不同施肥模式對(duì)土壤氮循環(huán)功能微生物的影響

郭俊杰，朱 晨，劉文波，王建中，凌 寧，郭世偉*

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095；2 溧陽市南渡鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，江蘇常州 213371）

土壤氮循環(huán)是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，主要包括氨化、硝化、反硝化和固氮等過程[1-2]。從本質(zhì)上講，氮循環(huán)是由植物、真菌、細(xì)菌和古菌等共同催化的氮化合物氧化還原反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[3]，其中微生物是主要的驅(qū)動(dòng)者[4]。研究表明，微生物對(duì)其定殖環(huán)境的變化非常敏感[5]。作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中主要的人為干擾因素，施肥能夠通過改變土壤微環(huán)境，塑造土壤微生物群落，進(jìn)而影響土壤氮循環(huán)過程[6-7]?；诘厣锏厍蚧瘜W(xué)所涉及微生物功能基因的定量分析已被證明能夠有效提供關(guān)于行使氮轉(zhuǎn)化功能的微生物群落動(dòng)態(tài)及其生態(tài)學(xué)信息，有助于將功能微生物類群與土壤性狀以及實(shí)際氮轉(zhuǎn)化生態(tài)過程直接聯(lián)系，以提高對(duì)土壤氮循環(huán)關(guān)鍵微生物過程及機(jī)制的理解[8]。不同施肥模式對(duì)氮循環(huán)各功能基因具有顯著不同的影響[6-7]。但是，大多數(shù)研究主要集中在涉及特定氮轉(zhuǎn)化過程的一種或幾種功能基因[6-8]，關(guān)于施肥模式對(duì)整個(gè)土壤氮循環(huán)相關(guān)微生物群落的影響仍缺乏足夠的認(rèn)知。

在參與氮循環(huán)的微生物中，氨氧化微生物和反硝化微生物通常作為微生物生態(tài)學(xué)研究的模式微生物，以深入理解微生物群落在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)功能調(diào)控中的重要作用[9-10]。Petersen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，氨氧化微生物和反硝化微生物的功能基因豐度是預(yù)測(cè)土壤硝化和反硝化潛在速率最重要的變量。相比于由多種不同的細(xì)菌、古菌和真菌所介導(dǎo)的反硝化過程，氨氧化過程僅由少數(shù)系統(tǒng)發(fā)育聚集的氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌 (AOB) 完成，因而更適用于探究功能微生物類群與生態(tài)功能之間的聯(lián)系[8]。AOA和AOB在大多數(shù)土壤中共存，且通常AOA的豐度比AOB更豐富，因此AOA被認(rèn)為是土壤氨氧化過程的主導(dǎo)微生物[12]。然而，一些研究卻提出了相反的結(jié)論，認(rèn)為氨氧化活性的變化僅與AOB群落的豐度和組成有關(guān)，而與AOA的群落無關(guān)[13-14]。目前，AOA和AOB之間的生態(tài)位分異和功能互補(bǔ)已有較為明確的結(jié)論[15-16]，但是關(guān)于不同施肥模式下AOA與AOB對(duì)土壤硝化作用的相對(duì)貢獻(xiàn)仍有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過采集短期不同施肥模式田間試驗(yàn)的土壤樣品，利用熒光定量PCR (q-PCR) 技術(shù)定量分析參與土壤氮循環(huán)過程的各類功能微生物基因豐度，探究土壤氮循環(huán)功能微生物對(duì)不同施肥模式的響應(yīng)及其關(guān)鍵影響因素。同時(shí)，以氨氧化微生物為例，評(píng)估功能微生物類群與土壤生態(tài)功能間的內(nèi)在聯(lián)系。本研究旨在明確施肥模式對(duì)土壤氮循環(huán)功能微生物類群及其氮轉(zhuǎn)化過程的影響，為制定更好的氮素管理策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)地點(diǎn)與土樣采集

田間試驗(yàn)始于2011年6月，地點(diǎn)位于中國(guó)江蘇省常州市溧陽市南渡鎮(zhèn) (31°27′N，119°19′E)，為常規(guī)稻麥輪作生態(tài)系統(tǒng)。該地區(qū)氣候類型為北亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫與降雨量分別為17.5℃和1149.7 mm。土壤類型為白土型水稻土。

