血管內(nèi)有淤血，少量肝細(xì)胞壞死；腎皮質(zhì)、腎小管周圍有少量出血，腎盂萎縮(圖12)。

圖11 組織解剖檢測結(jié)果

圖12 病理組織切片檢測結(jié)果

3 討論

1946年，OLAFSON等[8]在美國紐約州發(fā)現(xiàn)一種發(fā)病率高而死亡率低，以發(fā)熱、腹瀉和咳嗽為特征的牛傳染性疾病，稱之為BVD/MD。目前，該病廣泛分布于美國、英國、新西蘭、中國、澳大利亞等大型畜牧業(yè)國家。BVDV可以感染野生反芻動物，如綿羊、肉牛、奶牛和鹿，可以從病畜的血液、內(nèi)臟、腸淋巴結(jié)組織或呼吸道、乳汁、精液中分離出病毒，給世界養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。2016-2018年，泰國北部、土耳其卡爾斯地區(qū)、愛爾蘭地區(qū)和巴西東北部的帕拉伊巴州BVDV陽性檢出率為62.5%～100.0%[10-13]。2018年世界BVDV流行病學(xué)調(diào)研結(jié)果顯示，我國動物水平的抗體陽性率為60%～80%，畜群水平抗體陽性率為20%～40%[14]?；贐VDV 5′UTR序列的高度保守性，可以將其分成BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3這3個基因型，它們之間的抗原性和遺傳性差異較大[15]。BVDV-2型主要包括BVDV-2a、BVDV-2b、BVDV-2c、BVDV-2d四種亞型，流行區(qū)域主要包括江蘇省、山東省、河南省、青海省、陜西省、新疆維吾爾自治區(qū)等地區(qū)[16-18]。根據(jù)研究顯示BVDV-2致病性更強(qiáng)、致動物死亡率更高[19]。新疆是我國的畜牧大省，研究表明該病已在新疆廣泛存在。通過對新疆地區(qū)BVDV抗體和抗原的檢測及流行病學(xué)調(diào)查，最高抗體陽性率平均在90%以上，嚴(yán)重阻礙了新疆養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，給農(nóng)牧民帶來了不同程度的經(jīng)濟(jì)損失[20]。

本研究從腹瀉牛糞便中分離純化到BVDV-BL314分離株，分離病毒株接種于MDBK細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)，可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、碎裂、脫落、產(chǎn)生合胞體等病變。免疫熒光抗原(綠色熒光)主要分布于細(xì)胞漿中，而未接種病毒的MDBK正常細(xì)胞無熒光出現(xiàn)，表明分離得到的病毒為BVDV。由于世界各國經(jīng)濟(jì)貿(mào)易頻繁，導(dǎo)致BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛存在，且存在毒株變異較大、毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象，此次分離毒株滴度為2×108TCID50/0.1 mL，且毒力高于BVDV-TC分離株；在BALB/c小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中，隨著感染BVDV時間的延長，BVDV呈現(xiàn)出在機(jī)體內(nèi)大量復(fù)制的現(xiàn)象，BALB/c小鼠試驗(yàn)組與對照組逐漸出現(xiàn)明顯的差異。感染小鼠后可引起慢性感染，表現(xiàn)為多內(nèi)臟器官腫大、出血、變形、質(zhì)地變脆，邊緣鈍圓，無光澤；鏡檢組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、出血，血管淤血，脾臟及肺臟病變較為嚴(yán)重。

根據(jù)以往報(bào)道，新疆地區(qū)主要流行的病毒株為BVDV-1型，但也存在BVDV-2型[21-23]。本試驗(yàn)根據(jù)該分離株5′UTR基因部分區(qū)域繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明BL314分離株與BVDV-2型參考毒株美國125c株在同一分支上，與印度Ind141353株、美國Olwein#12株、美國USMARC-60780株親緣性較近，確定BL314分離株為BVDV-2a基因亞型；表明本次調(diào)查的新疆牛場中存在BVDV-2a型的感染。

本研究通過BVDV的分離與純化來了解CP型新疆地方性毒株2a型的流行特點(diǎn)及致病性，為疫病的診斷及致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。