SPME-GC-MS 結(jié)合ROAV 分析腐乳中的主體風(fēng)味物質(zhì)

樊 艷

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023）

腐乳是我國的傳統(tǒng)豆制品之一，由微生物發(fā)酵制得，一直以來以其獨(dú)特的風(fēng)味和醇厚的口感廣受消費(fèi)者的喜愛。其釀造史至今已有1000 多年[1]，產(chǎn)地分布廣泛，種類繁多，按其色澤分有紅腐乳、白腐乳、青腐乳等。雖然各地釀制的豆腐乳品種多樣，但其釀造工藝流程基本無差別，主要由制霉胚、腌制、加調(diào)料、裝壇、密封、發(fā)酵等6 個(gè)步驟組成[1]，不過因其所用配料不同，故產(chǎn)品之間風(fēng)味各異。

近年來，學(xué)者對腐乳的研究主要集中在菌種[2]、營養(yǎng)成分[3]和風(fēng)味物質(zhì)這幾個(gè)方面。腐乳發(fā)酵過程是一個(gè)復(fù)雜的生化過程[4-5]，Wei 等[6]的研究結(jié)果表明油腐乳的風(fēng)味物質(zhì)形成的主要途徑有分解代謝和外源遷移，在腐乳發(fā)酵期間蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)在酶解作用下經(jīng)微生物分解代謝轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)，腐乳生產(chǎn)過程加入的辣椒、花椒和鹽等輔料中的化合物會(huì)在后發(fā)酵階段遷移至腐乳胚中，進(jìn)一步參與發(fā)酵產(chǎn)生某些風(fēng)味物質(zhì)，大部分的揮發(fā)性物質(zhì)具有獨(dú)特的香氣，這些物質(zhì)共同賦予了腐乳獨(dú)特的風(fēng)味和滋味。胡文康等[7]比較分析了3 種不同類型腐乳中揮發(fā)性成分，結(jié)果表明用頂空固相微萃取提取揮發(fā)性成分可鑒定出102 種物質(zhì)，紅方腐乳含量較高的風(fēng)味物質(zhì)有11 種，白方和青方腐乳的特征風(fēng)味物質(zhì)之一分別是茴香腦和吲哚；王倫興等[8]利用SPME-GCMS 聯(lián)用技術(shù)分析了茶香腐乳和紅腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共檢測出104 種化合物，茶香腐乳所檢出的風(fēng)味成分?jǐn)?shù)量比紅腐乳多6 種；蔣麗婷等[9]采HSSPME/GC-MS 分別對白腐乳的湯汁和腐乳塊進(jìn)行測定，得到的結(jié)論是腐乳塊中揮發(fā)性成分的檢出量和檢出率均大于湯汁；Xiao 等[10]采用GC-O/AEDA 和ROAV 評價(jià)各風(fēng)味物質(zhì)對腐乳總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，結(jié)果表明丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、反-2,4-癸二烯醛和2,6-二甲基吡嗪為腐乳的特征風(fēng)味物質(zhì)。

風(fēng)味是評價(jià)加工產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[11]。在各種食品中鑒定出的所有揮發(fā)性化合物中僅有一小部分是食品總體風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)者，大部分沒有顯著影響，而這些對食品風(fēng)味有關(guān)鍵作用的化合物被定義為該食品的主體風(fēng)味物質(zhì)或關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[12]。ROAV 法是確定食品主體風(fēng)味物質(zhì)的一種新方法[12]，目前用ROAV 法確定腐乳關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的研究還很少。鑒于傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品之一的腐乳，其家庭作坊式發(fā)酵工藝仍然有一定市場，本文選用2 種自制腐乳和2 種市購腐乳為原料，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）檢測揮發(fā)性物質(zhì)，計(jì)算ROAV 值找到關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，分析比較兩者的異同點(diǎn)，探討家庭作坊制作的腐乳其風(fēng)味組成和主要風(fēng)味物質(zhì)，旨在為研究腐乳的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的機(jī)理和控制及優(yōu)化腐乳的生產(chǎn)加工提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

用于自制腐乳的豆腐 本地某菜場，兩種腐乳的編號分別為M1、M2；毛霉菌菌粉 濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；腐乳 本地某超市，為兩種不同品牌的紅方腐乳，編號分別為C1 和C2。