稻季試驗(yàn)設(shè)置如下處理：1) 單施化肥 (NPK)，施肥量為N 351.75 kg/hm2、P2O575 kg/hm2和K2O 84 kg/hm2；2) 化肥+畜禽有機(jī)肥 (NPKM)，施肥量為N 282.75 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 84 k g/hm2和有機(jī)肥 (鮮基) 1500 kg/hm2；3) 化肥+秸稈還田(NPKS)，施肥量為N 351.75 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 84 kg/hm2和小麥秸稈 (干基) 3000 kg/hm2。其中，NPKM處理是在NPK處理基礎(chǔ)上減施20%化肥氮后增施有機(jī)肥。供試化肥種類為兩種復(fù)合肥 (N–P2O5–K2O 分別為16–16–16 以及20–12–16)和尿素，有機(jī)肥為豬糞有機(jī)肥。2014年10月底，水稻收獲后采集土壤樣品，同時(shí)采集相鄰江蘇省耕地質(zhì)量監(jiān)測(cè)點(diǎn)不施肥處理的土壤樣品作為對(duì)照 (CK)。在每個(gè)處理小區(qū)中，使用土鉆采集10個(gè)位點(diǎn)0—20 cm土層土壤樣品，混合后，過 2 mm篩除去雜質(zhì)，之后分為三部分：一部分鮮土儲(chǔ)存在–80℃冰箱，用于土壤DNA提取；一部分儲(chǔ)存于4℃ 冰箱中，用于土壤銨態(tài)氮 (NH4+)和硝態(tài)氮 (NO3–)含量以及硝化潛勢(shì)的測(cè)定；剩余部分風(fēng)干后用于土壤pH、土壤有機(jī)碳 (SOC)和全氮含量分析。

1.2 土壤理化性質(zhì)分析

將0.01 mol/L CaCl2溶液與鮮土按照液土比為10∶1的比例混合后振蕩30 min，過濾后使用連續(xù)流動(dòng)分析儀 (Autoanalyser 3，Bran Luebbe，Norderstedt，Germany) 測(cè)定土壤中銨態(tài)氮 (NH4+)和硝態(tài)氮 (NO3?)含量。使用 Vario MACRO cube 元素分析儀(ElementarAnalysensysteme GmbH，Hanau，Germany)測(cè)定風(fēng)干土壤 (過 0.149 mm 篩) 的有機(jī)碳 (SOC)和全氮含量。將過 1 mm 篩的風(fēng)干土壤與煮沸后冷卻的無 CO2去離子水按 1∶2.5 (質(zhì)量∶體積) 比例混合，振蕩 30 min 并靜置 30 min，使用 pH 計(jì) (PE-10，Sartorious，Germany) 測(cè)定土壤懸濁液的pH。

1.3 土壤DNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

稱取 0.25 g 鮮土，使用 MoBioPowerSoilTMDNA提取試劑盒提取DNA。使用NanoDrop分光光度計(jì) (NanoDrop Technologies，Wilmington，DE) 檢測(cè)所提取 DNA (最終體積，100 μL) 的質(zhì)量和濃度。使用 ABI 7500熒光定量 PCR儀 (Applied Biosystems，America)和SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒 (Takara) 進(jìn)行定量 PCR (qPCR)，分析氨化(gdh)、硝化 (AOA-amoA、AOB-amoA)、反硝化(narG、nirS、nirK、norB、nosZ)、固氮 (nifH)、硝酸鹽異化還原 (napA) 等氮循環(huán)過程相關(guān)功能微生物基因的豐度。qPCR 反應(yīng)體系為25 μL，包含 1 μL DNA 模板，12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTM，0.5 μL 正、反向引物，0.5 μL ROX Reference Dye II(50 ×) 以及 10 μL ddH2O。氮循環(huán)功能基因引物序列詳見表1。

表 1 氮循環(huán)功能基因引物序列Table 1 The primer sets for amplification of functional genes involved in nitrogen cycle

