少花桂葉香氣活性成分分析鑒定

趙 銀，王羽桐，李 娟，杜文斌，譚 佳，謝建春

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)輕工技術(shù)學(xué)院，北京 100048）

少花桂（Cinnamomum pauciflorumNees）系樟科樟屬小喬木，主要分布在四川、云南、湖南、湖北、貴州、廣西等省區(qū)，通常生長于海拔400～1800（2200）m的石灰?guī)r或砂巖上的山地或山谷疏林或密林中[1]，又稱香桂、巖桂、土桂皮、香葉子樹、三條筋、臭樟等[2]。少花桂樹皮及根入藥，具有開胃健脾及散熱功能。同時(shí)，少花桂枝葉因富含芳香油，在香料工業(yè)上具有較大的應(yīng)用價(jià)值。目前少花桂的研究多集中于先通過水蒸氣蒸餾法[1-4]、同時(shí)蒸餾萃取法[5]、超臨界CO2萃取法[5]提取少花桂得到精油，再經(jīng)氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography and Mass Spectrometry，GC-MS）進(jìn)行分析[1-12]。所采用的樣品前處理方法需要較大的樣品量、耗時(shí)長，甚至熱敏感性成分被破壞（水蒸氣蒸餾法、同時(shí)蒸餾萃取法）。同時(shí)，氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析到的僅為少花桂的揮發(fā)性組成而不是香氣組成，因?yàn)樵诒姸鄵]發(fā)性成分中，往往具有氣味活性的成分才真正對總體香氣有貢獻(xiàn)[13]。

氣相色譜-嗅聞聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Olfactometry，GC-O）[14-15]是一種利用人鼻嗅聞經(jīng)氣相色譜分離后的組分，以檢測樣品中香氣活性成分的方法，對篩選食品中的香氣活性成分及確定其對總體香氣貢獻(xiàn)大小非常有效。在GC-O 測量技術(shù)中，直接強(qiáng)度法直接確定各化合物的氣味強(qiáng)度，操作簡單，強(qiáng)度越大對總體香氣的貢獻(xiàn)越大[16-17]。直接強(qiáng)度法在酒類[18]、飲料[19]、食用油類[20]和肉制品[13,21]等多種食品香氣活性成分分析中得到應(yīng)用。頂空固相微萃?。℉eadspace Solid-Phase Micro Extraction，HS-SPME)與傳統(tǒng)預(yù)處理方法比較[22-23]，具有操作簡單、條件溫和、進(jìn)樣快、分析迅速且不用任何萃取溶劑等優(yōu)點(diǎn)，是目前食品風(fēng)味分析的重要樣品前處理方法。

本文采用HS-SPME 處理少花桂葉，然后采用GC-MS 分析少花桂葉揮發(fā)性成分，并在此基礎(chǔ)上，采用直接強(qiáng)度GC-O 對少花桂葉的香氣活性成分進(jìn)行研究。研究結(jié)果對于以少花桂葉為原料進(jìn)行香料研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

少花桂葉 淘寶（采自6 月，自然風(fēng)干）；C6～C25正構(gòu)烷烴（色譜純）、二氯甲烷溶劑（分析純）國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司。

手動固相微萃取手柄（1 cm 長 75 μm CAR/PDMS）萃取纖維、7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司；DATU 2000 嗅聞器 美國DATUInc.公司；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋 河南予華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 頂空固相微萃取 萃取纖維按使用說明先進(jìn)行老化。老化程序：加熱溫度250 ℃；分流比50:1；柱溫40 ℃；老化10 min。

將風(fēng)干的少花桂葉粉碎，取0.5 g 置于15 mL 密封樣品瓶中，放入50 ℃恒溫水浴中頂空吸附35 min，磁子攪拌轉(zhuǎn)速20 r/min，待GC-MS 或GC-O 分析。

1.2.2 GC-MS 分析 色譜條件1：色譜柱DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，以3 ℃/min 升至80 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升至230 ℃，保持2 min；載氣（He）流速3 mL/min，進(jìn)樣口250 ℃；不分流模式；萃取纖維解吸5 min。

色譜條件2：色譜柱DB-5（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，以12 ℃/min升至100 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升至150 ℃，保持3 min，以30 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min；載氣（He）流速3 mL/min，進(jìn)樣口250 ℃；不分流模式；萃取纖維解吸5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍33～400 amu，全掃描模式；輔助加熱線溫度280 ℃。

