富集鈣乳酸菌的篩選及培養(yǎng)條件對(duì)富集效果的影響

石 月，王金廂，李學(xué)鵬,2,*，勵(lì)建榮，李婷婷，郭曉華，黃建聯(lián)，丁浩宸

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧錦州 121013；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；3.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600；4.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東日照 276800；5.遼寧安井食品有限公司，遼寧鞍山 361003）

鈣是地殼礦質(zhì)元素中第五豐富的元素，也是人體必需營養(yǎng)素之一。人體內(nèi)含鈣量約為1000～1300 g，其中99%存在于骨骼和牙齒中，其余的1%分布在血液、細(xì)胞外液、軟組織中，用于維持細(xì)胞正常生理功能，與骨鈣保持動(dòng)態(tài)平衡。目前，缺鈣是人類的普遍現(xiàn)象。鈣缺乏可導(dǎo)致佝僂病、骨質(zhì)疏松癥等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肌肉痙攣、心臟衰竭。傳統(tǒng)補(bǔ)鈣制劑主要分為無機(jī)鈣和有機(jī)鈣，無機(jī)鈣主要來源于碳酸鈣、動(dòng)物鮮骨、貝殼等，價(jià)格低廉，來源廣泛，但吸收效率低，溶解性差；有機(jī)鈣主要包括葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、醋酸鈣等，這類鈣較無機(jī)鈣容易吸收，但成本較高，氨基酸螯合鈣在一定程度上可以提高生物利用度，但易造成脂肪氧化[1]。近年來，有益微生物對(duì)于鈣的富集和轉(zhuǎn)化成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

Tang 等[2]通過對(duì)草魚骨的酶解、發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過發(fā)酵的草魚骨液能夠促進(jìn)大鼠的生長發(fā)育，鈣能夠在大鼠體內(nèi)得到良好的吸收利用。韓克光等[3]對(duì)羊骨進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后的骨液釋放出更多的鈣，體外抗氧化活性顯著提高。Hu 等[4]利用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌共同發(fā)酵豬骨，發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后骨液中鈣的含量提高到0.9942%。徐穎等[5]研究了乳酸菌富集硒的效果，張青松[6]研究了乳酸菌富集鋅的特性，翟齊嘯[7]研究了乳酸菌吸附鎘以減除危害作用。乳酸菌具有良好的吸附金屬離子能力，可以增強(qiáng)有益金屬的作用，降低有害金屬的毒性。利用乳酸菌富集鈣，可以克服傳統(tǒng)無機(jī)鈣不易吸收、吸收量低等問題。

魚骨是魚類水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一，通常與內(nèi)臟等其他下腳料一起被簡單加工成魚粉等低值飼料，經(jīng)濟(jì)效益低[8]。魚骨中鈣含量豐富（高達(dá)20%～30%），是一種天然優(yōu)質(zhì)的鈣源，因此可通過深加工制成補(bǔ)鈣制劑、膳食營養(yǎng)強(qiáng)化劑和高鈣食品等高附加值產(chǎn)品，為水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的綜合利用提供可行路徑[9]。但魚骨中的鈣質(zhì)一般以羥基磷灰石結(jié)晶形式存在，且羥基磷灰石鈣與膠原纖維有機(jī)結(jié)合，導(dǎo)致骨鈣自然溶出量甚微，鈣元素的利用率低。采用益生菌發(fā)酵可將魚骨中的無機(jī)鈣轉(zhuǎn)化為有機(jī)鈣，對(duì)于有效利用魚骨中的鈣具有重要意義。鑒于此，本文研究篩選富集鈣能力強(qiáng)的乳酸菌，提高鈣富集量，并優(yōu)化鈣富集條件，初步探索結(jié)合機(jī)制，為進(jìn)一步將乳酸菌用于魚骨發(fā)酵制備有機(jī)鈣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌CY1-1、植物乳桿菌Z7、戊糖片球菌DBY2-5-1、干酪乳桿菌D400、米酒乳桿菌DL10、嗜酸乳桿菌DL12、清酒乳桿菌YP4-5 以上菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。MRS 肉湯 青島海博生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸、氯化鈣 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