1.4 硝化潛勢(shì)測(cè)定

按照Taylor等[25]和Ouyang等[14]的方法，通過測(cè)定添加與不添加 1-辛炔 (4 μmol/L Caq) 情況下的土壤硝化潛勢(shì)，確定AOA與AOB對(duì)硝化潛勢(shì)的相對(duì)貢獻(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，將4.5 g鮮土置于150 mL蓋有黑色瓶蓋和灰色橡膠塞的玻璃瓶中，加入30 mL 30 mmol/L TES(2-[[三 (羥甲基) 甲基]氨基]乙磺酸) 緩沖液(含 1.0 mmol/L NH4+，pH 7.2)，將瓶子在 30℃ 下以200 r/min振蕩2 h以均勻混合。之后，將瓶子分為兩組，其中一組立即加入1-辛炔氣體 (4 μmol/L Caq)，另外一組不添加1-辛炔作為對(duì)照。在振蕩后2與24 h分別采集5 mL土壤懸濁液。土壤懸濁液離心8 min (8000 r/min)，再用濾紙過濾至 10 mL 離心管。用連續(xù)流動(dòng)分析儀 (AA3) 測(cè)定濾液中亞硝態(tài)氮(NO2?)和硝態(tài)氮 (NO3?) 的濃度。硝化潛勢(shì)通過(NO2?+NO3?) 濃度與時(shí)間的線性關(guān)系斜率表示。1-辛炔能夠使AOB的氨單加氧酶不可逆轉(zhuǎn)地失活，但對(duì)AOA無顯著的抑制作用[25]。因此，在1-辛炔存在下硝化潛勢(shì)為AOA (對(duì)1-辛炔拮抗) 介導(dǎo)的硝化潛勢(shì)。AOA的硝化潛勢(shì)與無1-辛炔存在下測(cè)定的總硝化潛勢(shì)之間的差值為AOB (對(duì)1-辛炔敏感) 所介導(dǎo)的硝化潛勢(shì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

單因素方差分析 (ANOVA) 用于檢驗(yàn)施肥模式對(duì)氮循環(huán)功能基因豐度、硝化潛勢(shì)等的影響，并采用Fisher最小顯著性差異法 (LSD) 進(jìn)行多重比較 (α=0.05，SPSS 16.0 for Windows，IBM Corp.，Armonk，NY，USA)?；跉W式距離矩陣，采用主成分分析(PCA)和單因素多元方差分析 (PERMANOVA)、置換多元分散分析 (PERMDISP) 比較樣品之間整體氮循環(huán)功能基因豐度的差異 (R 3.2.2, ape和vegan package)。使用相似度百分比分析 (SIMPER) 評(píng)估單一氮循環(huán)功能基因?qū)κ┓逝c對(duì)照處理之間功能微生物變異的相對(duì)貢獻(xiàn)[6](R 3.2.2，vegan package)。采用回歸分析評(píng)估總硝化潛勢(shì)和amoA基因豐度之間的關(guān)系、AOA或AOB所介導(dǎo)的硝化潛勢(shì)與其相應(yīng)的AOA-amoA或AOB-amoA基因豐度之間的關(guān)系 (R 3.2.2，stats package)。通過前向選擇，篩選納入冗余分析 (RDA) 的土壤理化參數(shù)。使用RDA闡明土壤理化性質(zhì)與氮循環(huán)功能基因豐度之間的關(guān)系，并使用蒙特卡羅置換 (Monte Carlo permutations) 檢驗(yàn)其顯著性。使用逐步回歸分析土壤理化性質(zhì)與單一氮循環(huán)功能基因豐度以及硝化潛勢(shì)的關(guān)系 (R 3.2.2，MASS package)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥模式對(duì)氮循環(huán)功能基因豐度的影響

主成分分析 (PCA) 表明，不同施肥模式下土壤中氮循環(huán)功能基因豐度整體發(fā)生了顯著改變(PERMANOVAF=19.517，P=0.001；PERMDISPF=0.1682，P=0.915，圖 1)。PCA 1 軸與 2 軸分別解釋75.92%和8.68%的整體氮循環(huán)功能基因的變化。如圖1所示，各施肥模式可分為3組：CK處理的土壤與其他施肥處理下的土壤相比差異較大，作為一組；NPK與NPKS處理的土壤氮循環(huán)功能基因分布相似，作為一組；NPKM處理的土壤作為一組。

圖 1 氮循環(huán)功能基因的主成分分析Fig.1 PCA plot of microbial functional genes involved in nitrogen cycle

