等離子體活化水對(duì)沙門(mén)氏菌的滅活作用及機(jī)制研究

相啟森，張 嶸，杜桂紅，王利敏，蔣愛(ài)民

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.河南大用實(shí)業(yè)有限公司，河南鶴壁 456750；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；4.開(kāi)封大用實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司，河南開(kāi)封 475000）

食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[1]。我國(guó)每年都會(huì)發(fā)生由沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、李斯特菌等引起的集體性食物中毒事件，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康[2]。近年來(lái)，非熱殺菌技術(shù)由于操作溫度低，能夠較大程度保持食品品質(zhì)而受到廣泛關(guān)注[3]。目前，針對(duì)食品中微生物污染問(wèn)題，常用的非熱殺菌技術(shù)包括超高壓、脈沖電場(chǎng)、紫外線殺菌等，這些殺菌方法具有一定的功效，但同時(shí)也有一些弊端[4-8]。例如紫外線的穿透能力較低，因此對(duì)待處理樣品的類(lèi)型、色澤等有一定要求，這也限制了紫外線殺菌技術(shù)的應(yīng)用范圍[9]；而超高壓殺菌技術(shù)成本較高[4,10]。

等離子體活化水（Plasma-activated water，PAW）是一種新型非熱殺菌技術(shù)，主要通過(guò)低溫等離子體在水表面或水下放電而產(chǎn)生，具有作用均勻、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[11]，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于食品殺菌保鮮領(lǐng)域[12]。研究證實(shí)，PAW 的抗菌活性與等離子體放電過(guò)程中產(chǎn)生的一些活性成分（包括電離氣體、分子、帶電粒子、負(fù)離子/正離子、自由基等）緊密相關(guān)[13]，但對(duì)于PAW 殺菌作用機(jī)理的研究尚不充分[14]。因此本研究擬以沙門(mén)氏菌（S.typhimurium）為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)PAW 的殺滅效果，并通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜通透性和胞內(nèi)活性氧水平等指標(biāo)分析其作用機(jī)理，研究結(jié)果將為PAW 在食品保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門(mén)氏菌（S.typhimurium，CICC 21484）中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；營(yíng)養(yǎng)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙酸異戊酯、磷酸二氫鉀 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；碘化丙啶（Propidium iodide，PI）、50%戊二醛和N-苯基-1-萘胺（N-Phenyl-1-naphthylamine，NPN）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）上海源葉生物科技有限公司。

TS-PL200 型等離子表面處理機(jī) 深圳東信高科自動(dòng)化設(shè)備有限公司；MJ-54A 型高壓滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；TGL-16M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Tecan Spark 20 M 型多功能微孔板讀數(shù)儀 瑞士Tecan 公司；JSM-6490LV 型掃描電子顯微鏡日本JEOL 公司；Nano Drop 2000 型超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備 從-80 ℃冰箱中取出甘油管保存的菌種，挑取一環(huán)菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上反復(fù)活化培養(yǎng)后，挑取活力旺盛的單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。取30 mL 培養(yǎng)物于50 mL 離心管，于4 ℃、4000×g離心10 min，棄上清液，所得菌體用0.85%無(wú)菌NaCl溶液洗滌2 次，離心同上述條件。將所得菌體重懸于0.85%無(wú)菌NaCl 溶液中并混勻，制成活菌數(shù)約為7～8 lg CFU/mL 的菌液備用。

1.2.2 PAW 的制備 采用大氣壓等離子體射流（Atmospheric pressure plasma jet，APPJ）裝置制備PAW，其功率750 W，工作氣體為壓縮空氣（0.18 MPa）。將300 mL 無(wú)菌去離子水（Sterile distilled water,SDW）經(jīng)APPJ 裝置處理30、60 和90 s 得到的PAW 分別記為PAW30、PAW60 和PAW90，備用。