THERMO 高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo 公司；DL-CJ-2N 超級(jí)潔凈工作臺(tái) 北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CHA-S 恒溫振蕩器 上海梅香儀器制造有限公司；SPX-25 生化培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；XE-70 原子力顯微鏡 韓國Park Systems公司；MS105UD 電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Imark 酶標(biāo)儀 美國BIORAD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的活化與培養(yǎng) 取凍存于甘油中的乳酸菌，在MRS 肉湯培養(yǎng)基中接種2%進(jìn)行活化，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)三代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 生長曲線的測(cè)定 參考吉莉莉等[10]的方法略有修改，將活化后的乳酸菌按2%的接種量接種于MRS 肉湯中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取樣，將菌液取200 μL 置于96 孔板中，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值OD595，根據(jù)OD595繪制生長曲線。

1.2.3 產(chǎn)酸能力的測(cè)定 參考陳銘[11]的方法略有修改，將活化后的乳酸菌按 2%的接種量接種于MRS 肉湯中，在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，每隔6 h進(jìn)行取樣測(cè)定乳酸含量。取發(fā)酵液3 mL 置于錐形瓶中，按1:3 的比例加入蒸餾水，用標(biāo)定的0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定，將總的可滴定酸轉(zhuǎn)換成乳酸含量：

式中：W，發(fā)酵液含量，mL；N，NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V，NaOH 消耗量，mL；K，0.09 為乳酸轉(zhuǎn)化系數(shù)。

1.2.4 乳酸菌對(duì)鈣的富集實(shí)驗(yàn) 參考陳宇凌等[12]和張付云等[13]的方法略有修改，將發(fā)酵物8000 r/min離心20 min 收集菌體，再用超純水將菌體洗滌兩次，獲得濕菌體備用。將濕菌體重懸于滅菌后鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液中進(jìn)行富集，37 ℃重懸2 h，再經(jīng)8000 r/min，20 min 離心除去菌體，利用EDTA 滴定法測(cè)定上清液中鈣離子的含量[13]，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次。

式中：鈣富集量，mg/g；鈣離子總量、上清液中鈣離子含量，mg；菌體質(zhì)量，g。

1.2.5 乳酸菌對(duì)鈣富集條件的優(yōu)化 將乳酸菌活化三代，單一菌株按2%接種量接入培養(yǎng)基中，37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h；復(fù)合菌株按1:1 的比例、2%接種量接入培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在4 ℃條件下，8000 r/min，離心20 min 獲得菌體，再用超純水洗滌兩次，獲得濕菌體備用。

1.2.5.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 將乳酸菌活化三代，單一菌株按2%的接種量接入鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；復(fù)合菌株按1:1 的比例、2%接種量接入鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。測(cè)定菌株的生長曲線，按照生長曲線選取對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。

對(duì)各乳酸菌進(jìn)行擴(kuò)培，在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期進(jìn)行鈣富集量的測(cè)定。取一定量的乳酸菌，在1.2 mg/mL的氯化鈣溶液中37 ℃重懸2 h，在4 ℃條件下，8000 r/min，離心20 min 去除菌體，利用EDTA 滴定法測(cè)定上清液中的鈣離子濃度，鈣富集量的計(jì)算同1.2.4。

1.2.5.2 鈣離子濃度對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 將乳酸菌活化三代，單一菌株按2%的接種量接入鈣離子濃度為0、0.6、1.2、1.8 mg/mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；復(fù)合菌株按1:1 的比例、2%接種量接入不同鈣離子濃度的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值OD595，根據(jù)OD595繪制生長曲線，觀察含鈣離子的培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌生長情況的影響。

稱取一定量的氯化鈣，溶于超純水，調(diào)節(jié)溶液中鈣離子濃度分別為0.6、1.2、1.8 mg/mL，將于正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的濕菌體重懸于不同濃度氯化鈣溶液中，以菌體重懸于超純水中作為空白對(duì)照，37 ℃重懸2 h；再經(jīng)離心去除菌體，利用EDTA 滴定法測(cè)定上清液中的鈣離子濃度，并計(jì)算出乳酸菌的鈣富集量及鈣轉(zhuǎn)化率。