圖2顯示，施肥處理對(duì)AOA-amoA、nirS、napA3個(gè)氮循環(huán)功能基因豐度無顯著影響，但是對(duì)其余7個(gè)功能基因豐度均有不同程度的影響。與CK相比，NPK處理顯著提高了土壤AOB-amoA(21.3倍)、narG(3.3 倍)、nosZ(1.1 倍)、nifH(0.9 倍) 的基因豐度，但對(duì)gdh、nirK、norB基因的豐度沒有顯著影響；NPKS處理則提高了土壤AOB-amoA(26.1倍)、narG(4.6 倍)、nirK(2.8 倍)、nosZ(4.5 倍)和nifH(3.3倍) 基因的豐度；NPKM處理顯著提高了除AOA-amoA、nirS、napA基因外的氮循環(huán)功能基因的豐度，特別是AOB-amoA，比CK處理高33.5倍 (圖2)。

圖 2 不同施肥模式下氮循環(huán)功能基因豐度Fig.2 Abundance of functional genes involved in nitrogen cycling under different fertilization regimes

通過SIMPER計(jì)算每個(gè)功能基因?qū)κ┓释寥琅c對(duì)照土壤間氮循環(huán)功能微生物群落差異的相對(duì)貢獻(xiàn)，以明確導(dǎo)致施肥處理與對(duì)照處理間氮循環(huán)功能微生物差異的主要基因 (表2)。3個(gè)施肥處理中，AOB-amoA基因豐度的變化對(duì)氮循環(huán)功能基因整體豐度變異的權(quán)重最大，占28.56%～38.92%，其次為narG，貢獻(xiàn)率在11.50%～18.42%，而norB基因的貢獻(xiàn)最低，僅為0.39%～3.14%。

表 2 各功能基因?qū)Σ煌┓侍幚砼c對(duì)照間整體氮循環(huán)功能基因豐度變異的貢獻(xiàn) (%)Table 2 Contribution of each target gene to total variations of nitrogen cycling gene abundance between fertilization and CK using SIMPER analysis

2.2 不同施肥模式對(duì)硝化潛勢(shì)的影響

不同施肥處理間土壤硝化潛勢(shì)差異顯著 (圖3)，以NPKM處理土壤的硝化潛勢(shì)最高，為15.07 mg/(kg·d)，以CK處理的土壤硝化潛勢(shì)最低，僅為5.25 mg/(kg·d)。與 CK 處理的土壤相比，NPK、NPKM和NPKS處理的土壤硝化潛勢(shì)分別提高了149.09%、187.16%和186.10%。

圖 3 不同施肥模式下土壤的硝化潛勢(shì) (1-辛炔抑制法)Fig.3 Nitrification potential with and without 1-octyne under different fertilization regimes

施肥模式對(duì)AOB介導(dǎo)的土壤硝化潛勢(shì)影響顯著(F=78.11，P＜0.05)，而對(duì) AOA 介導(dǎo)的土壤硝化潛勢(shì)無顯著影響 (F=0.735，P=0.56)。CK 處理的土壤硝化潛勢(shì)為2.65 mg/(kg·d)。與CK處理的土壤相比，施用肥料顯著提高了AOB介導(dǎo)的土壤硝化潛勢(shì)，增幅為10.72～12.76 mg/(kg·d)。AOB 介導(dǎo)的硝化潛勢(shì)約占土壤總硝化潛勢(shì)的50.47%～84.92%，對(duì)土壤硝化潛勢(shì)的貢獻(xiàn)高于AOA。

圖4 回歸分析表明，土壤總硝化潛勢(shì)隨著土壤中AOB-amoA基因拷貝數(shù)的增加呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)(R2=0.957，P＜0.001)，但是與 AOA-amoA基因拷貝數(shù)相關(guān)性不顯著。分析AOA與AOB各自介導(dǎo)的土壤硝化潛勢(shì)與其相應(yīng)amoA基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其各自介導(dǎo)的土壤硝化潛勢(shì)均隨著amoA基因拷貝數(shù)的增加呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì) (AOA：R2=0.406，P=0.026；AOB：R2=0.960，P＜0.001)。

圖 4 硝化潛勢(shì)與AOA-amoA及AOB-amoA基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系Fig.4 Linear relationships between soil nitrification potential and the copy numbers of AOA-amoA or AOB-amoA gene

