一種葡萄釀酒活性干酵母簡便制備法

李東歌，劉紅艷，葉冬青，秦 義,3，孫 悅，許引虎，劉延琳,3,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧 530007；3.中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，寧夏銀川 750021；4.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院/寧夏葡萄與葡萄酒研究院，寧夏銀川 750021；5.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌 443003）

釀酒活性干酵母是現(xiàn)代高新技術(shù)融合發(fā)展的一種生物活性制品，具有發(fā)酵性能優(yōu)良、細(xì)胞耐性強(qiáng)、絮凝性好、保存期長、運輸方便等優(yōu)點[1-2]。在葡萄酒生產(chǎn)中，釀酒活性干酵母是葡萄酒的關(guān)鍵輔料，優(yōu)良的釀酒活性干酵母能使葡萄酒發(fā)酵的過程穩(wěn)定易控，促進(jìn)葡萄漿果優(yōu)良品質(zhì)在發(fā)酵過程中最大限度的表達(dá)，從而獲得高品質(zhì)的葡萄酒[2]。其性能的優(yōu)劣不僅決定了葡萄酒發(fā)酵能否順利進(jìn)行，更會對葡萄酒的質(zhì)量，特別是葡萄酒口感和風(fēng)味產(chǎn)生顯著影響[3-4]。近年來隨著“微生物風(fēng)土”概念的提出和被葡萄酒行業(yè)普遍接受，亟需一種設(shè)備投入要求低、簡便的釀酒活性干酵母制備方法來進(jìn)行特定釀酒活性干酵母的制備，以滿足具有地域特色風(fēng)格的葡萄酒產(chǎn)品開發(fā)需求[5]。

生產(chǎn)釀酒活性干酵母主要是對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而培養(yǎng)獲得活性強(qiáng)且生物量高的酵母，再采用較為溫和的方式進(jìn)行干燥，以獲得高活性的干酵母制品。酵母菌在生長過程中受到巴斯德效應(yīng)（The Pasteur Effect）和克雷布特效應(yīng)（The Crabtrec Effect）的雙重調(diào)節(jié)，嚴(yán)格優(yōu)化培養(yǎng)基成分和含量對高生物量的獲得十分關(guān)鍵[6]，流加培養(yǎng)的關(guān)鍵在于對培養(yǎng)條件和補料方式進(jìn)行優(yōu)化，以保證培養(yǎng)過程始終處在最佳的狀態(tài)[7]。發(fā)酵罐是酵母培養(yǎng)重要的生物反應(yīng)器，工業(yè)化活性干酵母的制備方法大多采用“發(fā)酵罐-流化床”體系進(jìn)行制備。新型發(fā)酵罐基本上是圍繞傳氧效率、攪拌系統(tǒng)、使用材料三者的綜合考慮[8]，而搖瓶培養(yǎng)只需要控制轉(zhuǎn)速、溫度等簡單條件。生產(chǎn)釀酒活性干酵母干燥過程是將酵母細(xì)胞脫水使之進(jìn)入一個新陳代謝臨時可逆、暫停的低濕休眠狀態(tài)[9]，其中熱風(fēng)干燥、真空干燥、噴霧干燥和流化床干燥等[10-11]是常用的方法。與其它干燥方法相比，熱風(fēng)干燥操作簡單、成本低，對于中小微企業(yè)來說能夠帶來更好的經(jīng)濟(jì)收益。熱風(fēng)干燥是將物料置于連續(xù)流動的空氣流中，使物料中的水分不斷蒸發(fā)的過程[12]。發(fā)酵罐生產(chǎn)對于小微企業(yè)生產(chǎn)活性干酵母成本相對較高，所以“搖瓶-烘箱”體系更加簡便、經(jīng)濟(jì)實惠。

為了滿足實驗室或大量中小型企業(yè)對小批量制備特定本土活性干酵母的需求，本研究以優(yōu)選釀酒酵母菌株wh-2-8 為試驗對象，進(jìn)行基于“搖瓶-烘箱”平臺的釀酒活性干酵母的制備研究，優(yōu)化發(fā)酵工藝和干酵母制備工藝，得到最佳培養(yǎng)時間、酵母最佳鼓風(fēng)干燥時間，保護(hù)劑最佳添加量等，以期為小批量簡便制備活性干酵母提供技術(shù)方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄 2018 年采于寧夏，成熟度良好，總糖232.52 g/L，總酸（以酒石酸計）5.32 g/L，pH 3.48；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)wh-2-8 保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院釀酒微生物種質(zhì)資源室；搖瓶種子培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextros，YEPD）液體培養(yǎng)基、葡萄糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉 四川西隴科學(xué)有限公司；果膠酶 沃爾森公司；亞硫酸 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；海藻糖 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉、果膠酶 均為分析純。