式中：鈣離子轉(zhuǎn)化率，%；鈣離子總量、上清液中鈣離子含量，mg。

1.2.5.3 不同pH 對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 配制鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液，初始pH 為7.2，利用HCl 調(diào)節(jié)pH 為6、5、4、3，將濕菌體重懸于不同pH 的氯化鈣溶液中，37 ℃重懸2 h；再經(jīng)離心去除菌體，測(cè)定上清液中的鈣離子濃度，并計(jì)算出乳酸菌的鈣富集量。

1.2.5.4 培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 配制鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液，將濕菌體重懸于不同溫度的氯化鈣溶液中，35、37、40、42 ℃重懸2 h；再經(jīng)離心去除菌體，利用EDTA 滴定法測(cè)定上清液中的鈣離子濃度，并計(jì)算出乳酸菌的鈣富集量。

1.2.6 原子力顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu) 以植物乳桿菌CY1-1 為實(shí)驗(yàn)菌株，將濕菌體在鈣離子濃度為1.2 mg/mL 和空白試劑中37 ℃重懸2 h，重懸后離心收集菌體。將獲得的濕菌體稀釋200 倍，取1 滴置于蓋玻片中央，自然干燥后在原子力顯微鏡下檢測(cè)，掃描范圍為2.5 μm×2.5 μm。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行方差分析，以Duncan’s 法進(jìn)行檢驗(yàn)，利用 Origin 2018進(jìn)行作圖，Gwyddion 2.53 對(duì)圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

圖1 為七種乳酸菌的生長曲線。由圖可以看出，七種乳酸菌的生長趨勢(shì)大致相同，均呈先上升后平緩的趨勢(shì)。在對(duì)數(shù)生長期（4～12 h）生長情況較好的是嗜酸乳桿菌，干酪乳桿菌的生長情況滯后于其余乳酸菌。進(jìn)入穩(wěn)定期后各乳酸菌的差異逐漸縮小，此階段生長情況最好的是植物乳桿菌CY1-1，這可能是由于植物乳桿菌具有廣泛性、普遍性，生長穩(wěn)定，干酪乳桿菌生長情況較其余菌株差。

圖1 七種乳酸菌的生長曲線圖Fig.1 Growth curve of seven kinds of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸能力測(cè)定

產(chǎn)酸能力是衡量乳酸菌品質(zhì)的重要指標(biāo)，優(yōu)良的乳酸菌應(yīng)兼具有良好的生長能力與產(chǎn)酸能力，從而提高發(fā)酵的產(chǎn)品風(fēng)味與營養(yǎng)價(jià)值[14]。本研究對(duì)七種乳酸菌的產(chǎn)酸能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2。根據(jù)圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各乳酸菌產(chǎn)酸量逐漸上升，培養(yǎng)24 h 后七種乳酸菌產(chǎn)酸量由大到小依次為：嗜酸乳桿菌DL12＞植物乳桿菌CY1-1＞米酒乳桿菌DL10＞清酒乳桿菌YP4-5＞植物乳桿菌Z7＞戊糖片球菌DBY2-5-1＞干酪乳桿菌D400。乳酸菌的產(chǎn)酸速率與生長速率具有一致性，嗜酸乳桿菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸和耐酸能力，產(chǎn)酸量較高；戊糖片球菌及干酪乳桿菌的生長情況滯后于其余菌株，產(chǎn)酸能力亦稍低于其余菌株。

圖2 七種乳酸菌的產(chǎn)酸曲線Fig.2 Acid production curve of seven kinds of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌富集鈣能力的測(cè)定