1.2.3 PAW 對(duì)S.typhimurium殺菌效果評(píng)價(jià) 將100 μLS.typhimurium菌懸液加入裝有900 μL PAW 的離心管中，混勻，于室溫處理不同時(shí)間（0、2、4、6、8 和10 min）。取100 μL 處理后的樣品，用0.85%無(wú)菌NaCl 溶液進(jìn)行梯度稀釋后，吸取100 μL稀釋液加入到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板并涂布，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算，結(jié)果表示為lg CFU/mL，每個(gè)稀釋度均重復(fù)3 次。

1.2.4S.typhimurium細(xì)胞形態(tài)觀察 參考Xiang 等[15]的方法，采用掃描電鏡（Scanning electron microscope,SEM）觀察PAW 處理對(duì)S.typhimurium細(xì)胞形態(tài)的影響。菌懸液經(jīng)PAW60 處理10 min 后，于4 ℃、12000×g離心2 min，收集菌體，加入500 μL 預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液，避光，并于4 ℃冰箱固定4 h；然后于4 ℃，8000×g 離心6 min，收集樣品，棄固定液，后用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌樣品三次，離心同上；后分別用30%、50%、70%、80%、90%、100%（v/v）乙醇溶液對(duì)樣品逐級(jí)洗脫10 min，其中100%乙醇溶液洗脫2 次；最后用乙酸異戊酯洗滌置換乙醇2 次，每次10 min，離心條件同上，棄上清，制備菌懸液，混勻之后滴加到洗凈晾干的載玻片上，自然晾干，采用HVB-GB 型真空蒸鍍儀噴金150 s，并通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 胞外蛋白及核酸含量測(cè)定S.typhimurium菌懸液經(jīng)PAW60 處理不同時(shí)間后，于4 ℃，12000×g離心2 min，并收集上清液。采用Nano Drop 2000型超微量分光光度計(jì)測(cè)定上清液中蛋白及核酸含量，每組重復(fù)三次，結(jié)果均表示為μg/mL。

1.2.6 細(xì)胞質(zhì)膜通透性測(cè)定 采用碘化丙啶（PI）探針評(píng)價(jià)細(xì)胞膜通透性的變化情況[16]。S.typhimurium菌懸液經(jīng)PAW60 處理不同時(shí)間（2、4、6、8 和10 min）后，于4 ℃、12000×g 離心2 min，棄上清液，加入PI 儲(chǔ)備液（終濃度為3.0 μmol/L）并于暗處（室溫）孵育15 min，于4 ℃、8000×g 離心2 min，棄上清，菌體用0.85%無(wú)菌NaCl 溶液洗滌兩次，重懸。后立即采用多功能微孔板讀數(shù)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為540 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為630 nm，以未處理的樣品為對(duì)照組。細(xì)胞膜相對(duì)通透率計(jì)算公式如下：

式中：F1為PAW 處理組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.7 細(xì)胞外膜完整性測(cè)定 采用NPN 熒光探針檢測(cè)PAW 處理對(duì)S.typhimurium細(xì)胞外膜的影響[17]。S.typhimurium菌懸液經(jīng)PAW60 處理不同時(shí)間（2、4、6、8 和10 min）后，于4 ℃，12000×g 離心2 min，棄上清液，后加入適量0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）重懸，加入NPN 儲(chǔ)備液（終濃度為10 μmol/L），置于室溫暗處孵育10 min。采用多功能微孔板讀數(shù)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為401 nm。按式（2）計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度：

式中：F1為PAW 處理組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測(cè)定 參考馬良軍等[18]的方法并稍作改動(dòng)。S.typhimurium菌懸液經(jīng)PAW60處理不同時(shí)間（2、4、6 和8 min）后，于4 ℃，12000×g離心2 min，棄上清液，并重懸于磷酸鹽溶液（0.1 mol/L、pH7.2），洗滌三次，離心同上，后加入適量DCFH-DA 染色液，于37 ℃暗處孵育1 h，后在激發(fā)光/發(fā)射光為488/525 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度。按式（1）計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)均重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Prism 軟件（Graphpad 7.0）繪圖，采用SPSS 軟件（Version24.0）進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析和最小顯著差異法Ducan 檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAW 對(duì)S.typhimurium 的殺菌效果

