石墨烯/四氧化三鈷電化學(xué)傳感器的建立及餅干中香蘭素檢測(cè)分析

司曉晶，韓婧婷，朱文菁，黃 玥，白 晨，馬穎清

（1.上海商學(xué)院食品系，上海 200235；2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708）

香蘭素，作為一種食品工業(yè)中常用的增香劑，已滲透進(jìn)我們的日常飲食中，常用作巧克力、冰激凌、糖果、餅干、蛋糕、面包等的添加劑[1]。香蘭素氣味濃郁，新生兒若長(zhǎng)期攝入可能對(duì)其形成依賴性，并養(yǎng)成挑食的習(xí)慣，同時(shí)還可能對(duì)其腸胃有一定的副作用，影響正常的生長(zhǎng)發(fā)育，過量食用會(huì)造成頭暈惡心、嘔吐腹瀉等癥狀，甚至影響人體腎臟和肝臟的工作[2]。各個(gè)國(guó)家都對(duì)香蘭素的添加量嚴(yán)格管控，我國(guó)在GB 2760-2014 食品用香料使用中規(guī)定，香蘭素嚴(yán)禁加入6 個(gè)月以內(nèi)嬰幼兒奶粉及一些殺菌乳等奶制品中，然而目前尚未制定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[3]，所以建立快速有效簡(jiǎn)便的香蘭素檢測(cè)方法尤為必要。

目前主要的香蘭素檢測(cè)方法有紫外分光光度法[4-5]、熒光分光光度法[6]、拉曼光譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]和高效液相色譜法[9-11]及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法等[12-14]。但這些方法存在前處理過程繁瑣、設(shè)備儀器昂貴或靈敏度、準(zhǔn)確性不高等問題。然而，近年來電化學(xué)分析方法的快速發(fā)展及其表現(xiàn)出的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，促使人們?cè)桨l(fā)傾向于采用此法對(duì)香蘭素進(jìn)行檢測(cè)[15-19]。

石墨烯（graphene，GR），因其具有大的比表面積、良好的機(jī)械性能和電子傳遞效率，在電化學(xué)傳感器方面，有較好應(yīng)用基礎(chǔ)和前景[20-22]。Co、Ni、Au、Cu 等都是當(dāng)今研究較深入的應(yīng)用于電催化的金屬，這些金屬元素在電化學(xué)反應(yīng)中具有較高催化能力、較大表面積和較高熱穩(wěn)定性，因而在電化學(xué)領(lǐng)域中極具潛力[23-25]。所以，本文先將GR 滴涂到裸的玻碳電極（glass carbon electrode，GCE）表面，再在Co（COOH）2溶液中通過循環(huán)伏安法（Curve of cyclic voltammetry，CV）電聚合，得到Co3O4/GR/GCE 修飾電極，作為香蘭素檢測(cè)的電化學(xué)傳感器，由于該傳感器測(cè)得的電信號(hào)與香蘭素的濃度呈一定相關(guān)性，因此可實(shí)現(xiàn)香蘭素定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GR（單層，片徑0.5～5 μm，厚度約0.8 nm，物理法制得）南京先豐納米材料科技有限公司；甘氨酸、丙氨酸、精氨酸等氨基酸 探索平臺(tái)；香蘭素、無水乙醇、濃硫酸、乙酸鈷等試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水 為實(shí)驗(yàn)用水；0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS）為支持電解質(zhì)溶液；袋裝原味夾心餅干 超市。

CHI 660D、842B 電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；S-4800 掃描電鏡 日本HITACHI 公司；KQ 218 型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；FA2204B 分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電化學(xué)傳感器的制備 GCE 預(yù)處理：將GCE作為工作電極，在麂皮板上用0.05 μm 的Al2O3粉末打磨拋光，依次用無水乙醇、超純水超聲清洗5 min，0.5 mol/L H2SO4溶液中-1～1 V 電位窗下CV 法活化10 圈，超純水沖洗干凈。

稱取2 mg 的GR 分散在2 mL 的超純水中，100 W，40 kHz 下超聲2 h 分散均勻得到濃度為1 mg/mL的GR 分散液。滴涂在預(yù)處理后的GCE 上，紅外干燥燈下干燥40 min，得到GR/GCE 修飾電極。接著將GR/GCE 電極放入含有0.02 mol/L Co（COOH）2溶液中，-0.8～1.6 V 電位窗下，CV 法電聚合20 圈，即得到復(fù)合修飾電極Co3O4/GR/GCE。在這個(gè)步驟中，Co(COOH)2因發(fā)生電化學(xué)氧化反應(yīng)生成Co3O4，金屬Co 納米粒子的聚合使該修飾電極的電化學(xué)性能得到很大的提高[26]。制備結(jié)束后，將修飾好的電極用超純水小心清洗，以便進(jìn)一步使用。對(duì)得到的GR/GCE 和Co3O4/GR/GCE 修飾電極進(jìn)行電子掃描電鏡（Scanning electron micrograph，SEM）表征。