1.2.3 GC-O 分析 GC-O 系統(tǒng)由配有FID 檢測器的Agilent 7890A GC 裝置和嗅聞裝置組成。色譜柱DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫程序同GCMS 分析。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氮?dú)?，流速?.0 mL/min。萃取纖維解吸5 min。每個(gè)樣品嗅聞兩次，嗅聞時(shí)評價(jià)員需要記錄氣味特征、氣味強(qiáng)度及保留時(shí)間。氣味強(qiáng)度記為1、2、3、4 四個(gè)等級[16]，“1”表示氣味較弱，“2”表示氣味強(qiáng)度中等，“3”表示氣味較強(qiáng)，“4”表示氣味非常強(qiáng)。

在相同條件下進(jìn)樣，分析C6～C25正構(gòu)烷烴，計(jì)算保留指數(shù)（RI 值）：

式中，tn和t(n+1)分別為碳數(shù)為n、n+1 正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，min；ti是在tn和t(n+1)之間的第i 個(gè)化合物的保留時(shí)間，min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 分析采用檢索NIST 11 譜庫、核對保留指數(shù)（RI）鑒定化合物，各成分的含量通過峰面積歸一化法得到。表格繪制及數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft excel 2010 軟件，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=2）。GC-O 分析，根據(jù)保留指數(shù)（RI）、GC-MS 分析鑒定結(jié)果、嗅聞氣味特征，鑒定氣味活性化合物。

2 結(jié)果與分析

采用頂空固相微萃取制備樣品，用兩根色譜柱（極性柱DB-WAX、弱極性柱DB-5）GC-MS 分析，總離子流圖見圖1。

圖1 采用 DB-WAX 和DB-5 兩色譜柱固相微萃取/氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)分析少花桂葉的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms for analysis of leaves of Cinnamomum pauciflorum Nees by solid-phase micro extraction(SPME) combined with gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS) on DB-WAX and DB-5 columns.

為了確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中采用雙柱（極性柱、弱極性柱）定性，根據(jù)計(jì)算機(jī)檢索質(zhì)譜庫（NIST11）、核對保留指數(shù)及嗅聞氣味特征定性，各成分的含量使用軟件按峰面積歸一化法計(jì)算而得，結(jié)果見表1。

2.1 GC-MS 分析

由表1 可知，從少花桂葉中共鑒定出88 種化合物，其中采用極性柱（DB-WAX）鑒定出74 種物質(zhì)，采用弱極性柱（DB-5）鑒定出57 種物質(zhì)。少花桂葉的揮發(fā)性成分主要由萜類化合物組成，其中單萜類27 種，倍半萜類40 種，還包括其它化合物21 種。

表1 少花桂葉頂空固相微萃取/GC-MS 及GC-O 分析結(jié)果Table 1 Experimental results of analysis of Cinnamomum pauciflorum Nees by headspace solid-phase microextraction/ GC-MS and GC-O

續(xù)表 1

從極性柱中鑒定出單萜類24 種，含量占32.57%（用面積歸一化法計(jì)算，下同）；倍半萜類34 種，含量占32.44%。單萜類中，單萜烴類12 種，其中含量最高的為D-檸檬烯（0.88%），其次為α-水芹烯（0.73%）、α-蒎烯（0.69%）和δ-4-蒈烯（0.59%）；含氧單萜類12 種，含量最高的為芳樟醇（20.05%），其次為乙酸龍腦酯（2.13%）、1,8-桉葉油素（1.52%）和（Z）-氧化芳樟醇（1.04%）。倍半萜類中，含量最高的為β-石竹烯（5.61%），其次為δ-杜松烯（4.96%）、檀香萜（4.65%）、α-古巴烯（3.98%）、β-檀香萜（2.60%）、α-香檸檬烯（2.37%）和β-芹子烯（1.01%）。從極性柱中還鑒定出其它化合物16 種，含量占19.72%，其中含量最高的為香豆素（5.82%），其次為苯乙烯（3.21%）、水楊醛（2.78%）、鄰傘花烴（2.76%）、反式肉桂醛（2.42%）和丁香酚（1.09%）。

