坦布蘇病毒誘導(dǎo)昆明鼠脾細(xì)胞凋亡

提金鳳，李志杰，刁有祥，李 舫*

(1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)感染是近年來(lái)我國(guó)新出現(xiàn)的一種以水禽感染為主的病毒性傳染病。雛鴨感染后表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、癱瘓、倒地震顫等癥狀，產(chǎn)蛋鴨感染后表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率下降，卵泡出血、破裂、形成卵黃性腹膜炎等特征，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。TMUV最早是1955年從蚊子體內(nèi)分離到的，其屬于黃病毒科、黃病毒屬、那他耶病毒群中的蚊媒類病毒[3-4]。黃病毒屬中大多數(shù)病毒屬于人獸共患病毒，如登革熱病毒(DENV)、流行性乙型腦炎病毒(JEV)、黃熱病毒(YFV)、西尼羅病毒(WNV)等，每年都會(huì)有數(shù)百萬(wàn)人感染或死亡的病例報(bào)道，嚴(yán)重威脅著全世界人類的健康[5-6]。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是生物體重要的生理和病理現(xiàn)象，凋亡規(guī)律一旦失常，機(jī)體將出現(xiàn)病理現(xiàn)象[7-10]。邵周伍林等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TMUV E蛋白在鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)表達(dá)過(guò)程中具有誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。據(jù)報(bào)道，BALB/c小鼠、昆明鼠均能通過(guò)腦內(nèi)途徑接種感染TMUV，表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀和病變[3,11]。TMUV還能引發(fā)BALB/c小鼠發(fā)生抗體依賴性感染[3]。為探討TMUV能否誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生凋亡，本研究以昆明鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用不同檢測(cè)方法研究昆明鼠感染TMUV后誘導(dǎo)脾細(xì)胞凋亡的作用，初步探討TMUV與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相互作用，進(jìn)一步了解病毒的致病機(jī)制，為有效防制該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒3周齡雌性SPF級(jí)昆明鼠購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鴨TMUV SDSG株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所分離保存，該毒株為2013年從山東省某發(fā)病養(yǎng)鴨場(chǎng)的病死鴨體內(nèi)分離(KJ740746)獲得。試驗(yàn)組昆明鼠病毒的接種劑量為104.8ELD50/0.2 mL(ELD50：雞胚半數(shù)致死量)。

1.2 試劑細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；100 bp DNA Ladder購(gòu)自天根生化科技有限公司；瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司；高糖型DMEM購(gòu)自海克隆公司；無(wú)支原體胎牛血清購(gòu)自北京全士金生物技術(shù)有限公司；青/鏈霉素混合液(100×)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)康寧公司(Corning)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 體內(nèi)試驗(yàn)30只3周齡雌性SPF級(jí)昆明鼠隨機(jī)分成2組，每組15只。其中試驗(yàn)組采用腦內(nèi)(I.c)途徑接種50 μL TMUV-SDSG病毒液(104.8ELD50/0.2 mL)，該接種劑量是通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定的。陰性對(duì)照組于相同途徑接種50 μL無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，每天觀察小鼠臨床癥狀。分別于攻毒后3，5，7 d，每組隨機(jī)選擇5只小鼠安樂(lè)死，收集脾臟組織。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3,12]，TMUV只有通過(guò)腦內(nèi)接種才能感染昆明鼠，昆明鼠感染后，脾臟是病變最明顯的組織器官，病毒載量高，因此本研究選擇脾細(xì)胞作為研究細(xì)胞凋亡的靶器官。

1.3.1DNA Ladder法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 首先進(jìn)行組織DNA的提取。將脾臟組織剪切成小塊，研缽中研碎或搗碎，按照細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒說(shuō)明書的要求加入適量的樣品裂解液，每毫升樣品裂解液應(yīng)加入5 μL蛋白酶K，Vortex旋渦混勻器混勻，充分裂解組織。50℃水浴消化過(guò)夜12～20 h。加入500 μL Tris平衡苯酚(pH 8.0)，Vortex旋渦混勻器劇烈混勻，使有機(jī)相和水相充分混合，以達(dá)到抽提效果。4℃、12 000 r/min離心5 min。緩慢吸取上層水相，并用等體積Tris平衡酚再抽提1次。緩慢吸取約300 μL上清液，加入60 μL 10 mol/L 醋酸銨和600 μL無(wú)水乙醇，顛倒數(shù)次混勻，此時(shí)可見DNA沉淀產(chǎn)生。-20℃ 作用 1 h，以充分沉淀小片段DNA。-20℃過(guò)夜或-70℃ 作用效果更佳。4℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清。加入600 μL 70%乙醇，緩慢顛倒約2次。4℃、12 000 r/min 離心10 min，小心吸去上清。盡量除去殘余的乙醇，待看不到明顯的液體時(shí)，立即加入50～100 μL TE溶解DNA。