BK1301 生物顯微鏡 南京庚辰科學(xué)儀器有限公司；Cary60 紫外可見分光光度計 安捷倫科技有限公司；ELX800 酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek 公司；NRY-2110 恒溫?fù)u床 上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；HDS-16-5 鹵素電子水分儀 上海方瑞儀器有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TDL-40B 高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；CS1013 電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶試驗設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)菌種活化 將保存于-80 ℃冰箱的釀酒酵母wh-2-8 菌株于無菌狀態(tài)下用接種環(huán)挑取一環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

活化后接于裝有200 mL 種子培養(yǎng)基的搖瓶，在轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度30±1 ℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，挑選穩(wěn)定期前期至對數(shù)期后期的節(jié)點作為接種時間點。

1.2.2 搖瓶增殖培養(yǎng) 將培養(yǎng)至最佳時間的種子液在無菌狀態(tài)下按搖瓶裝液量體積的10%進(jìn)行接種，在轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度30±1 ℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4 h 取樣監(jiān)測，并及時加入400 g/L 葡萄糖溶液和1 mol/L NaOH 溶液進(jìn)行補料，使葡萄糖含量維持在20 g/L 的水平，pH 維持在5～6 的水平。

1.2.2.1 搖瓶裝液量優(yōu)化試驗 在500 mL 錐形瓶中加入培養(yǎng)基的量分別設(shè)定為100、150、200、250 mL，測定OD600nm，分析不同裝液量對釀酒酵母生長的影響，并確定最佳搖瓶裝液量。

1.2.2.2 補料方式優(yōu)化試驗 以最佳搖瓶裝液量進(jìn)行接種培養(yǎng)，設(shè)定3 組補料方式，A 組：進(jìn)行碳源補加并調(diào)節(jié)pH 在5～6 的水平；B 組：只進(jìn)行碳源補加；C 組：不進(jìn)行補料。測定OD600nm，分析三種補料方式對釀酒酵母生長的影響，確定最佳補料方式。

1.2.3 菌體鼓風(fēng)干燥 將增殖培養(yǎng)完成后干重達(dá)到最大時的酵母培養(yǎng)液進(jìn)行離心，在得到的酵母菌體中加入保護(hù)劑，分置于90 mm 的玻璃皿，放入鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干燥。將干燥完成的酵母活性干粉封藏于密封袋中，放于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.1 保護(hù)劑添加量優(yōu)化試驗 離心獲得的酵母泥，以海藻糖為保護(hù)劑，添加量（以干重計）設(shè)定為5%、8%、10%，放置于36 ℃條件下進(jìn)行干燥，每隔1 h 取樣進(jìn)行水分含量的測定，以水分含量≤5.5%來確定干燥時間。分析不同保護(hù)劑添加量對酵母菌體的活菌率影響，確定最佳保護(hù)劑添加量。

1.2.3.2 鼓風(fēng)干燥溫度優(yōu)化試驗 在選定的最佳保護(hù)劑添加量的基礎(chǔ)上，設(shè)定干燥溫度分別為30、33、36、40、45 ℃，每隔1 h 取樣進(jìn)行水分含量的測定，以水分含量≤5.5%來確定干燥時間。分析不同干燥溫度對酵母菌體活菌率的影響，確定最佳干燥溫度。

1.2.4 指標(biāo)測定方法 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法進(jìn)行葡萄糖濃度的測定[13]；光密度測定：于600 nm波長處測定適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液光密度值OD600nm；細(xì)胞干重測定：離心所得菌體恒溫烘干至質(zhì)量恒定；酵母細(xì)胞數(shù)檢測法：用顯微鏡血球計數(shù)法計數(shù)。復(fù)水活化活菌率按照公式（1）進(jìn)行計算。

1.2.5 活性干酵母發(fā)酵性能檢驗 將赤霞珠葡萄進(jìn)行除梗破碎，裝入2.5 L 玻璃容器中（設(shè)置3 組平行：罐號1、2、3），按照1 mg/L 的添加量添加6%亞硫酸并混合均勻，后于葡萄醪中加入30 mg/L 果膠酶，24 h后加入已用葡萄汁活化好的wh-2-8 釀酒活性干酵母粉，接種量為6.80×106個/mL，進(jìn)行浸漬發(fā)酵。

在發(fā)酵過程中，每12 h 進(jìn)行一次壓帽，每隔24 h進(jìn)行一次殘?zhí)堑臏y定。在發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行殘?zhí)?、酒度、揮發(fā)酸、pH 及總酸的測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；Minitab 18 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間分析采用One-Way ANOVA 法；Origin 9.5 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母wh-2-8 生長特征