Avanti J-26 臺式離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；含SPME 裝置的多功能樣品處理平臺 德國Gerstel 公司；SPME 萃取頭（50/30um DVB/CAR/PDMS）美國Supelco 公司；7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腐乳樣品的制作 參考杭梅等[13]的制作方法，稍作修改，將豆腐切成4 cm×4 cm×1.5 cm 大小，上鍋蒸5 min 后放置涼透。稱取15 g 毛霉菌菌粉，加入500 mL 水，攪拌均勻，切好的豆腐塊間隔（約1 cm）擺放在蒸鍋上，將配好的菌懸液均勻噴灑至豆腐塊的各表面，鍋底加水，蓋好蓋子，在室溫20 ℃條件下，1 d開始長毛，發(fā)酵3 d 后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。稱取1 000 g 毛豆腐，風(fēng)干去除水滴，蘸上40 g 的52度白酒，裹上50 g 鹽、15 g 辣椒粉和1.6 g 花椒粉[1]，入瓶，M1 樣品添加10 mL 食用油封面，M2 未用油封面，于陰涼處避光密封儲存一周即可食用。

1.2.2 風(fēng)味物質(zhì)的分離 SPME 設(shè)置：精確稱取3 g樣品加入20 mL 頂空瓶中，多功能樣品處理平臺保溫箱溫度是60 ℃，平衡時(shí)間10 min，萃取時(shí)間30 min，250 ℃下解析時(shí)間300 s，并設(shè)定每次進(jìn)樣前老化萃取頭的程序，老化溫度260 ℃，老化時(shí)間30 min（初次老化時(shí)間120 min）[14]。

GC-MS 條件：參考崔曉紅等[15]的方法，選用DB-5 MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣He（純度≥99.999%）；載氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 升到80 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min 升到200 ℃，保持20 min。傳輸線溫度是280 ℃，離子源是EI，離子源溫度是230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量是70 eV，數(shù)據(jù)采集模式為全掃描（Scan），質(zhì)量掃描范圍m/z 30～450 amu。

1.2.3 風(fēng)味物質(zhì)的鑒定 揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量：氣質(zhì)聯(lián)用得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)與NIST08.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索鑒定，將匹配度大于90 的作為定性依據(jù)之一，將計(jì)算得到保留指數(shù)（retention index，RI）值與其他文獻(xiàn)測定的RI 值進(jìn)行對比確認(rèn)，進(jìn)一步對腐乳的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性[16]；采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量，計(jì)算得到各風(fēng)味物質(zhì)的相對含量。

RI 值的測定：取正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（C7～C40），濃度為500 mg/L，稀釋100 倍，進(jìn)樣量1 μL，分流比10:1，溶劑延遲時(shí)間5 min，其余參數(shù)同上。計(jì)算公式[17]為

式中，tx是待測組分的保留時(shí)間，min；tn是碳原子數(shù)為n 的正烷烴（tn＜tx）的保留時(shí)間，min；tn+1是碳原子為n+1 的正烷烴（tx＜tn+1）的保留時(shí)間，min。

主體風(fēng)味物質(zhì)的評價(jià)方法：主體風(fēng)味物質(zhì)采用ROAV 法評價(jià)各揮發(fā)性成分對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，計(jì)算公式為

式中，C%x、Tx是各揮發(fā)性成分的相對百分含量和相對應(yīng)的感覺閾值；C%stan、Tstan是對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分的相對百分含量和相對應(yīng)的感覺閾值。

ROAV 值越大的成分對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大，1≤ROAV≤100 的成分為樣品的主體風(fēng)味化合物，0.1≤ROAV＜1 的成分被認(rèn)為是對樣品總體風(fēng)味具有重要修飾作用的化合物[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文采用Excel 2007、Origin pro 2018C 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性物質(zhì)的分析

通過對4 種腐乳樣品揮發(fā)性物質(zhì)采用SPMEGC-MS 聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，共測出74 種揮發(fā)性化合物，腐乳樣品的總離子流色譜圖（total ion current of chromatograms,TIC）如圖1 所示，本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的參數(shù)能較好分離這些揮發(fā)性物質(zhì)。

圖1 腐乳揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current of chromatograms of flavor substances in Sufu

通過GC-MS 檢測分析，對4 種腐乳樣品的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)（表1），結(jié)果表明4 種腐乳揮發(fā)性物質(zhì)的種類和相對含量都有明顯差異，自制腐乳M1 和M2 中風(fēng)味物質(zhì)種類較市購腐乳C1 和C2 豐富。M1 共鑒定出36 種揮發(fā)性物質(zhì)，相對含量最高的為烯烴類物質(zhì)，其中萜烯類物質(zhì)3-蒈烯占了43.81%；M2 共鑒定出31 種揮發(fā)性物質(zhì)，相對含量最高的為醚類物質(zhì)，其中茴香腦占了44.91%，是其他腐乳相對含量的2～374 倍；烴類物質(zhì)是在M1 和M2 中被檢出揮發(fā)性物質(zhì)中種類和含量都較高的成分。C1 和C2 共鑒定出揮發(fā)性物質(zhì)分別為27 種和14 種，二者中檢出的乙醇是相對含量最高的醇類物質(zhì)，分別為58.70%和59.45%。C1 和C2 中的酯類物質(zhì)相對含量較M1 和M2 檢出率高，分別為13.03%和39.93%。