將七種乳酸菌在鈣離子濃度為1.2 mg/mL 的氯化鈣溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，以溶液中鈣離子濃度差與乳酸菌濃度之比顯示為鈣富集的差異。從圖3 可以看出，各菌株對(duì)鈣的富集有明顯差異，鈣富集量在17.01 到45.41 mg/g 間不等，之前亦有實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌對(duì)金屬離子的富集有差異[15-16]。七種乳酸菌中鈣富集量最高的是植物乳桿菌CY1-1，其鈣富集量為45.41 mg/g，其次為植物乳桿菌Z7，鈣富集量為37.9 mg/g。為探討乳酸菌復(fù)合發(fā)酵對(duì)鈣富集能力的影響，選取以上兩種乳酸菌與其余五株菌進(jìn)行復(fù)合，研究復(fù)合菌株的鈣富集能力。

圖3 七種乳酸菌鈣富集量Fig.3 Calcium enrichment of seven lactic acid bacteria

2.4 復(fù)合菌株富集鈣能力及產(chǎn)酸能力的測(cè)定

復(fù)合菌株的富集鈣能力與產(chǎn)酸量如圖4 所示。從圖3 中可以看出植物乳桿菌Z7 的鈣富集量為37.9 mg/g，經(jīng)復(fù)合后，Z7+DL12 組合低于單菌富集量，其余組均高于單一菌種富集量。植物乳桿菌CY1-1 鈣富集量45.4 mg/g，經(jīng)復(fù)合后，CY1-1+DL10、CY1-1+YP4-5 組合低于單一菌種富集量，其余組鈣富集量均得到提升。文獻(xiàn)表明，乳酸菌復(fù)合可能存在競(jìng)爭抑制，產(chǎn)生負(fù)相互作用，使復(fù)合菌體濃度下降[17]。而植物乳桿菌CY1-1 和嗜酸乳桿菌DL12 復(fù)合菌株，植物乳桿菌Z7 和清酒乳桿菌YP4-5 復(fù)合菌株，在鈣富集量和乳酸含量上均有提升。因此，接下來的試驗(yàn)，選擇植物乳桿菌CY1-1、植物乳桿菌Z7、植物乳桿菌CY1-1 和嗜酸乳桿菌DL12 復(fù)合、植物乳桿菌Z7 和清酒乳桿菌YP4-5 復(fù)合菌株作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行鈣富集條件的優(yōu)化。

圖4 復(fù)合菌種富集鈣能力及乳酸產(chǎn)量Fig.4 Calcium enrichment capacity and lactic acid production of composite strains

2.5 乳酸菌富集鈣的影響因素研究

2.5.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 為了研究時(shí)間對(duì)乳酸菌富集鈣的影響，將四組實(shí)驗(yàn)菌株（CY1-1、CY1-1+DL12、Z7、Z7+P4-5）接種于含Ca2+含量為 1.2 mg/mL 的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔2 h 進(jìn)行取樣測(cè)定生長曲線。根據(jù)生長曲線（圖5），各組乳酸菌在4～10 h 生長迅速，在14～24 h生長趨勢(shì)基本平緩，故選取8 和22 h 為時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期的菌株富集鈣的差異。將乳酸菌培養(yǎng)8 和22 h，收集并洗滌菌體，將菌體重懸于氯化鈣溶液中進(jìn)行鈣富集實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如圖6所示，可以看出對(duì)數(shù)期的菌株富集鈣含量要低于穩(wěn)定期。對(duì)數(shù)期鈣富集量約占穩(wěn)定期的80%～90%，這可能是在細(xì)胞增殖過程中，鈣與細(xì)胞器結(jié)合，蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)含有的氨基、羧基、羥基等基團(tuán)，能與金屬離子發(fā)生相互作用[18]，而在穩(wěn)定期乳酸菌生長穩(wěn)定、生物累積量較大，鈣離子通過載體進(jìn)入細(xì)胞或與特定物質(zhì)結(jié)合[19]，從而完成鈣的富集作用，因此鈣富集量要高于對(duì)數(shù)期。

圖5 單菌、復(fù)合菌株生長曲線Fig.5 Growth curves of single and composite strains

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鈣富集量的影響Fig.6 Effect of incubation time on calcium enrichment