從弱極性柱中鑒定出57 種化合物，單萜類19 種，含量占15.16%；倍半萜類25 種，含量占3.34%。單萜類中，單萜烴類9 種，其中含量最高的為α-水芹烯（0.07%），其次為α-蒎烯（0.06%）、β-蒎烯（0.05%）和月桂烯（0.05%）；含氧單萜類10 種，含量最高的為芳樟醇（14.09%），其次為α-松油醇（0.25%）、乙酸龍腦酯（0.22%）和1,8-桉葉油素（0.13%）。倍半萜類中，含量最高的為檀香萜（1.42%），其次為δ-杜松烯（0.54%）、α-古巴烯（0.37%）、β-檀香萜（0.31%）和α-律草烯（0.12%）。從弱極性柱中還鑒定出其它化合物13 種，含量占2.05%，其中含量最高的為香豆素（1.42%），其次為反式肉桂醛（0.22%）、苯乙烯（0.12%）、水楊醛（0.08%）和丁香酚（0.08%）。

以上用極性柱和弱極性柱分析少花桂葉揮發(fā)性成分的結(jié)果基本一致，在少花桂葉揮發(fā)性成分中，兩種柱檢測含量最高的均為芳樟醇，其次為香豆素、δ-杜松烯、檀香萜、α-古巴烯、苯乙烯、β-檀香萜、反式肉桂醛、乙酸龍腦酯和1,8-桉葉油素。

由于少花桂葉中揮發(fā)性成分較復(fù)雜，同一種植物因生長地區(qū)與環(huán)境的不同，所含成分及含量會有差別，且分析方法不同也會對分析結(jié)果有顯著影響。程必強(qiáng)等[2]采用水蒸氣蒸餾萃取不同產(chǎn)地（四川筠連、湖北鄂西利川、西雙版納勐侖）少花桂鮮葉精油，用GC-MS 分析，其中，四川筠連少花桂葉精油中共檢出22 種化合物，主要成分為黃樟油素（69.70%）、芳樟醇（14.35%）、丁香酚（4.20%）、α-莰烯（1.28%）等；湖北鄂西利川少花桂葉精油中共檢出60 種化合物，主要成分為α-蒎烯（9.09%）、檸檬醛（8.70%）、香葉醇（6.03%）、乙酸香葉酯（4.94%）、黃樟油素（4.43%）、芳樟醇（4.19%）等；西雙版納勐侖少花桂葉精油中共檢出11 種化合物，主要成分為黃樟油素（99.26%）。錢正強(qiáng)等[3]采用水蒸氣蒸餾萃取采自云南省威信縣3 個(gè)不同葉齡（當(dāng)年生葉、1 年生葉和2 年以上生葉）的少花桂鮮葉精油，用GC-MS 分析，檢測和鑒定出26 個(gè)揮發(fā)性組分，其中最主要的揮發(fā)性組分為黃樟油素（3 個(gè)不同葉齡含量均＞ 95%），其次為芳樟醇、1,8-桉葉油素、樟腦等。先靜緘等[5]利用超臨界CO2萃取貴州省晴隆縣少花桂鮮葉葉油并經(jīng)GCMS 分析，共檢測和鑒定出16 種組分，主要化學(xué)成分為黃樟油素（89.44%）、6-甲氧基丁香酚（4.42%）、丁香酚（1.15%）、芳樟醇（0.71%）等。

本實(shí)驗(yàn)從少花桂葉中共鑒定出88 種揮發(fā)性組分，雙柱（極性柱、弱極性柱）定量結(jié)果中含量最高的均為芳樟醇（＞14%）。本實(shí)驗(yàn)鑒定出較多未報(bào)道的揮發(fā)性成分，其中，以倍半萜類占最多，如順式-β-金合歡烯、環(huán)苜蓿烯、α-古蕓烯、β-波旁烯、β-檀香萜、A-二去氫菖蒲烯、桉油烯醇等。本文所得結(jié)果與以往研究的不同，可能是由于本文采用頂空固相微萃取處理風(fēng)干的少花桂葉，然后直接進(jìn)行GC-MS 分析，而報(bào)道的文獻(xiàn)多是先提取少花桂鮮葉得到精油，再經(jīng)氣相色譜或GC-MS 進(jìn)行分析，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性組分減少及其含量發(fā)生變化。

與少花桂同種同屬（樟科樟屬）的其他植物不同，本研究中少花桂葉的主要揮發(fā)性成分是芳樟醇，而Farias 等[24]研究S?o Luís 和Santa Inês 兩種錫蘭肉桂（Cinnamomum verumJ.Presl）葉精油的組成，前者主要成分為丁香酚（93.6%），后者的主要成分為苯甲酸芐酯（95.3%）。Dong[25]與賈春曉[26]等報(bào)道肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）中主要揮發(fā)性成分是反式肉桂醛。李海泉等[27]采用超臨界CO2萃取陰香（Cinnamomum burmanni）葉揮發(fā)油，GC-MS 分析鑒定出33 種化合物，主要成分為龍腦（47.23%）和香豆素（13.20%）。王藝蓓等[28]采用無溶劑微波輔助萃取法和傳統(tǒng)水蒸餾法萃取油樟葉（Cinnamomum longipaniculatum（Gamble）N.Chao）精油，GCMS 分析主要成分均為1,8-桉葉油素。