表1 4 種腐乳揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS 鑒定結(jié)果Table 1 Identification of aroma compounds in four kinds of fermented soybean curd by GC-MS

續(xù)表 1

根據(jù)腐乳中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)繪制韋恩圖（圖2），可見4 種不同腐乳間的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量區(qū)別均較大。共有的風(fēng)味物質(zhì)只有茴香腦1 種；M1、C1 和C2 共有風(fēng)味物質(zhì)有2 種，分別是癸酸乙酯和棕櫚酸乙酯；C1 和C2 共有風(fēng)味物質(zhì)有5 種，分別是乙醇、月桂酸乙酯、亞油酸甲酯、9-十八酸乙酯和油酸乙酯；M1 和C1 共有風(fēng)味物質(zhì)有3 種，分別是苯乙醇、1,2,3,4,4a,5,6,8a-十八氫-7-甲基-4-亞甲基-1-（1-甲基乙基）-萘和2,6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯；M2 和C1 共有風(fēng)味物質(zhì)有2 種，分別是（-）-α-蒎烯和（S）-β-沒藥烯；M1、M2 和C1 共有風(fēng)味物質(zhì)有6 種，分別是（1S,8aR）-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘、（1S-順式）-1,2,3,4-四氫-1,6-二甲基-4-（1-甲基乙基）-萘、β-石竹烯、α-木烏龍烯、正十五烷和正十七烷；M1 和M2 共有風(fēng)味物質(zhì)有8 種，分別是4-異丙基甲苯、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1,4-環(huán)己二烯、3-蒈烯、（4aS-順式）-2,4a，5,6,7,8,9,9a-八氫-3,5,5-三甲基-9-亞甲基-1-苯并環(huán)庚烯、順式-（-）-2,4a,5,6,9a-六氫-3,5,5,9-四甲基（1H）苯并環(huán)庚烯、（R）-β-雪松烯、正十四烷和正十六烷。

2.2 主體風(fēng)味物質(zhì)的分析

風(fēng)味物質(zhì)的相對含量的高低并不能說明其對樣品整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，還需結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的閾值進(jìn)行評價(jià)，不同化合物的閾值不同，一些風(fēng)味物質(zhì)雖然相對含量很低，但由于其閾值低，對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)也很大[20]，當(dāng)其相對含量一定時(shí)，閾值越低的化合物越容易被嗅覺器官感知[21]。通過查閱書籍及相關(guān)文獻(xiàn)中已報(bào)道的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的香味閾值，共找到25 種揮發(fā)性物質(zhì)的氣味閾值（表2）。因此，本實(shí)驗(yàn)只對查到閾值的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。茴香腦是M1 和M2 中相對含量最高且閾值較低的風(fēng)味物質(zhì)，對這兩個(gè)樣品的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，因此定義茴香腦為M1 和M2 的主體風(fēng)味物質(zhì)（Tstan=100）；乙醇是C1 和C2 中相對含量最高的物質(zhì)，但閾值較高，所以定義相對含量較高且閾值較低的茴香腦和棕櫚酸乙酯分別為C1 和C2 中風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的物質(zhì)（Tstan=100）。

按1.2.3 計(jì)算ROAV 值，結(jié)果見表2，乙醇、苯酚、茴香腦、β-石竹烯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、水楊酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯和油酸乙酯是4 種腐乳的主體風(fēng)味物質(zhì)，大部分為酯類，這和Chung[28]的研究結(jié)果一致。對腐乳的整體風(fēng)味有重要修飾作用的風(fēng)味物質(zhì)分別為苯乙醇、1-甲基-4-(1-甲基亞乙基)環(huán)己烯、對傘花烴、草蒿腦、二氫獼猴桃內(nèi)酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯。

醇類物質(zhì)大多具有令人愉快的氣味[29]，C1 和C2中檢測出的乙醇含量較高，酒香明顯，這與蔣芳芳[30]的研究結(jié)果一致，是C2 的主體風(fēng)味物質(zhì)，而M1 和M2 中的醇類物質(zhì)檢出量低，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)對這兩種自制腐乳（湯汁較少）的采樣多為腐乳固形物。M1 和C1 中檢測出的苯乙醇是由蛋白質(zhì)水解成的苯丙氨酸在酶解作用下代謝生成的，賦予了腐乳花甜香味，對M1 的整體風(fēng)味有一定的修飾作用。