釀酒酵母wh-2-8 的生長呈現(xiàn)典型的對數(shù)生長（圖1），從培養(yǎng)開始至10 h 為生長延滯期，10～20 h為生長對數(shù)期，20 h 后處于酵母的生長穩(wěn)定期?？紤]到菌株的數(shù)量和活力，選擇處于生長對數(shù)期后期至穩(wěn)定期前期的22 h 作為釀酒酵母wh-2-8 種子液培養(yǎng)的最佳時間，此時的活細(xì)胞數(shù)為1.47 × 107個/mL。

圖1 釀酒酵母種子液生長曲線Fig.1 Growth curve of S.cerevisiaeseed liquid

2.2 搖瓶裝液量的選擇

比較不同裝液量對釀酒酵母wh-2-8 生長量的影響，其結(jié)果如圖2 所示。24～48 h 酵母處于對數(shù)生長期，生長較快；而在52～96 h 酵母生長開始出現(xiàn)衰亡，因為調(diào)節(jié)pH 和糖導(dǎo)致?lián)u瓶中溶氧越來越低，所以酵母生長量開始降低。通過對比可知：初始裝液量越少，相同時間內(nèi)菌體生長量越高。因此，綜合考慮菌體總積累量以及培養(yǎng)時間，確定在500 mL 錐形瓶中裝液量200 mL 作為搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)的條件。

圖2 不同裝液量下酵母的生長曲線Fig.2 Growth curve of yeast with different liquid volume

2.3 補料方式與培養(yǎng)時間的選擇

搖瓶培養(yǎng)條件下，進(jìn)行碳源分批補加以及發(fā)酵pH 控制（圖3）。進(jìn)行碳源分批補料、pH 調(diào)節(jié)的（A 和B）生長量在48 h 達(dá)到穩(wěn)定期，而不進(jìn)行碳源和pH 調(diào)節(jié)的（C）在32 h 達(dá)到穩(wěn)定期；200 mL 裝液量條件下，補加碳源并調(diào)節(jié)pH 時（A）的菌體生長量高于其它兩組補料方式（B、C），OD600nm最大可達(dá)到56.23；只補加碳源（B）的條件下，酵母生長低于補加碳源并調(diào)節(jié)pH 組（A），OD600nm最大值為52.22；不進(jìn)行補料（C）組的菌體最大OD600nm僅為34.57。因此，有利于搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)的補料方式為進(jìn)行碳源補加并調(diào)節(jié)pH。

圖3 不同補料方式酵母生長曲線Fig.3 Curves of feeding ways on biomass of S.cerevisiae

在選定的補料方式的基礎(chǔ)上，以菌體濃度指標(biāo)，選擇搖瓶培養(yǎng)的時間，以獲得在最佳生物活性狀態(tài)下的最大菌體濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母菌體干重在55 h達(dá)到最大值17.80 g/L，活菌數(shù)5.68×108個/mL，OD600nm達(dá)到54.95（圖4）。因此綜上所述，基于“搖瓶”的釀酒酵母較優(yōu)的培養(yǎng)條件為：YEPD 為發(fā)酵培養(yǎng)基、搖床轉(zhuǎn)速250 r/min、培養(yǎng)溫度30±1 ℃、間歇補料維持葡萄糖在20 g/L 水平、pH 5～6 水平，發(fā)酵時長為55 h。

圖4 搖瓶間歇補料培養(yǎng)生長曲線Fig.4 Growth curve of batch culture in shake flask

2.4 鼓風(fēng)干燥保護(hù)劑添加量的確定

選擇最常用的鼓風(fēng)干燥箱作為探究活性干酵母的干燥設(shè)備。干燥條件對酵母菌體活性影響較大，而保護(hù)劑可以在制備酵母活性干細(xì)胞過程中能起到保護(hù)作用，有效地提高活菌率[14]。相關(guān)研究表明海藻糖對酵母具有較好的保護(hù)效果[15]，本研究探究了三種濃度下海藻糖對干酵母的保護(hù)作用，結(jié)果如圖5 所示。保護(hù)劑的含量從5%提高到8%時，活菌率顯著提高（P＜0.05），而8%的添加量與10%的添加量的活菌率分別為70.16%和71.02%，并無明顯提高，考慮到生產(chǎn)中實際的經(jīng)濟(jì)效益，所以選擇保護(hù)劑的添加量是8%。