2.2 GC-O 分析

GC-O 檢測結(jié)果中，嗅聞到的氣味主要有辛香、肉桂香、柑橘香、麝香、木香和水果香等。香氣活性成分主要為萜類化合物。單萜類8 種，包括α-水芹烯、γ-萜品烯、1,8-桉葉油素、（Z）-氧化芳樟醇、芳樟醇、4-萜品醇、橙花醇和乙酸龍腦酯，其中氣味強(qiáng)度最大的化合物為芳樟醇（氣味強(qiáng)度均為4），其次為4-萜品醇（氣味強(qiáng)度為3）、乙酸龍腦酯（氣味強(qiáng)度為3）和1,8-桉葉油素（氣味強(qiáng)度為2）。倍半萜類5 種，包括α-蓽澄茄烯、α-古巴烯、β-檀香萜、β-石竹烯和δ-杜松烯，其中β-檀香萜的氣味強(qiáng)度為3，α-古巴烯、β-石竹烯和δ-杜松烯的氣味強(qiáng)度均為2。還包括其它化合物10 種，包括苯乙烯、苯丙醛、水楊醛、胡椒酚、反式肉桂醛、丁香酚、乙酸肉桂酯、香豆素、肉桂酸乙酯和月桂酸乙酯，其中氣味強(qiáng)度最大的化合物為反式肉桂醛（氣味強(qiáng)度為4），其次為肉桂酸乙酯（氣味強(qiáng)度為3）、丁香酚（氣味強(qiáng)度為2）、乙酸肉桂酯（氣味強(qiáng)度為2）和月桂酸乙酯（氣味強(qiáng)度為2）。采用直接強(qiáng)度法GC-O 分析時(shí)，氣味強(qiáng)度越大，對總體香氣貢獻(xiàn)越大。在少花桂葉香氣活性成分分析中，氣味強(qiáng)度最大的化合物為反式肉桂醛和芳樟醇（氣味強(qiáng)度均為4），其次為4-萜品醇、乙酸龍腦酯、β-檀香萜和肉桂酸乙酯（氣味強(qiáng)度均為3）。

本研究中對少花桂香氣貢獻(xiàn)大的為反式肉桂醛和芳樟醇，Bongiovanni1 等[29]采用水蒸氣蒸餾法萃取肉桂的皮、葉和嫩枝精油，經(jīng)芳香提取物稀釋（aroma extract dilution analysis，AEDA）GC-O 檢測到26 種香氣活性成分，其中苯丙醛、反式肉桂醛、愈創(chuàng)木酚、苯乙醇、乙酸肉桂酯、2-乙酰苯甲醛和苯乙酮具有較高FD 值（Log2FD ≥10）對香氣貢獻(xiàn)大，Sandner 等[30]采用索氏提取法萃取肉桂嫩芽，經(jīng)硅膠分離，用GC-MS 及GC-O 檢測，共鑒定出36 種化合物，對肉桂芽香氣貢獻(xiàn)大的化合物為肉桂醛、苯乙醇和肉桂醇。由此可見，肉桂醛很可能為少花桂及同種屬的其他植物中的共有香成分。

3 結(jié)論

采用HP-SPME/GC-MS 分析少花桂葉，極性和弱極性兩種柱共鑒定出88 種揮發(fā)性成分，含量高（＞1%）的成分均為芳樟醇、香豆素、δ-杜松烯、檀香萜、α-古巴烯、苯乙烯、β-檀香萜、反式肉桂醛、乙酸龍腦酯和1,8-桉葉油素等。GC-O 檢測到23 種化合物有氣味活性，從氣味強(qiáng)度看（氣味強(qiáng)度≥3），反式肉桂醛、芳樟醇、4-萜品醇、乙酸龍腦酯、β-檀香萜和肉桂酸乙酯對少花桂的總體香氣貢獻(xiàn)大。本試驗(yàn)采用MS、保留指數(shù)、嗅聞氣味的方法對少花桂葉的香氣成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果更加準(zhǔn)確可信，可為少花桂開發(fā)利用提供參考。