復(fù)合酶輔助超聲波提取菊苣根總黃酮的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

陳永平，張藝鏻，吳雨龍,，汪振炯，王仁雷，華 春,

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211171；3.江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 211171；4.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 210013）

菊苣學(xué)名Cichorium intybusL.，亦稱苦苣、藍(lán)苣、咖啡草等，來源于菊科植物毛菊苣（Cichorium glandulosumBoiss），是菊科菊苣屬的多年生草本植物[1]。菊苣的根、莖、葉和種子可作為藥材和食品添加劑[2-3]。菊苣富含多糖類、生物堿、黃酮類、酚類物質(zhì)、萜類等多種生物活性物質(zhì)[4-7]。在維藥中菊苣主要用于治療黃痘型肝炎、濕熱型肝炎、全身性水腫等疾病[8]。雖然已有眾多研究者對(duì)菊苣做了大量的研究，但是對(duì)于菊苣中有效成分提取和活性研究關(guān)注較多的當(dāng)屬多糖類，關(guān)于總黃酮的研究甚少。

黃酮類化合物（Flavonoids）廣泛存在于植物中，是植物在生長過程中產(chǎn)生的一類由多酚化合物組成的次級(jí)代謝產(chǎn)物[9]。黃酮類化合物可分為多種結(jié)構(gòu)類型，包括黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮和二氫黃酮醇類等[10]。研究表明，黃酮類化合物具有顯著的抗氧化活性[11-12]，還能夠降血糖降血脂[13-14]、保護(hù)肝臟[15]、抗腫瘤[16]、抗炎癥[17]、抗衰老[18]、治療心血管系統(tǒng)疾病[19-21]等。目前，植物總黃酮的提取方法有很多[22-23]，其中超聲波輔助提取法在實(shí)驗(yàn)室被廣泛使用，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便、提取時(shí)間短、具有提取效率高等特點(diǎn)。其原理是利用超聲波的空化效應(yīng)，使植物細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，而且由于超聲波具有機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，加快了細(xì)胞內(nèi)有效成分的釋放和溶出，從而縮短提取時(shí)間[24]。生物酶也因可提高植物內(nèi)有效成分的提取率而備受關(guān)注。植物細(xì)胞壁影響總黃酮的溶出，可選用適當(dāng)?shù)拿钙茐募?xì)胞壁，加快有效成分釋放，常用于提取總黃酮的酶類主要有纖維素酶、果膠酶和蛋白酶。此方法與其它方法相比，具有提取條件較溫和、提取率高等特點(diǎn)，在植物黃酮類化合物的提取中得到廣泛應(yīng)用[25]。目前，有關(guān)復(fù)合酶輔助超聲波法對(duì)菊苣根總黃酮進(jìn)行提取的研究還未見報(bào)道。

因此，本研究將超聲波技術(shù)與復(fù)合酶解提取技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，為菊苣根總黃酮的提取提供了一種高效的提取方法。另外，設(shè)計(jì)菊苣根總黃酮的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，采用DPPH 和ABTS 法測定其對(duì)自由基的清除能力，以期為后續(xù)菊苣總黃酮在食品添加劑及藥物研發(fā)應(yīng)用等方面給予參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊苣根 黃石市潤生農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）、果膠酶（500 U/mg）、纖維素酶（400 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；2,2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦肼基自由基（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）上海麥克林生化科技有限公司；L（+）-抗壞血酸、氫氧化鈉、過硫酸鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁 上海新寶精細(xì)化工廠；亞硝酸鈉西隴化工股份有限公司；乙醇、石油醚（60～90 ℃）均為分析純。