圖5 不同保護(hù)劑添加量的活菌率Fig.5 Livingcell rate of different protective agent additions

2.5 鼓風(fēng)干燥溫度和時間的確定

在確定保護(hù)劑用量為8%的基礎(chǔ)上，設(shè)定一系列溫度梯度，探究不同干燥溫度和時間對活性干酵母活菌率的影響，結(jié)果如表1 所示。在30～36 ℃條件下，活菌率隨著溫度的升高而有所升高；而超過36 ℃，溫度越高，活菌率反而越低。在36 ℃干燥12 h 的條件下，活菌率達(dá)到最大值71.05%，干粉水分含量在5.15%，符合國標(biāo)GB/T 20886-2007[16]對活性干酵母含水量（≤5.5%）的要求。

表1 不同鼓風(fēng)干燥溫度下活菌率和含水量Table 1 Living cell rate and water content at different air drying temperatures

2.6 釀酒活性干酵母基本質(zhì)量指標(biāo)

對所制備的活性干酵母的基本質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測（表2）。制備的釀酒活性干酵母指標(biāo)中除了活細(xì)胞率略低于國標(biāo)GB/T 20886-2007 的80%外[16]，其它質(zhì)量指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，可達(dá)到實驗室階段簡便制備小批量活性干酵母的目的，具有實際使用價值。

表2 釀酒活性干酵母基本質(zhì)量指標(biāo)Table 2 Quality indicators of active dry yeast

2.7 發(fā)酵性能檢測

使用制備的釀酒活性干酵母進(jìn)行干紅葡萄酒的發(fā)酵試驗（圖6）。釀酒酵母wh-2-8 在啟酵后的24～96 h 內(nèi)能夠迅速將糖代謝轉(zhuǎn)化成酒精，啟酵迅速，且發(fā)酵過程平穩(wěn)，符合釀酒酵母發(fā)酵特性。發(fā)酵結(jié)束所得干紅葡萄酒基本理化指標(biāo)如表3 所示。3 個酒樣之間理化指標(biāo)穩(wěn)定性較好，殘?zhí)蔷∮? g/L，酒度達(dá)12%（V/V）以上，揮發(fā)酸遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)（1.2 g/L）[17]，說明所制備的活性干酵母發(fā)酵性能良好，可用于實際葡萄酒的釀造生產(chǎn)。

圖6 發(fā)酵過程中還原糖變化Fig.6 Change of reducing sugar content during fermentation

表3 干紅葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 3 Basic physical and chemical indexes of dry red wine

3 結(jié)論與討論

本研究通過釀酒活性干酵母工藝的優(yōu)化，建立了對“搖瓶-烘箱”體系的釀酒活性干酵母簡便制備方法，對比“發(fā)酵罐-流化床”體系，“搖瓶-烘箱”體系滿足了試驗研究和普通小微企業(yè)簡便制備特色釀酒活性干酵母的需求。

在搖瓶增殖培養(yǎng)工藝上，通過補加碳源和控制發(fā)酵過程pH 的方式，使得酵母細(xì)胞干重最高可達(dá)17.80 g/L 的水平，明顯優(yōu)于前人搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果[18-19]。趙小麗等[18]通過對釀酒酵母有氧發(fā)酵條件進(jìn)行探究、優(yōu)化實驗室搖瓶發(fā)酵條件，優(yōu)化后的菌體干重為9.63 g/L；南博[19]通過對搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的探究獲得的最終菌體量為11 g/L。上述研究中，菌體量較低的原因可能是在培養(yǎng)過程中搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，從而導(dǎo)致生產(chǎn)過程中溶氧較低，影響了酵母生長量[20]，同時也沒有進(jìn)行補料，這也導(dǎo)致了后期酵母因營養(yǎng)缺失停止生長[21]。本文通過對轉(zhuǎn)速的控制提高，采用補料的方式，最終提高了釀酒活性干酵母的生物量。

在干燥階段工藝上，選擇了最常見的鼓風(fēng)干燥箱作為酵母菌體的干燥設(shè)備，所得到的較優(yōu)結(jié)果條件下的酵母活菌率已達(dá)71.05%，相較于同樣使用海藻糖做單一保護(hù)劑的研究結(jié)果[22-23]，本試驗雖略低于80%，但其發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒殘?zhí)切∮? g/L，酒度達(dá)12%（V/V）以上，揮發(fā)酸遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)（1.2 g/L）性能[24-25]，具有良好的發(fā)酵性能。多數(shù)的研究表明，復(fù)合保護(hù)劑的添加更有利于提高活菌率[26-30]，后續(xù)可進(jìn)行不同保護(hù)劑的復(fù)配使用以進(jìn)一步提高活菌率。綜上，本研究通過對活性干酵母制備工藝的優(yōu)化，為實驗室條件下進(jìn)行小批量釀酒活性干酵母的簡便制備提供技術(shù)方法和理論依據(jù)。