2.3 影響氮循環(huán)功能基因及硝化潛勢(shì)的土壤理化因素

通過前向選擇，篩選出pH、SOC和NO3?含量 3個(gè)主要理化因素。冗余分析 (RDA) 表明，理化性質(zhì)解釋了氮循環(huán)功能基因豐度總變異的87.96%，其中前兩軸解釋變異的83.08% (圖5)。第一組分 (RDA1)將CK處理的土壤與其他土壤分開，并解釋了74.98%的變異。第二組分 (RDA2) 將NPKM處理的土壤與NPK、NPKS處理的土壤分開，并解釋了8.10%的變異。根據(jù)蒙特卡羅置換測(cè)驗(yàn)，pH、SOC和NO3?含量顯著影響了氮循環(huán)功能基因豐度的變化。逐步多元回歸分析同樣表明，SOC含量是決定土壤中絕大多數(shù)氮循環(huán)功能基因豐度的主要因素 (表3)。此外，pH和SOC含量是影響土壤硝化潛勢(shì)的重要理化因素。

圖 5 不同施肥模式下氮循環(huán)功能基因豐度與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis (RDA) ordination plots depicting the relationships between abundance of the functional genes involved in nitrogen cycle and selected soil properties under different fertilization regimes

表 3 與氮循環(huán)功能基因拷貝數(shù)以及總硝化潛勢(shì)顯著相關(guān)的土壤理化性質(zhì) (經(jīng)逐步回歸分析篩選)Table 3 The soil properties correlated with functional gene copy numbers involved in nitrogen cycle and total nitrification potential (screened by stepwise regression analysis)

3 討論

3.1 施肥模式對(duì)氮循環(huán)功能微生物基因豐度的影響

一般而言，化肥的施用對(duì)不同氮循環(huán)相關(guān)微生物的豐度具有顯著影響，但其變化趨勢(shì)卻并不一致[6-7,26-27]。相比之下，有機(jī)類肥料 (包括畜禽有機(jī)肥、秸稈等) 的施用通常對(duì)固氮[28]、硝化[29]和反硝化[30]微生物的豐度表現(xiàn)出具有類群特異性的提升作用。資源有效性影響著土壤微生物的生存與發(fā)展，例如固氮微生物通常受到碳與磷供應(yīng)的限制[31]，而氨氧化微生物的生長(zhǎng)與底物銨鹽的有效性緊密相關(guān)[14]。與化肥短期而快速的養(yǎng)分釋放特性不同，有機(jī)類肥料能夠?yàn)橥寥牢⑸锾峁┏渥闱页掷m(xù)的碳源與養(yǎng)分，支持土壤微生物種群的整體生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致氮循環(huán)相關(guān)微生物種群也可能隨之增長(zhǎng)[7]。在本研究中，RDA與逐步多元回歸分析均表明了SOC含量是影響氮循環(huán)功能微生物群落豐度最重要的因素。除了SOC含量，pH與NO3?含量也顯著影響著氮循環(huán)功能基因豐度。前人的研究表明，土壤pH除了影響整體微生物群落組成[32-33]，對(duì)氮循環(huán)功能基因的豐度和多樣性也具有強(qiáng)烈的調(diào)控作用[8,34]。與秸稈還田相比，畜禽有機(jī)肥對(duì)氮循環(huán)相關(guān)微生物的促進(jìn)效果更強(qiáng)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是畜禽有機(jī)肥與秸稈相比更能提供均衡和穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[35]，可以維持更多樣化的土壤微生物群落[36]。此外，畜禽有機(jī)肥與秸稈本身的性質(zhì)差異，如木質(zhì)素與纖維素含量、碳氮比等，會(huì)影響有機(jī)物質(zhì)的礦化，也是導(dǎo)致土壤氮循環(huán)微生物響應(yīng)不同的可能原因[35]。需要注意的是，由于功能基因豐度與氮循環(huán)生態(tài)過程的可能聯(lián)系[7]，施用肥料尤其是有機(jī)類肥料所引起的硝化、反硝化相關(guān)功能基因豐度的提高，可能會(huì)導(dǎo)致氮素?fù)p失、氮肥利用率下降等潛在風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生。與Sun等[6]的研究結(jié)果相似，在本研究中，AOB-amoA基因是施肥影響下氮循環(huán)功能微生物群落豐度變異最重要的基因。這一結(jié)果表明氨氧化細(xì)菌對(duì)施肥的敏感性高于其他氮循環(huán)相關(guān)微生物類群。其主要原因可能是所施用的肥料中，復(fù)合肥中所含的銨態(tài)氮以及尿素通過水解形成的氨會(huì)直接影響土壤氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)[6]。此外，硝化作用的代謝產(chǎn)物硝酸鹽是反硝化作用中硝酸鹽還原過程的底物，因此硝酸鹽還原酶編碼基因narG對(duì)氮循環(huán)群落豐度變異的貢獻(xiàn)也較高。