由圖1A 可知，經(jīng)60、90 s 放電時(shí)間PAW 處理6 min后，S.typhimurium活菌數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，經(jīng)PAW30、PAW60 和PAW90 分別處理6 min 后，S.typhimurium活菌數(shù)分別降低0.63、1.78 和4.32 lg CFU/mL。結(jié)合前期研究結(jié)果，考慮到耗能因素且通過(guò)優(yōu)化PAW60 處理時(shí)間也能達(dá)到良好的殺菌效果，因此采用PAW60 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。如圖1B 所示，隨著PAW60 處理時(shí)間的延長(zhǎng)（2～10 min），S.typhimurium活菌數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，經(jīng)PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium活菌數(shù)由初始的7.91 lg CFU/mL 降低至3.69 lg CFU/mL，減少了4.22 lg CFU/mL。以上結(jié)果表明，PAW 能夠有效滅活S.typhimurium，其殺菌效果受低溫等離子體激活時(shí)間和處理時(shí)間影響較大。

圖1 放電時(shí)間（A）和反應(yīng)時(shí)間（B）對(duì)PAW 殺滅S.typhimurium 效果的影響Fig.1 Effects of discharge time (A) and treatment time (B) on inactivation efficacy of PAW against S.typhimurium cells

2.2 PAW 對(duì)S.typhimurium 細(xì)胞形態(tài)的影響

采用掃描電子顯微鏡觀察PAW 處理對(duì)S.typhimurium細(xì)胞形態(tài)的影響。如圖2 所示，對(duì)照組S.typhimurium細(xì)胞呈桿狀，表面完整光滑；經(jīng)PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium菌體出現(xiàn)不規(guī)則鋸齒形輪廓，并且菌體表面出現(xiàn)明顯的褶皺和破裂，這與朱莉華等[19]的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，PAW 處理破壞了細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，可能進(jìn)一步影響其正常生理代謝。

圖2 PAW60 處理對(duì)S.typhimurium 細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of PAW60 treatment on the morphology of S.typhimurium cells

2.3 PAW 對(duì)S.typhimurium 細(xì)胞膜通透性的影響

通過(guò)測(cè)定核酸、蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)的釋放評(píng)價(jià)PAW 處理對(duì)S.typhimurium細(xì)胞膜通透性的影響。由圖3A 可知，在處理時(shí)間為0 至10 min 時(shí)，S.typhimurium胞外核酸含量隨著PAW60 處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05）。PAW60 處理10 min后上清液中核酸含量為7.33 μg/mL，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。如圖3B 所示，隨PAW60 處理時(shí)間延長(zhǎng)，S.typhimurium胞外蛋白質(zhì)釋放量顯著升高（P＜0.05）；經(jīng)PAW60 處理10 min 后，胞外蛋白質(zhì)濃度升高至72.00 μg/mL。以上結(jié)果表明PAW 處理可造成S.typhimurium細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而顯著增強(qiáng)其細(xì)胞膜通透性（P＜0.05），造成核酸及蛋白質(zhì)等胞內(nèi)組分釋放到胞外。

圖3 PAW60 處理對(duì)S. typhimurium 核酸（A）和蛋白釋放量（B）的影響Fig.3 Effects of PAW60 treatment on nucleic acids (A) and proteins (B) leakages of S.typhimurium

2.4 PAW 對(duì)S.typhimurium 細(xì)胞膜通透性的影響

碘化丙啶（PI）是一種疏水性核酸染料，當(dāng)細(xì)胞膜受損或通透性改變時(shí)，PI 會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并與核酸結(jié)合后發(fā)出紅色熒光[20]。由圖4 可知，與對(duì)照組相比，隨著PAW60 處理時(shí)間延長(zhǎng)，S.typhimurium細(xì)胞中PI 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05），這與Xiang 等[21]的研究結(jié)果一致。當(dāng)處理時(shí)間為10 min 時(shí)，S.typhimurium細(xì)胞PI 熒光強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照組升高了84.58%。以上結(jié)果表明PAW 處理顯著增強(qiáng)了S.typhimurium細(xì)胞質(zhì)膜的通透性（P＜0.05），造成胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)釋放到胞外，影響正常代謝而造成細(xì)胞死亡[22]。