紫外可見分光光度計(jì)L6S 上海儀電分析儀器有限公司；超聲波清洗器KQ 3200DB 昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱PCD-C6 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000 上海亞榮生化儀器廠；電熱恒溫水浴鍋HWS-24 上?；厶﹥x器制造有限公司；頂置式攪拌器wb2000-m德國WIGGENS 公司；循環(huán)水式真空泵SHZ-Ⅲ 南京科爾沁儀器設(shè)備有限公司；電子天平ME204E瑞士METTLER TOLEDO 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菊苣根的預(yù)處理 菊苣根60 ℃烘箱干燥2 h，粉碎后過60 目篩；將菊苣根粉末放入圓底燒瓶中，加入適量的石油醚（60～90 ℃），浸泡或回流萃取3 次，每次40 min；抽濾除去含油脂的濾液，待殘?jiān)惺兔褤]發(fā)盡后60 ℃條件下干燥，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菊苣根總黃酮的提取 取3.0 g 預(yù)處理后的菊苣根粉末于具塞圓底燒瓶中，加入適量的70%乙醇溶液，按照溶液體積加入適量的纖維素酶與果膠酶，進(jìn)行攪拌回流提取一段時(shí)間后，將圓底燒瓶放入95 ℃水中10 min（滅酶活）。接著用超聲波處理提取液30 min 后，采用濾膜多次重復(fù)抽濾以除去包括復(fù)合酶在內(nèi)的不溶性雜質(zhì)，得到澄清的濾液置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取3.0 g 預(yù)處理好的菊苣根粉末置于具塞圓底燒瓶中，固定乙醇濃度70%、提取液pH=5、提取次數(shù)1 次、復(fù)合酶配比1:1（g/g）、液料比30:1（mL/g）、酶解時(shí)間60 min、酶解溫度40 ℃、超聲功率60 W、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間20 min，以復(fù)合酶的用量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL/g）、酶解時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、酶解溫度（30、40、50、60 ℃）、超聲功率（40、60、80、100 W）、超聲時(shí)間（10、15、20、25、30 min）為要素因子[26]，研究各要素因子對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了獲得優(yōu)化的試驗(yàn)條件，設(shè)計(jì)自變量為液料比、復(fù)合酶用量、超聲時(shí)間、酶解時(shí)間、超聲功率，響應(yīng)值為菊苣根總黃酮得率的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Box-Behnken test design

1.2.5 菊苣根總黃酮得率的測定

1.2.5.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[27]稱取已干燥至恒重的蘆丁樣品10 mg 于100 mL 容量瓶中，加入體積份數(shù)為70%的乙醇定容至刻度線，混勻，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。依次精密稱取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 標(biāo)椎品溶液，分別置于10 mL 具塞試管中。各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉（NaNO2）0.6 mL，搖勻，室溫靜置6 min。各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁（Al(NO3)3）0.6 mL，混勻，室溫靜置6 min。再各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%（1 mol/L）的氫氧化鈉4 mL，混勻，室溫靜置15 min。加70%的乙醇定容至10 mL，室溫靜置15 min。將第一瓶作為空白對(duì)照，在510 nm 波長處測其紫外吸光度值。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：y=13.1x-0.0063，R2=0.9996，其中y 為吸光值，x 為蘆丁濃度（mg/mL）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，蘆丁在0.01～0.05 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

1.2.5.2 菊苣根總黃酮含量的測定 取保存?zhèn)溆玫木哲母傸S酮溶液并定容到100 mL，吸取1 mL 于10 mL 的具塞刻度管中，按照測蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測吸光度值，并根據(jù)回歸方程計(jì)算菊苣根總黃酮溶液的濃度。計(jì)算公式如下所示[28]：

式中：C：總黃酮溶液的濃度（mg/mL）；V：總黃酮溶液的定容體積（mL）；N：測定時(shí)總黃酮溶液的稀釋倍數(shù)；M：提取用的菊苣根粉末質(zhì)量（g）。

1.2.6 菊苣根總黃酮的體外抗氧化活性測定 將提取得到的菊苣根總黃酮配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 質(zhì)量濃度的待測液，以相同濃度的維生素C 溶液作為陽性對(duì)照，分別測定菊苣根總黃酮對(duì)DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除率，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。

1.2.6.1 菊苣根總黃酮清除DPPH 自由基能力測定

參照文獻(xiàn)[29]的測定方法并做稍微修改。精密稱取7.89 mg DPPH 固體粉末，溶于100 mL 無水乙醇中，配成DPPH 工作液（0.2 mmol/L），4 ℃下避光保存?zhèn)溆谩７謩e吸取1 mL 不同濃度的總黃酮溶液于3 mL DPPH 工作液中，混勻，室溫黑暗放20 min 進(jìn)行充分反應(yīng)，在517 nm 的波長處測得吸光度值為A1；將DPPH 工作液替換成等體積無水乙醇測得吸光值為A2；將樣品溶液替換成等體積的樣品溶劑（70%乙醇）測得吸光度值為A0。等濃度的維生素C 溶液作為陽性對(duì)照組，計(jì)算公式為：

