響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2 萃取漢麻葉精油工藝

田 媛，孫宇峰，張正海，張 旭，石 雨，董 艷，崔寶玉，張曉艷，韓承偉，魏連會(huì)，楊慶麗，高寶昌

（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319）

漢麻又稱工業(yè)大麻(Cannabis sativaL.），張建春等[1]根據(jù)英文“Hemp”音譯而來。漢麻屬于無毒品利用價(jià)值的大麻類型[2]，其四氫大麻酚（THC）含量低于0.3%[3]，漢麻葉含有多種生理活性成分，如萜類、酚類、黃酮類、生物堿等[4-7]。在不同的生長時(shí)期，漢麻葉占植株比例不同，在生長旺盛時(shí)期和后期葉子占整個(gè)植株質(zhì)量分別為25%和8%～14%[8]。

目前，植物精油的提取方法有很多種，水蒸氣蒸餾法是最常見的方法，其提取工藝設(shè)備簡單，但其提取效率低、提取過程能耗高[9-10]。超臨界二氧化碳（SC-CO2）萃取是在超臨界狀態(tài)下，將超臨界二氧化碳與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小不同的成分依次萃取出來，是一種可持續(xù)的綠色技術(shù)，可用于提取含高芳香族化合物的高純度油脂[11]，具有操作工藝簡單、萃取時(shí)間短、萃取溫度低、萃取效率高、無溶劑殘留污染等特點(diǎn)[12-13]。目前，很多研究領(lǐng)域都有用到此技術(shù)，尤其在植物精油提取方面得到較好的應(yīng)用，如對沉香[14]、荔枝果核[15]、綠薄荷[16]、茉莉花蕾[17]、虎掌菌[18]等精油的提取，還有很多其他植物精油提取也應(yīng)用到此技術(shù)，以上充分說明了此技術(shù)在精油提取方面具有優(yōu)勢。

目前，采用超臨界CO2萃取技術(shù)在漢麻葉精油的提取方面還少見報(bào)道，所以本項(xiàng)目以提高漢麻葉的附加價(jià)值為出發(fā)點(diǎn)，推動(dòng)漢麻葉資源的深度開發(fā)利用為目的，利用此技術(shù)對漢麻葉進(jìn)行漢麻葉精油的提取，以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，將萃取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對漢麻葉精油的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，從而獲得最佳提取工藝。以期為漢麻葉精油的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，為全方位利用漢麻植株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢麻葉 采自黑龍江省科學(xué)院大慶分院實(shí)驗(yàn)田；CO2（CO2純度≥99.99%）沈陽市信利盛興氣體公司。

SFT-10 型超臨界CO2萃取裝置 Erie 賽普泰克有限公司；FW400A 型高速萬能粉碎機(jī) 常州市偉嘉儀器制造有限公司；PTX-FA110 電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漢麻葉預(yù)處理 采摘成熟期漢麻葉，將采摘后的漢麻葉洗干凈后陰干，粉碎過篩。

1.2.2 萃取工藝流程 將陰干的漢麻葉→粉碎→過30 目篩→漢麻葉粉末30 g→入萃取釜→CO2萃取→漢麻葉精油

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 萃取壓力對萃取率的影響 固定萃取溫度為50 ℃，萃取時(shí)間為3 h，CO2流量為13 mL/min時(shí)，分別考察萃取壓力為15、20、25、30、35 MPa 時(shí)對精油萃取率的影響，按照1.2.2 萃取流程萃取漢麻葉精油，并計(jì)算萃取率。

1.2.3.2 萃取溫度對萃取率的影響 固定萃取壓力為25 MPa，萃取時(shí)間為3 h，CO2流量為13 mL/min時(shí)，分別考察萃取溫度為40、45、50、55、60 ℃時(shí)對精油萃取率的影響，按照1.2.2 萃取流程萃取漢麻葉精油，并計(jì)算萃取率。

1.2.3.3 萃取時(shí)間對萃取率的影響 固定萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為50 ℃，CO2流量為13 mL/min時(shí)，分別考察萃取時(shí)間為2、2.5、3、3.5、4 h 時(shí)對精油萃取率的影響，按照1.2.2 萃取流程萃取漢麻葉精油，并計(jì)算萃取率。

1.2.3.4 CO2流量對萃取率的影響 固定萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為50 ℃，萃取時(shí)間為3 h 時(shí)，分別考察CO2流量為9、11、13、15、17 mL/min 時(shí)對精油萃取率的影響，按照1.2.2 萃取流程萃取漢麻葉精油，并計(jì)算萃取率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以漢麻葉精油的萃取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，X1、X2、X3、X4為自變量，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levers in the Box-Behnken experimental design

1.2.5 漢麻葉精油萃取率計(jì)算 公式[19]如下：

萃取率（%）=漢麻葉精油質(zhì)量（g）/漢麻葉粉末質(zhì)量（g）×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[20]，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取萃取壓力（X1）、萃取溫度（X2）、萃取時(shí)間（X3）、CO2流量（X4）4 個(gè)因素為自變量，以漢麻葉精油萃取率（Y）為響應(yīng)值，運(yùn)用Design -Expert 8.0.6 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析并得到最佳提取工藝參數(shù)。采用SPSS17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan 多重比較分析，圖表采用GraphPad Prism 5 繪制。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取壓力對萃取率的影響 萃取壓力改變超臨界CO2的密度，從而影響精油萃取率[21]，由圖1 可知，增大萃取壓力，精油萃取率也隨之增大，當(dāng)壓力為30 MPa 時(shí)，萃取率達(dá)到最大為0.271%，但壓力繼續(xù)升高到35 MPa 時(shí)，萃取率反而降為0.261%。因此，30 MPa 為最佳萃取壓力。