同時(shí)，另取一支干凈的GCE 于0.02 mol/L Co(COOH)2溶液中，-0.8～1.6 V 電位窗下，CV 法聚合20 圈得到Co3O4/GCE 修飾電極，超純水清洗后備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)樣品的預(yù)處理 稱取5 g 餅干充分研磨成粉末，溶解于10 mL 去離子水中，100 W，40 kHz下10 min 使充分溶解，然后將懸浮液放在離心機(jī)中以3000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心2 次，取上清液備用。

1.2.3 測(cè)定方法 采用以飽和甘汞電極為參比電極、鉑電極為輔助電極、Co3O4/GR/GCE 修飾電極為工作電極的三電極系統(tǒng)，在0～1.0 V 電位范圍內(nèi)，研究掃描速度不斷增加下香蘭素響應(yīng)電信號(hào)變化情況以確定香蘭素在Co3O4/GR/GCE 修飾電極上的響應(yīng)機(jī)理，用差分脈沖伏安法（Differential Pulse Voltammetry，DPV）測(cè)定不同PBS 緩沖溶液的pH 對(duì)香蘭素電信號(hào)影響情況，在最優(yōu)的pH 條件下研究GR 滴涂量和Co(COOH)2聚合圈數(shù)的改變下香蘭素的電化學(xué)行為，建立香蘭素的最終實(shí)驗(yàn)條件。在該最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下DPV 檢測(cè)Co3O4/GR/GCE 修飾電極對(duì)不同濃度香蘭素的電信號(hào)，香蘭素濃度為橫坐標(biāo)，電信號(hào)為縱坐標(biāo)確定香蘭素線性范圍和檢出限及進(jìn)行實(shí)際樣品中香蘭素含量測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5 次，數(shù)據(jù)處理使用軟件：OriginPro2015。

2 結(jié)果與分析

2.1 Co3O4/GR/GCE 修飾電極的形貌表征

對(duì)GR 和制備的Co3O4/GR 導(dǎo)電聚合物分別進(jìn)行電子掃描電鏡（Scanning electron micrograph，SEM）表征，對(duì)比其相貌特征觀察GR 的褶皺形態(tài)及Co3O4是否已成功聚合在玻碳電極表面。圖1A 是修飾前的GR 在1 μm 下的SEM 圖，呈現(xiàn)出如絲綢般光滑的片狀形態(tài)，圖1B 展示了是Co（COOH）2電聚合到GR 后，形成的Co3O4/GR 納米復(fù)合物在1 μm下的微觀形貌，可以明顯觀察到Co3O4納米顆粒呈球狀均勻附著在GR 表面，同時(shí)也說明GR 是一種理想的納米材料，能夠固定吸附交聯(lián)住金屬納米粒子，GR 大的比表面積提供了Co3O4納米顆粒均勻結(jié)晶、附著和生長(zhǎng)的良好環(huán)境。因此通過GR 修飾前后的SEM 圖，表明Co3O4和GR 已成功聚合。

圖1 GR(A)和Co3O4/GR(B)的掃描電鏡對(duì)比圖Fig.1 SEM of GR(A) Co3O4/GR(B)

2.2 香蘭素在Co3O4/GR/GCE 修飾電極上的電化學(xué)行為

為了比較幾種不同修飾電極對(duì)香蘭素的電化學(xué)行為，在本實(shí)驗(yàn)中比較了裸 GCE（a）、Co3O4/GCE（b）、GR/GCE（c）和 Co3O4/GR/GCE（d）在20 μmol/L 香蘭素的0.1 mol/L pH=4.5 的PBS 溶液中響應(yīng)值的大小，圖2 是各種修飾電極的DPV 圖，其電流響應(yīng)值Ip分別是1.059、1.292、2.049、和3.150 μA。香蘭素在裸GCE 上雖有電流響應(yīng)，但響應(yīng)值Ip很小，分別以GR 和Co（COOH）2修飾后，Ip明顯增加，但當(dāng)Co（COOH）2和GR 同時(shí)修飾到GCE 上時(shí)，香蘭素的氧化電流值最大，Ip為3.150 μA，幾乎具有累加的效果，而且是裸GCE 對(duì)香蘭素響應(yīng)值（Ip=1.059 μA）的3 倍。這些數(shù)據(jù)說明，GR 和Co3O4的結(jié)合可以有效增大比表面積，提高電化學(xué)傳感器的電子傳導(dǎo)率和檢測(cè)樣品的靈敏度，Co3O4/GR/GCE 修飾電極作為香蘭素的電化學(xué)傳感器是可行的。