式中：A1：樣品組吸光度值；A2：樣品本底吸光度值；A0：空白對(duì)照組吸光度值。

1.2.6.2 菊苣根總黃酮清除ABTS+自由基能力測定

參照文獻(xiàn)[30]的測定方法并做稍微修改。吸取5 mL ABTS（7 mmol/L）溶液，加入到5 mL 過硫酸鉀（2.45 mmol/L）溶液中，黑暗放置12～16 h 既得ABTS+·工作液。使用前用ddH2O 將吸光度值稀釋至0.70±0.02（734 nm 波長處）。在試管中加入不同濃度的樣品溶液0.4 mL，然后加入3 mL ABTS+·工作液，室溫黑暗放置30 min 后在734 nm 波長處測得吸光值為A1；將ABTS+·工作液替換成等體積ddH2O 測得吸光值為A2；將樣品溶液替換成等體積的樣品溶劑（70%乙醇）測得吸光度值為A0。等濃度的維生素C 溶液作為陽性對(duì)照組，計(jì)算公式為：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100 式（3）

式中：A1：樣品組吸光度值；A2：樣品本底吸光度值；A0：空白對(duì)照組吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差。運(yùn)用Excel、Origin 7.0 軟件繪制趨勢點(diǎn)線圖，SPSS 19.0 軟件計(jì)算半效劑量IC50值，Design-Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶用量對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響 從圖1中可以看出，隨著復(fù)合酶的加入，菊苣根總黃酮得率不斷提高，當(dāng)復(fù)合酶用量達(dá)到2.0%時(shí)得率最高，隨后隨著酶量的增加而得率下降?？赡茉蚴钱?dāng)酶濃度過高時(shí)，酶和部分酶解的纖維素將菊苣根粉末包裹起來，反而不利于有效成分溶出，因此總黃酮得率降低[31]。為了保證菊苣根的纖維素和果膠能盡可能的被降解，同時(shí)不影響總黃酮物質(zhì)溶出，因此后續(xù)采用2.0%的復(fù)合酶用量進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 復(fù)合酶用量對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of compound enzyme dosage on extraction yield of total flavonoids from chicory roots

2.1.2 液料比對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響 從圖2中可以看出，在液料比的比值較小時(shí)，增加乙醇量會(huì)導(dǎo)致菊苣根總黃酮得率增加，在液料比30:1 mL/g時(shí)總黃酮得率最大，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。推測這可能是因?yàn)橐毫媳冗^高時(shí)，溶劑量大吸收了過多的超聲波能量使菊苣根粉末受到的超聲波能量減少，從而影響總黃酮得率[32]。因此選擇液料比為30:1 mL/g。

圖2 液料比對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-Solid ratio on the extraction yield of total flavonoids from chicory roots

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響 從圖3中可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，菊苣根總黃酮得率逐漸升高，但當(dāng)酶解時(shí)間大于60 min 后，得率便稍微下降。可能是因?yàn)楫?dāng)酶解時(shí)間延長時(shí)，酶解效率不再提高，而且溶出的總黃酮中有部分黃酮類化合物可能發(fā)生了降解，因此酶解時(shí)間超過60 min，總黃酮得率緩慢下降[33]。因此選擇酶解的時(shí)間為60 min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction yield of total flavonoids from chicory roots

2.1.4 酶解溫度對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響 從圖4中可以看出，在酶解溫度為50 ℃之前，菊苣根總黃酮得率隨著溫度的升高而逐漸提高。但當(dāng)酶解溫度超過50 ℃后，得率下降，可能是因?yàn)槊敢驕囟冗^高而失活，酶解速率下降，總黃酮得率下降[34]。因此選擇酶解溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction yield of total flavonoids from chicory roots