其次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。取部分抽提的脾臟DNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳電壓采用50 V，電泳時(shí)間持續(xù)2 h左右。制膠時(shí)選取較薄的梳齒，加樣孔扁平，這樣會(huì)獲得更好的DNA Ladder電泳效果。

1.3.2采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 無(wú)菌采集攻毒3，5，7 d后昆明鼠的脾臟，研磨后獲取脾細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液處理后，脾細(xì)胞采用1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取(5～10)×104重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，然后加入10 μL PI染色液，混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。避光孵育過(guò)程中可重懸細(xì)胞2～3次，以改善染色效果。染色后，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)設(shè)置未染色組、PI單染組和Annexin V-FITC單染組作為對(duì)照。

無(wú)菌采集陰性對(duì)照組昆明鼠的脾臟，處理方法同上。

1.4 體外試驗(yàn)無(wú)菌采集3周齡SPF昆明鼠的脾細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液處理后，用含10%小牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮，接種于24孔細(xì)胞板中，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。脾細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔接種0.2 mL TMUV-SDSG，病毒吸附1 h后，棄掉細(xì)胞上清，加入含10%小牛血清的1640細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)立未接種TMUV的脾細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。

1.4.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別收集接種TMUV-SDSG后繼續(xù)培養(yǎng)24，48 h的脾細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取(5～10)×104重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10 μL PI染色液，混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。避光孵育過(guò)程中可重懸細(xì)胞2～3次，以改善染色效果。染色后，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。Annexin V-FITC染色后為綠色熒光，PI染色后為紅色熒光。同時(shí)設(shè)立未染色組、PI單染組和Annexin V-FITC單染組作為對(duì)照。

由于脾細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，死亡細(xì)胞數(shù)目過(guò)多，因此只收集了24，48 h的脾細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 脾細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC和PI染色后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用50～100 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，細(xì)胞涂片，熒光顯微鏡下觀察。設(shè)立未染色組和PI單染組作為對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾細(xì)胞凋亡時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均選擇5個(gè)攻毒樣本和5個(gè)對(duì)照樣本進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本均檢測(cè)3次。檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用軟件Graph Prism進(jìn)行分析，方法采用單向方差分析法即Tukey's post-test法(差異顯著：P<0.05；差異極顯著：P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)試驗(yàn)

2.1.1DNA Ladder法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別取攻毒TMUV-SDSG后3，5，7 d昆明鼠的脾臟，DNA ladder試劑盒處理后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示。昆明鼠攻毒后3 d，脾臟組織沒(méi)有出現(xiàn)DNA Ladder圖譜，攻毒后5，7 d，脾臟組織出現(xiàn)了明顯的梯狀DNA Ladder圖譜。陰性對(duì)照組均沒(méi)有出現(xiàn)DNA Ladder圖譜。

M.100 bp DNA Marker ；1～3.攻毒后3，5，7 d昆明鼠脾臟DNA Ladder；4～6.陰性對(duì)照組小鼠脾臟DNA Ladder

2.1.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 無(wú)菌采集攻毒后3，5，7 d昆明鼠的脾細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液處理后，Annexin V-FITC和PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示。

昆明鼠攻毒TMUV后3 d，脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為49.30%(圖2A)，對(duì)照組健康昆明鼠脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為36.44%(圖2B)，攻毒組與對(duì)照組差異顯著(圖2G，P<0.05)。昆明鼠攻毒TMUV后5 d，脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為53.76%(圖2C),對(duì)照組健康昆明鼠脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為43.84%(圖2D)，攻毒組與對(duì)照組差異顯著(圖2G，P<0.05)。昆明鼠攻毒TMUV后7 d，脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為68.62%(圖2E),對(duì)照組健康昆明鼠脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為31.72%(圖2F)，攻毒組與對(duì)照組差異極顯著(圖2G，P<0.01)。

A,C,E.分別為昆明鼠感染TMUV后3，5，7 d的脾細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例；B,D,F.分別為對(duì)照組健康昆明鼠脾細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例；G.凋亡細(xì)胞的比例,誤差線表示樣本平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，a與b表示不同時(shí)間點(diǎn)攻毒組和對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05，P<0.01)，計(jì)算采用單向方差分析法(Tukey's post-test)。下同

2.2 體外試驗(yàn)

2.2.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別收集接種TMUV后24，48 h昆明鼠的脾細(xì)胞，染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，以健康昆明鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，感染TMUV后24 h的昆明鼠脾細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞比例為27.9%(圖3A)，對(duì)照組昆明鼠脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為16.1%(圖3B),試驗(yàn)組和對(duì)照組相比差異顯著(圖3E，P<0.05)。感染TMUV后48 h的昆明鼠脾細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的比例為32.22%(圖3C),對(duì)照組昆明鼠脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例為25.26%(圖3D),試驗(yàn)組和對(duì)照組相比差異顯著(圖3E，P<0.05)。