圖2 20 μmol/L 的香蘭素在不同電極上的DPV 圖Fig.2 DPVs of different elctrodes with 20 μmol/L vanillin

為了研究香蘭素在Co3O4/GR/GCE 修飾電極上的機(jī)理，在0.02～0.22 V/s 的掃描速率下使用CV 法對(duì)含有20 μmol/L 香蘭素的pH=4.5 的PBS 溶液進(jìn)行測(cè)定（圖3），香蘭素的Ip隨著掃速增加而增大，且電位正向移動(dòng)，這說明兩者的電化學(xué)氧化反應(yīng)是不可逆的[26]。圖4 為在pH=4.5 PBS 溶液中Co3O4/GR/GCE 的掃速（ν1/2）和對(duì)20 μmol/L 香蘭素電流響應(yīng)的關(guān)系圖?？梢杂^察到在0.02～0.22 V/s的速率范圍內(nèi)，香蘭素的Ip與掃速ν1/2成正相關(guān)，線性方程表示為Ip（μA）=6.9759ν1/2+0.3574（R2=0.999），這表明該電極受擴(kuò)散控制。

圖3 20 μmol/L 香蘭素在Co3O4/GR/GCE 上不同掃速(0.02～0.22 V/s)的CV 曲線圖Fig.3 CVs of the Co3O4/GR/GCE containing 20 μmol/L Vanillin with scan rate ranging from 0.02 to 0.22 V/s

圖4 Ip 與υ1/2 間的線性關(guān)系圖Fig.4 Plots of peak current vs.the square root of scan rate

2.3 對(duì)Co3O4/GR/GCE 傳感器參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 緩沖液pH 的影響 支持電解質(zhì)溶液為PBS緩沖溶液，其pH 在一定程度會(huì)影響修飾電極的性能。圖5A 為pH 從3.5 到5.5 變化時(shí)，Co3O4/GR/GCE對(duì)20 μmol/L 香蘭素Ip的響應(yīng)情況?？梢钥吹絧H 從3.5 增大到4.5，Ip也隨之增大。但pH 若繼續(xù)增大，則Ip出現(xiàn)下降趨勢(shì)。即當(dāng)pH=4.5 時(shí)，Ip達(dá)到最高峰，因此，設(shè)定實(shí)驗(yàn)體系中PBS 緩沖溶液的pH為4.5。

2.3.2 GR 滴涂量的影響 通過改變滴涂GR 的修飾量來研究其對(duì)香蘭素氧化電流Ip的影響。圖5B是GR 的滴涂量從4.0 μL 增加到12.0 μL 對(duì)香蘭素Ip的影響?？梢杂^察到在4.0～8.0 μL 范圍內(nèi)，隨著GR 的滴涂量增加，香蘭素的Ip也呈增加趨勢(shì)，滴涂量為8.0 μL 時(shí)，香蘭素的Ip達(dá)到最高。然后當(dāng)GR 滴涂量繼續(xù)增加到10.0 μL 時(shí)，Ip陡然下降。因此，在最終實(shí)驗(yàn)中選擇滴涂8 μL 的GR 作為理想滴涂量。

2.3.3 Co（COOH）2聚合圈數(shù)的影響 導(dǎo)電聚合物修飾電極膜的厚薄一定程度取決于金屬溶液的聚合圈數(shù)的多少，聚合圈數(shù)越多，耗時(shí)越長(zhǎng)，膜也會(huì)變厚。圖5C 為電聚合0.02 mol/L Co（COOH）2溶液圈數(shù)由10 圈到30 圈變化時(shí)，對(duì)0.1 mol/L PBS（pH=4.5）中20 μmol/L 香蘭素的Ip的影響。由圖5C 中可以明顯發(fā)現(xiàn)，20 圈時(shí)Ip最大，但當(dāng)聚合超過20 圈時(shí)，Ip開始下降，這是由于Co3O4修飾膜過厚阻礙了電極表面電子的傳遞，因此，在Co（COOH）2溶液中電聚合20 圈為最優(yōu)條件。

圖5 Co3O4/GR/GCE 在含有20 μmol/L 香蘭素的條件優(yōu)化圖Fig.5 Optimizations of Co3O4/GR/GCE to 20 μmol/L anillin