2.1.5 超聲功率對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響 從圖5中可以看出，隨著超聲功率的增加，菊苣根總黃酮得率也逐漸升高，當(dāng)超聲功率達(dá)到60 W 時(shí)，得率達(dá)到最高。這是因?yàn)楫?dāng)超聲功率較低時(shí)，對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用較小，故總黃酮浸出率不高。隨著超聲功率不斷增加，分子運(yùn)動(dòng)加劇，細(xì)胞壁破碎程度加大，總黃酮得率升高。隨后總黃酮得率下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲功率太大時(shí)，黃酮類化合物遭到破壞，從而造成總黃酮得率的降低[35]。因此選擇超聲功率為60 W。

圖5 超聲功率對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids from chicory roots

2.1.6 超聲時(shí)間對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響 從圖6中可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長，菊苣根總黃酮得率逐漸提高，在超聲時(shí)間25 min 時(shí)，得率最高。當(dāng)繼續(xù)延長時(shí)間時(shí)，總黃酮得率下降，原因可能是超聲時(shí)間過長，導(dǎo)致溶液中很多其它物質(zhì)溶出，從而造成總黃酮得率的降低[36]。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from chicory roots

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表2，方差分析結(jié)果見表3。

利用Design Expert 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元回歸模型為：Y=5.30+0.16A+0.38B-0.12C-0.049D+0.20E-0.085AB-0.0075AC-0.14AD+0.14AE-0.050BC-0.0075BD+0.077BE-0.030CD+0.065CE+0.075DE-0.32A2-0.31B2-0.34C2-0.30D2-0.29E2。為檢驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)Ｐ头匠痰挠行?，?duì)菊苣根總黃酮得率的回歸模型進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的各因素水平及響應(yīng)值Table 2 Experimental design and response results of Box-Behnken design

由表3 可知，菊苣根總黃酮得率的模型方程的F值為30.50，具有顯著性(PModel＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），方程的決定系數(shù)R2為0.9606，表明以菊苣根總黃酮得率的變化而建立的方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小，因此該模型可以用來分析和預(yù)測菊苣根總黃酮提取的工藝條件。各自變量因素對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響情況如下：一次項(xiàng)因素A（酶解時(shí)間）、B（液料比）、C（超聲時(shí)間）和E（復(fù)合酶用量），二次項(xiàng)因素A2、B2、C2、D2、E2、AD（酶解時(shí)間與超聲功率）對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響均具有極顯著性（P＜0.01）；交互項(xiàng)因素AE（酶解時(shí)間與復(fù)合酶用量）對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng)因素D（超聲功率）、交互項(xiàng)因素AB（酶解時(shí)間與液料比）、AC（酶解時(shí)間與超聲時(shí)間）、BC（液料比與超聲功率）、BD（液料比與超聲功率）、BE（液料比與復(fù)合酶用量）、CD（超聲時(shí)間與超聲功率）、CE（超聲時(shí)間與復(fù)合酶用量）和DE（超聲功率與復(fù)合酶用量）對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響不顯著（P＞0.05）。因此，根據(jù)該回歸模型方差分析的結(jié)果可以得知，各因素對(duì)菊苣根總黃酮得率的影響次序?yàn)椋築（液料比）＞ E（復(fù)合酶的用量）＞ A（酶解時(shí)間）＞C（超聲時(shí)間）＞D（超聲功率）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Anovariance analysis of regression model

圖7 反映了交互項(xiàng)因素AD（酶解時(shí)間與超聲功率）和交互項(xiàng)因素AE（酶解時(shí)間和復(fù)合酶用量）對(duì)菊苣根總黃酮得率具有顯著影響（P＜0.05）。由圖7 可知，固定超聲功率不變時(shí)，酶解時(shí)間的延長會(huì)導(dǎo)致菊苣根總黃酮得率先提高后降低；固定酶解時(shí)間不變時(shí)，超聲功率的升高會(huì)導(dǎo)致菊苣根總黃酮得率先提高后降低。當(dāng)固定酶解時(shí)間不變時(shí)，復(fù)合酶用量的增多會(huì)導(dǎo)致菊苣根總黃酮得率先提高后降低；固定復(fù)合酶用量不變時(shí)，酶解時(shí)間的延長會(huì)導(dǎo)致菊苣根總黃酮得率先提高后降低。從菊苣根總黃酮得率回歸方程可知，優(yōu)化的工藝條件為：酶解時(shí)間為66 min、超聲功率為59.1 W、液料比為36.5:1 mL/g、復(fù)合酶的用量為2.24%、超聲時(shí)間為24.05 min，在該優(yōu)化條件下，總黃酮得率最高為5.52 mg/g。