A，C.對(duì)照組脾細(xì)胞培養(yǎng)后24，48 h凋亡細(xì)胞的比例；B，D.脾細(xì)胞感染后TMUV 24，48 h凋亡細(xì)胞的比例；E.凋亡細(xì)胞的比例

2.2.2熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 脾細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FITC和PI染色后，熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，綠色熒光染色的為凋亡細(xì)胞，綠色和紅色熒光雙染色的是壞死細(xì)胞；其中脾細(xì)胞感染TMUV后48 h，凋亡細(xì)胞數(shù)目和死亡細(xì)胞數(shù)目比24 h更多。未染色對(duì)照組，沒(méi)有出現(xiàn)任何熒光(圖4)。

3 討論

TMUV最早在我國(guó)出現(xiàn)時(shí)，只有鴨感染發(fā)病，不到1年時(shí)間，該病毒迅速蔓延至鵝、雞和鳥類，可見該病毒傳播速度快，易感動(dòng)物種類多。TMUV感染后主要引起產(chǎn)蛋禽的產(chǎn)蛋率下降，幼禽的神經(jīng)癥狀等[13-15]。研究表明，TMUV感染蛋雞和鵝時(shí)，感染細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)便會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡[16]。隨著TMUV不斷進(jìn)化，可能會(huì)有更多種類的動(dòng)物被感染，如哺乳動(dòng)物等。關(guān)于TMUV與哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間相互作用的研究較少，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的研究還尚未見報(bào)道。但黃病毒屬中其他病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的研究較多，如DENV、JEV、豬瘟病毒(CSFV)等。據(jù)報(bào)道，DENV能誘導(dǎo)人的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且該凋亡與細(xì)胞受體Fas/FasL的表達(dá)改變有關(guān)[17-19]。本研究通過(guò)TMUV體內(nèi)和體外2種方式感染昆明鼠脾細(xì)胞，觀察流式細(xì)胞儀和DNA Ladder的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步評(píng)估該病毒誘導(dǎo)昆明鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞凋亡作用。

A,E.脾細(xì)胞感染TMUV 24，48 h Annexin V-FITC染色結(jié)果；B,F.脾細(xì)胞感染TMUV 24，48 h PI染色結(jié)果；C,G.脾細(xì)胞感染TMUV 24，48 h Annexin V-FITC和PI染色后融合的結(jié)果；D,H.脾細(xì)胞感染TMUV 24，48 h未染色對(duì)照組

本研究的體內(nèi)試驗(yàn)是采用腦內(nèi)接種途徑對(duì)昆明鼠進(jìn)行攻毒后，對(duì)脾細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。DNA Ladder法檢測(cè)結(jié)果顯示，昆明鼠攻毒后3 d，脾臟組織沒(méi)有出現(xiàn)梯狀DNA Ladder，攻毒后5,7 d，脾臟組織出現(xiàn)了特異性的梯狀DNA Ladder圖譜。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，昆明鼠攻毒后3 d，脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異顯著；攻毒后5，7 d，脾細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異極顯著。這些數(shù)據(jù)充分表明，TMUV能夠誘導(dǎo)昆明鼠脾細(xì)胞發(fā)生凋亡。TMUV感染初期，細(xì)胞凋亡不明顯，感染時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡越顯著。這與昆明鼠感染TMUV后發(fā)生病理變化和免疫抑制的規(guī)律是一致的[1]，從而進(jìn)一步說(shuō)明TMUV誘導(dǎo)昆明鼠脾細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致脾臟病變及機(jī)體免疫抑制的重要因素之一。

據(jù)報(bào)道，CSFV的E蛋白與淋巴細(xì)胞孵育后，能抑制淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。SATO等[21]經(jīng)體外研究也證明了CSFV可以在脾組織細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡[22]。JEV可以誘導(dǎo)小鼠發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡。本研究中，TMUV也表現(xiàn)出相似的特性。TMUV能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的昆明鼠脾細(xì)胞發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡。體外試驗(yàn)中，脾細(xì)胞感染TMUV繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h，死亡脾細(xì)胞占絕大多數(shù)，因此本研究只選擇了2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即24，48 h進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀對(duì)Annexin V-FITC和PI染色后的脾細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，TMUV感染24，48 h，凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異顯著，病毒感染時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的比例越顯著。這與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致。熒光顯微鏡觀察V-FITC和PI染色后的脾細(xì)胞，結(jié)果顯示，TMUV感染24，48 h，均出現(xiàn)多量凋亡細(xì)胞，病毒感染時(shí)間與凋亡細(xì)胞比例的關(guān)系與前面試驗(yàn)的結(jié)果一致。

本研究通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)明確了TMUV感染昆明鼠后能誘導(dǎo)脾細(xì)胞發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡，為探討TMUV與易感動(dòng)物細(xì)胞的作用機(jī)制、揭示其致病原理奠定了基礎(chǔ)，為有效防制該病提供了理論依據(jù)。