2.4 香蘭素校正曲線

本文在最佳條件下利用DPV 對(duì)香蘭素進(jìn)行線性范圍和檢出限的測(cè)定。圖6A 顯示了在不斷攪拌條件下，Co3O4/GR/GCE 在0.1 mol/L PBS 溶液 (pH 4.5) 中連續(xù)加入不同濃度香蘭素所得的DPV 響應(yīng)曲線，其香蘭素濃度范圍為0.1～80 μmol/L。由圖6B，可以清楚發(fā)現(xiàn)香蘭素的Ip隨著其濃度的增加而增加，Co3O4/GR/GCE 修飾電極在0.1～80 μmol/L 濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性響應(yīng)，線性回歸方程：Ip（μmol/L）=0.1518C+0.5103（R2=0.997），檢出限為0.033 μmol/L（S/N=3）。

圖6 不同濃度的香蘭素在Co3O4/GR/GCE 上的電流響應(yīng)（A）和香蘭素的校準(zhǔn)曲線（B）Fig.6 DPVs of Co3O4/GR/GCE at different concentrations of vanillin(A) and vanillin calibration curve（B）

2.5 穩(wěn)定性和干擾性實(shí)驗(yàn)

同一支Co3O4/GR/GCE 修飾電極被用于在0.1 mol/L pH=4.5 PBS 連續(xù)平行測(cè)定20 μmol/L 香蘭素5 次來研究構(gòu)建的電化學(xué)傳感器的重復(fù)性。把該修飾電極置于4 ℃冰箱中保存14 d 后，再在相同條件下，平行測(cè)定香蘭素5 次，其Ip減少了3.78%，前后測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均小于2%，其結(jié)果見表1。結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Co3O4/GR/GCE 對(duì)香蘭素的檢測(cè)具有良好的穩(wěn)定性。

表1 Co3O4/GR/GCE 對(duì)香蘭素檢測(cè)的穩(wěn)定性Table 1 Reproducibility of vanillin on Co3O4/GR/GCE

為了評(píng)估Co3O4/GR/GCE 對(duì)高靈敏度檢測(cè)香蘭素的選擇性能，選擇了一些食品中常見的物質(zhì)加入含有20 μmol/L 香蘭素的0.1 mol/L PBS（pH=4.5）溶液中進(jìn)行檢測(cè)干擾程度分析。從表2 中可以清楚看出，2000 μmol/L 的NaCl、KCl，1000 μmol/L 的葡萄糖（glucose，Glu）、麥芽糖（sucrose，Suc），500 μmol/L濃度的甘氨酸（glycine，Gly）、丙氨酸（alanine，Ala）、精氨酸（arginine，Arg）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、亮氨酸（leucine，Leu）、賴氨酸（lysine，Lys）和檸檬酸（citric acid，CA）對(duì)香蘭素的檢測(cè)并沒有明顯干擾，在5%容限范圍以內(nèi)，證明了構(gòu)建的Co3O4/GR/GCE 電化學(xué)傳感器選擇性較好。

表2 干擾離子對(duì)Co3O4/GR/GCE 測(cè)定的香蘭素影響Table 2 Effect of interfering ions on vanillin measured by Co3O4/GR/GCE

2.6 實(shí)際樣品分析

準(zhǔn)確吸取100 μL 樣液在優(yōu)化條件下進(jìn)行DPV測(cè)定，通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)計(jì)算回收率，其結(jié)果見表3。表中數(shù)據(jù)顯示樣品中的香蘭素在Co3O4/GR/GCE上發(fā)生明顯的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，三次實(shí)驗(yàn)的平均回收率102.4%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.47%，證明Co3O4/GR/GCE構(gòu)建的電化學(xué)傳感器對(duì)于香蘭素檢測(cè)具有穩(wěn)定且可靠的電催化性能。

表3 餅干中香蘭素的測(cè)定（n=3）Table 3 Determination results of vanillin in cookie product (n=3)

3 結(jié)論

石墨烯高的機(jī)械強(qiáng)度、快速高效的傳熱性能及超高電導(dǎo)率的優(yōu)勢(shì)是大多材料不可比擬的，此外良好的生物兼容性使其能夠與很多材料進(jìn)行復(fù)合，其與金屬納米顆粒兩者之間的相互協(xié)同作用極大地提升了導(dǎo)電性和催化性，促進(jìn)了待測(cè)物和復(fù)合修飾電極表面在氧化還原過程中電子的傳遞和轉(zhuǎn)移。因此本工作制備的Co3O4/GR/GCE 修飾電極作為香蘭素的電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)待測(cè)物香蘭素的快速響應(yīng)，回收率和重現(xiàn)性結(jié)果都比較理想，并應(yīng)用于實(shí)際樣品中香蘭素含量檢測(cè)，開拓了石墨烯導(dǎo)電聚合物在食品添加劑中的檢測(cè)范圍，為香蘭素的檢測(cè)方法的制訂提供了數(shù)據(jù)支撐。