芳香族物質(zhì)中的苯酚在白腐乳中也有報(bào)道[28]，可以防腐、殺菌，能夠延長腐乳的保質(zhì)期，可能來源于酪氨酸的分解[31]，也可能是腐乳發(fā)酵過程中由木質(zhì)素配糖體降解生成的[32]，賦予了M1 甜香味，是其主體風(fēng)味物質(zhì)；對傘花烴對M1 的整體風(fēng)味有重要修飾作用。2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚是C1 的主體風(fēng)味物質(zhì)，賦予了其堅(jiān)果香味。

烴類物質(zhì)（萜烯類化合物除外）的產(chǎn)生可能和脂肪的分解有關(guān)[33]，本實(shí)驗(yàn)檢測到的烴類物質(zhì)包含長鏈烷烴和烯烴，烷烴類物質(zhì)由于其分子量大，且氣味閾值較高[34]，香氣特征一般不顯著，所以對腐乳的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，Shahidi 等[35]認(rèn)為飽和烴和不飽和烴在食品風(fēng)味形成過程中發(fā)揮的作用均不大，故此處不展開分析，而烯烴類物質(zhì)中的萜烯類化合物閾值較低，具有花香、果香味，對總體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，M1 和M2 中萜烯類物質(zhì)種類豐富且相對含量較高，其中3-蒈烯多用于食用香精的配方[36]，可能與加入的香辛料有關(guān)，β-石竹烯是合成香料的原料，在M1、M2 和C1 中的ROAV 值均大于1，賦予了其辛香、木香味，是主體風(fēng)味物質(zhì)；(S)-β-沒藥烯具有木香、柑橘香、花香、果香、青香。

醚類物質(zhì)主要來自于香辛料，具有強(qiáng)烈而愉快的香氣[37]。茴香腦是4 種腐乳種共同檢出的醚類物質(zhì)，且相對含量較高且氣味閾值低，具有茴香、辛香料、甘草氣味。這與胡文康等[7]的研究結(jié)果一致；草蒿腦對M2 的整體風(fēng)味有重要的修飾作用；間苯二甲醚賦予了M2 甜香、藥香、果香和啤酒香香氣。

酯類物質(zhì)中多數(shù)小分子量的酯類化合物氣味閾值低，具有獨(dú)特氣味，對腐乳的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，脂肪酸酯類物質(zhì)的產(chǎn)生與腐乳發(fā)酵過程中醇和脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)有關(guān)[7,38-39]。分子量較大的酯類化合物閾值較高，但它們在腐乳中的濃度高于小分子量的酯類，所以對腐乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)很大。本實(shí)驗(yàn)中檢出的乙酯類物質(zhì)種類較多，且含量也較高，其中3-苯丙酸乙酯和水楊酸甲酯在M1 中的ROAV 值較大，分別賦予了樣品花香、果香和草藥香味[22]；棕櫚酸乙酯賦予了C1 奶油和酯香味；油酸乙酯賦予了C2 可可香味。

2.3 主體風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

進(jìn)一步比較這4 種腐乳主體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的異同，本實(shí)驗(yàn)選取對腐乳揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3，根據(jù)特征值大于1 的原則[36]，共提取到2 個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)98.59%。

表3 主成分的特征值及其貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of the principal components

風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷圖如圖3 所示，市購腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如乙醇和棕櫚酸乙酯，與主成分2 呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)，而自制腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如茴香腦、γ-壬內(nèi)酯、3-苯丙酸甲酯、水楊酸甲酯和β-石竹烯，與主成分2 呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，表明這兩類腐乳的主體風(fēng)味物質(zhì)的組成及相對含量有差異性，這可能與腐乳所使用的的原輔料及加工工藝有關(guān)。結(jié)合圖3 可知，乙醇是C1 和C2 整體風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)；茴香腦是M1 和M2 整體風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。

圖3 主體風(fēng)味物質(zhì)的主成分載荷圖Fig.3 Principal component analysis loading plot of the key flavor compounds

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用SPME-GC-MS 技術(shù)，從4 種腐乳中共檢測出74 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包含醇類、芳香族類、烯烴類、烷烴類、醚類、酯類和酮類化合物等；結(jié)合ROAV 探討4 種腐乳的主體風(fēng)味物質(zhì)，分別是乙醇、苯酚、茴香腦、β-石竹烯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、水楊酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯和油酸乙酯這；借助主成分分析知道茴香腦是M1 和M2 最主要的風(fēng)味物質(zhì)，乙醇是C1 和C2 最主要的風(fēng)味物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自制腐乳和市購腐乳在主體風(fēng)味物質(zhì)及其相對含量上存在差異性，這可能與所用原輔料和加工工藝不同有關(guān)。研究結(jié)果將為腐乳特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理的研究以及生產(chǎn)加工提供理論支撐。本研究由于實(shí)驗(yàn)條件所限，未能采用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，今后可在樣品的前處理和檢測方法的多樣性上展開研究。