圖1 萃取壓力對漢麻葉精油萃取率的影響Fig.1 Influence of extraction pressure on the yield of essential oil of hemp leaves

2.1.2 萃取溫度對萃取率的影響 升高溫度可使分子熱運(yùn)動(dòng)加快，繼而加大溶質(zhì)的擴(kuò)散速度[19]。由圖2可見出，隨著萃取溫度升高，精油萃取率增大，在50 ℃時(shí)萃取率為0.266%，達(dá)到最大。當(dāng)繼續(xù)升高萃取溫度時(shí)，精油萃取率反而降低，因此，50 ℃為最佳萃取溫度。

圖2 萃取溫度對漢麻葉精油萃取率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on yield of essential oil from hemp leaves

2.1.3 萃取時(shí)間對萃取率的影響 由圖3 可知，萃取時(shí)間在2～3.5 h 時(shí)，漢麻葉精油萃取率隨著萃取時(shí)間的增加而增大，3.5 h 時(shí)萃取率最大，為0.272%。當(dāng)萃取時(shí)間繼續(xù)變長時(shí)，萃取率反而下降，可能是過長的萃取時(shí)間使體系中其他色素和成分也被萃取出來[22]，因此，萃取時(shí)間選3.5 h 為宜。

圖3 萃取時(shí)間對漢麻葉精油萃取率的影響Fig.3 Influence of extraction time on the yield of essential oil from hemp leaves

2.1.4 CO2流量對萃取率的影響 由圖4 可知，隨著CO2流量的增大，漢麻葉精油萃取率也隨之增大，當(dāng)CO2流量為13 mL/min 時(shí)，精油萃取率達(dá)到最大，為0.266%，再繼續(xù)增大時(shí)，萃取率稍有下降。推測適當(dāng)增大CO2流量有利于精油的萃取，但流量過大，CO2流體與漢麻葉粉末接觸時(shí)間減少，對精油的提取不利[23]。因此，CO2流量為13 mL/min 為宜。

圖4 CO2 流量對漢麻葉精油萃取率的影響Fig.4 Influence of CO2 flow rate on yield of essential oil of hemp leaf

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行漢麻葉精油提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the Box -Behnken test

2.3 建立數(shù)學(xué)模型及方差分析

對表2 的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到模型回歸方程，如下所示：

方差分析結(jié)果見表3。此模型顯著（P＜0.05），模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），信噪比為78.682，大于4，R2=0.9983，調(diào)整決定系數(shù)Radj2為0.9966，可詮釋99.66%響應(yīng)值的變化。Rpred2為0.9917 與Radj2相接近，結(jié)果表明誤差小，擬合度好，可用此模型分析與預(yù)測漢麻葉精油的提取工藝條件[24,25]。根據(jù)表3 中F值可知，影響萃取率大小的因素依次為：X3＞X4＞X1＞X2。此外，通過P值可知，X1、X3、X4、X12、X22、X32、X42對精油萃取率有極顯著影響（P＜0.01），X2、X1X3對精油萃取率有顯著影響（P＜0.05）。

2.4 響應(yīng)面分析及條件優(yōu)化

圖5 表示取X1、X2、X3、X4任意兩個(gè)變量，精油萃取率受其余兩個(gè)變量的影響情況[26]。響應(yīng)曲面越曲折，交互作用越強(qiáng)。交互作用顯著得是X1與X3，其他兩個(gè)變量兩兩交互作用都不顯著，此結(jié)果與表3 結(jié)果相同。

圖5 兩因素交互作用對精油萃取率的影響Fig.5 Interaction of two factors on extraction rate of essential oil

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.5 最佳工藝條件驗(yàn)證

通過響應(yīng)面分析，得到最佳漢麻葉精油提取工藝條件為萃取壓力28.89 MPa、萃取溫度49.15 ℃、萃取時(shí)間3.41 h、CO2流量12.87 mL/min，漢麻葉精油理論萃取率為0.281%。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來證明模型預(yù)測結(jié)果的可靠性，根據(jù)萃取設(shè)備的實(shí)際可操作性，將工藝條件改為萃取壓力29 MPa、萃取溫度49 ℃、萃取時(shí)間3.4 h、CO2流量為13 mL/min。按照上述修改后的工藝條件進(jìn)行了精油的提取，做了三組平行實(shí)驗(yàn)，平均實(shí)際萃取率為0.283%，基本等同與理論值0.281%，預(yù)測值與真實(shí)值的實(shí)際偏差為-0.71%，二者具有良好的擬合性。

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化漢麻葉精油的提取工藝，方差分析結(jié)果表明，在影響漢麻葉精油萃取率因素方面，萃取時(shí)間＞CO2流量＞萃取壓力＞萃取溫度。結(jié)合提取工藝的實(shí)際可操作性和便利性，最后將工藝條件改為萃取壓力29 MPa、萃取溫度49 ℃、萃取時(shí)間3.4 h、CO2流量為13 mL/min，得到的實(shí)際萃取率是0.283%，與理論值0.281%相接近，預(yù)測值與真實(shí)值的實(shí)際偏差為-0.71%，二者具有良好的擬合性，說明基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

目前，漢麻葉在我國的深度應(yīng)用開發(fā)相對較弱，在精油提取方面很少，主要集中在對漢麻葉中大麻二酚等大麻酚類成分的提取和應(yīng)用方面，因此本項(xiàng)目通過對漢麻葉精油提取工藝的優(yōu)化，建立簡單、高效、綠色的漢麻葉精油提取工藝，為其生產(chǎn)、加工提供理論參考。