圖7 菊苣根總黃酮得率兩因素交互影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots for the pairwise effects on the extraction yield of total flavonoids from chicory roots

為了方便實(shí)際試驗(yàn)操作，上述優(yōu)化的提取條件修改成：酶解時(shí)間為66 min、超聲功率為59 W、液料比為37:1 mL/g、復(fù)合酶的用量為2.2%、超聲時(shí)間為24 min，根據(jù)以上修改的優(yōu)化條件做3 組重復(fù)試驗(yàn)，測得菊苣根總黃酮得率為5.43±0.12 mg/g，與模型預(yù)測值相比較，相對(duì)誤差較?。?.66%），可靠性較高，可以作為超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根總黃酮工藝的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.3 菊苣根總黃酮體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 菊苣根總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除能力如圖8 所示，隨著質(zhì)量濃度的增大，菊苣根總黃酮和維生素C 對(duì)DPPH 的清除率先不斷增大再趨于平緩。在質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL 時(shí)，維生素C 的清除率達(dá)到95.62%,菊苣根總黃酮的清除效果稍弱于維生素C，清除率為84.45%。通過計(jì)算，維生素C 和菊苣根總黃酮清除DPPH 自由基的IC50值分別為0.026、0.04 mg/mL。結(jié)果表明菊苣根總黃酮對(duì)DPPH 自由基有較好的清除效果。

圖8 不同濃度總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate by total flavonoids of different concentrations

2.3.2 菊苣根總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除能力如圖9 所示，在質(zhì)量濃度達(dá)到0.08 mg/mL 時(shí)，菊苣根總黃酮和維生素C 對(duì)ABTS+自由基的清除率均達(dá)到97%以上。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg/mL 時(shí)，維生素C 的清除率為100%，菊苣根總黃酮的清除率為98.18%，接近維生素C 的清除能力。通過計(jì)算，維生素C 和菊苣根總黃酮清除ABTS+自由基的IC50值分別為0.016、0.021 mg/mL。結(jié)果表明菊苣根總黃酮能有效清除ABTS+自由基，有很好的體外抗氧化活性。

圖9 不同濃度總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除率Fig.9 ABTS+free radical scavenging rate by total flavonoids of different concentrations

3 結(jié)論

近年來，菊苣葉和籽總黃酮提取的相關(guān)研究報(bào)道較多[37-38]，而菊苣根總黃酮提取的文獻(xiàn)較少。因此，本研究采用超聲波，并輔以復(fù)合酶解提取技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)及通過響應(yīng)面法優(yōu)化菊苣根總黃酮提取工藝，建立了總黃酮得率的模擬回歸方程，且模型擬合程度較好。最終確定最佳工藝條件為：酶解時(shí)間66 min、復(fù)合酶的用量2.2%、超聲功率59 W、液料比37:1 mL/g、超聲時(shí)間24 min。該結(jié)果可為今后的相關(guān)研究提供技術(shù)支持和工藝參考，加快菊苣資源的開發(fā)與利用。

體外抗氧化活性研究表明，當(dāng)菊苣根總黃酮溶液濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH、ABTS+自由基的清除率接近維生素C，可達(dá)到84.45%和98.18%，IC50值分別為0.04、0.021 mg/mL，表現(xiàn)出顯著的體外抗氧化活性。因此，菊苣根總黃酮可用于食品生產(chǎn)添加劑和開發(fā)新的天然抗氧化藥物。

本研究仍然存在很多不足及需要改進(jìn)的地方。菊苣根總黃酮的提取工藝需要結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用等因素對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，另外，本研究中對(duì)抗氧化活性的考察僅涉及DPPH、ABTS+自由基試驗(yàn)，還需補(bǔ)做總還原力、體內(nèi)抗氧化等相關(guān)實(shí)驗(yàn)工作。因此，本研究是對(duì)菊苣根總黃酮提取及抗氧化活性的初步探索，后期仍需深入研究。