3.2 土壤氨氧化微生物與土壤硝化活性的聯(lián)系

AOA與AOB所介導(dǎo)的氨氧化是土壤硝化過程的初始與限速步驟，因此也被認(rèn)為是影響肥料有效性的關(guān)鍵過程。在本研究中，與AOB相比，AOA具有更高的豐度 (約為AOB的1.2～25倍)，且施肥導(dǎo)致AOA與AOB的豐度比值顯著降低。這是由于無論是單施化肥還是增施有機(jī)類肥料，AOA-amoA基因豐度均不受影響。不同于AOA，與不施肥土壤相比，施肥導(dǎo)致土壤中AOB-amoA基因豐度顯著增加。這一結(jié)果與Ouyang等[14]的研究結(jié)果相似。然而，其他研究者卻發(fā)現(xiàn)隨著糞肥或堆肥的施用，AOA豐度增加[29,37]。這可能是由于這些研究中糞肥或堆肥施用時(shí)間長(zhǎng)，且具有較高施用量，能夠提供大量由有機(jī)態(tài)氮礦化而成的氨/銨態(tài)氮，有利于AOA的生長(zhǎng)[14]。此外，與AOA相比，AOB具備更大的細(xì)胞尺寸[15]，且兩者的氨氧化途徑不同，這些也可能會(huì)影響它們對(duì)銨態(tài)氮的生理響應(yīng)[7]。

在所有施肥的土壤中，AOB對(duì)總硝化潛勢(shì)的貢獻(xiàn)約為81.90%～84.92%。即使在不施肥土壤中，AOB對(duì)總硝化潛勢(shì)的貢獻(xiàn)也超過50%。Ouyang等[14]通過4年的田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于AOA，AOB對(duì)農(nóng)業(yè)土壤中的氮源更敏感，在土壤硝化過程中起主導(dǎo)作用。Xia等[38]則通過穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AOB主導(dǎo)了農(nóng)業(yè)土壤中約76%的硝化作用。此外，本研究結(jié)果顯示，AOA對(duì)總土壤硝化潛勢(shì)仍具有15.08%至49.53%的貢獻(xiàn)，表明AOA同樣是土壤氨氧化過程的參與者[14,39]。雖然土壤總硝化潛勢(shì)僅與AOB-amoA基因豐度呈顯著正相關(guān)，但是AOA、AOB的功能基因豐度與AOA、AOB各自介導(dǎo)的硝化潛勢(shì)也呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，這再次說明在農(nóng)業(yè)土壤中，AOA和AOB都是土壤硝化作用的重要貢獻(xiàn)者。但是，AOB對(duì)氮肥的響應(yīng)比AOA更敏感。因此，在調(diào)控農(nóng)田土壤硝化作用以減少氮素?fù)p失、提高氮素利用率時(shí)，應(yīng)該主要集中在調(diào)節(jié)AOB豐度上，特別是在施用銨態(tài)氮肥或酰胺態(tài)氮肥的土壤中。通過物理化學(xué)手段 (如施用硝化抑制劑) 或者植物分子育種途徑 (如培育根際強(qiáng)硝化抑制的作物)，可能是調(diào)控農(nóng)田土壤AOB微生物群落生長(zhǎng)的有效管理措施。

4 結(jié)論

化肥與有機(jī)類肥料配合施用可不同程度地提高氮循環(huán)功能基因的豐度。土壤pH、有機(jī)碳和NO3?含量是影響氮循環(huán)微生物群落豐度的關(guān)鍵因素。AOB-amoA基因?qū)κ┓誓Ｊ阶顬槊舾?，其豐度的變化影響著土壤整體氮循環(huán)群落豐度變化。AOB主導(dǎo)著農(nóng)田土壤的硝化作用，AOB-amoA基因豐度的高低可在一定程度上反映土壤硝化作用的強(qiáng)弱。