圖4 PAW60 處理對(duì)S.typhimurium 細(xì)胞中PI 熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of PAW60 treatment on PI fluorescence intensity of S.typhimurium cells

2.5 PAW 對(duì)S.typhimurium 細(xì)胞外膜完整性的影響

革蘭氏陰性菌（如S.typhimurium）由內(nèi)膜和外膜兩層膜包被[23]，完整的外膜作為滲透屏障可以保護(hù)細(xì)菌不受環(huán)境中有害化合物的損害[24]。NPN 是一種疏水性熒光探針，只能在親水溶液中發(fā)出微弱熒光，不能有效穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞的外膜，但一旦細(xì)菌外膜受損，它就可以進(jìn)入外膜的疏水性環(huán)境（膜內(nèi)部磷脂層），其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)[25]。因此，NPN 被廣泛用于評(píng)價(jià)細(xì)菌外膜通透性變化[17]。

如圖5 所示，與對(duì)照組相比，S.typhimurium細(xì)胞中NPN 熒光強(qiáng)度隨PAW60 處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)（P＜0.05）。經(jīng)PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium細(xì)胞中NPN 熒光強(qiáng)度升高了316.81%。細(xì)胞外膜通透性的增強(qiáng)常伴隨著膜的破壞和裂解。已有研究表明，經(jīng)熱和PAW 處理后，細(xì)菌細(xì)胞的NPN 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)[26]。綜上所述，PAW60 處理造成S.typhimurium細(xì)胞外膜滲透性增強(qiáng)，這可能是其死亡的重要原因[27]。

圖5 PAW60 處理對(duì)S.typhimurium NPN 熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of PAW60 treatment on NPN fluorescence intensity of S.typhimurium

2.6 PAW 對(duì)S.typhimurium 胞內(nèi)活性氧水平的影響

在等離子體放電過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮（Reactive nitrogen species，RNS），如臭氧（O3）、一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）和羥基自由基（·OH）等。這些活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到水中，可以誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，同時(shí)活性物質(zhì)還可以擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步氧化蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞的正常生理功能[28]。采用DCFH-DA 探針檢測(cè)PAW60 處理對(duì)S.typhimurium胞內(nèi)ROS 含量的影響。如圖6 所示，在處理時(shí)間為0～8 min 時(shí)，S.typhimurium胞內(nèi)ROS 水平隨PAW60處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。經(jīng)PAW60 處理8 min后，S.typhimurium胞內(nèi)活性氧水平相對(duì)于對(duì)照組升高了114.07%。ROS 過(guò)度積累會(huì)對(duì)胞內(nèi)脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和DNA 等生物分子造成氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)菌的生物膜和細(xì)胞生理功能被破壞，最終造成細(xì)胞死亡[29]。

圖6 PAW60 對(duì)S.typhimurium 胞內(nèi)活性氧水平的影響Fig.6 Effect of PAW60 on the intracellular reactive oxygen levels of S.typhimurium cells

3 結(jié)論

本研究通過(guò)等離子體放電不同時(shí)間得到PAW30、PAW60 和PAW90，發(fā)現(xiàn)隨著放電時(shí)間的延長(zhǎng)，PAW 對(duì)S.typhimurium殺菌效果逐漸增強(qiáng)。經(jīng)PAW60 處理10 min 后，S.typhimurium活菌數(shù)減少了4.22 lg CFU/mL；PAW60 處理后，S.typhimurium細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，并且胞內(nèi)活性氧水平顯著升高，這些可能是PAW 處理造成S.typhimurium失活的重要作用機(jī)制。在今后的研究中應(yīng)綜合運(yùn)用代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方法系統(tǒng)闡明PAW 失活微生物的分子機(jī)制；此外，還應(yīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)PAW 對(duì)食品表面微生物的殺滅效果及對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)的影響。