2.5.2 鈣離子濃度對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 將四組乳酸菌分別接種在鈣離子濃度為0、0.6、1.2、1.8 mg/mL的培養(yǎng)基中，對(duì)四種乳酸菌的生長曲線進(jìn)行測(cè)定。從圖7 可以看出，各菌株隨著鈣離子濃度的升高，乳酸菌的生長能力均有所降低。這可能是由于培養(yǎng)基中成分比較復(fù)雜，含有K+、Na+、Mg2+等金屬離子，而高濃度鈣離子的存在，阻礙乳酸菌與其他金屬陽離子結(jié)合[20-21]，導(dǎo)致生長能力下降。另外高濃度的金屬離子可能對(duì)菌體產(chǎn)生毒害或抑制作用，從而使生長量降低[22-23]。根據(jù)圖8 可知，隨著鈣離子濃度的升高，鈣富集量有所提升。這是因?yàn)樵诼然}溶液中進(jìn)行富集，溶液中僅有一種金屬陽離子——鈣離子，不存在其他金屬離子競(jìng)爭，菌體的基團(tuán)結(jié)合位點(diǎn)基本上都被鈣離子占據(jù)，所以富集量較高。植物乳桿菌CY1-1+嗜酸乳桿菌DL12 組富集量在鈣離子含量為1.8 mg/mL 時(shí)低于1.2 mg/mL 組，這可能是由于鈣離子濃度過高，抑制了該復(fù)合菌株的離子富集，導(dǎo)致富集量降低。根據(jù)鈣轉(zhuǎn)化率來看，只有植物乳桿菌Z7+清酒乳桿菌YP4-5 組合的轉(zhuǎn)化率和鈣離子濃度成正比，這可能是菌株復(fù)合后吸附鈣離子能力提高，沒有因?yàn)闈舛仍龃蠖霈F(xiàn)富集量的降低，且該組的鈣富集量遠(yuǎn)高于其余組合，故轉(zhuǎn)化率有所提升。其余三組鈣轉(zhuǎn)化率最高的均為鈣離子含量為1.2 mg/mL組。結(jié)合乳酸菌生長趨勢(shì)、鈣富集量、鈣轉(zhuǎn)化率得出，適合乳酸菌富集的鈣離子濃度為1.2 mg/mL。

圖7 乳酸菌在不同鈣離子濃度下的生長曲線Fig.7 Growth curves of lactic acid bacteria at different calcium ion concentrations

圖8 乳酸菌在不同鈣離子濃度下的鈣富集量和轉(zhuǎn)化率Fig.8 Calcium enrichment and conversion rate of lactic acid bacteria at different calcium ion concentrations

2.5.3 不同pH 對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 pH 是影響生物吸附金屬離子的重要因素之一[24-25]，在較低的pH 下，由于氫離子競(jìng)爭結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致乳酸菌與其他離子的結(jié)合數(shù)量下降。隨著pH 的升高，細(xì)胞表面官能團(tuán)的負(fù)電荷增加，從而有利于離子與乳酸菌的結(jié)合。如圖9 所示，Z7 和CY1-1+DL12 組中，pH 在3～5 范圍內(nèi)的趨勢(shì)是pH 越小，鈣富集量越多，這可能是由于酸性條件下有利于鈣離子的溶出，使鈣離子更多的暴露在溶液中與乳酸菌進(jìn)行富集。從四組菌株整體看，最優(yōu)富集量出現(xiàn)在pH 為5、6 和初始的pH（7.2），這是因?yàn)橹参锶闂U菌的最適pH 在6.2～6.6 的范圍內(nèi)[26]。從圖中可以看出，Z7 的最適pH 為6，CY1-1+DL12組的最適pH 為7.2，Z7+YP4-5和CY1-1 組在pH 為5 和7.2 相差不多。

圖9 pH 對(duì)乳酸菌鈣富集量的影響Fig.9 Effect of pH on calcium enrichment of lactic acid bacteria

2.5.4 培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌富集鈣的影響 乳酸菌最適發(fā)酵產(chǎn)酸溫度是40～42 ℃，而最適生長溫度是35～37 ℃[27]。實(shí)驗(yàn)選擇35、37、40、42 ℃培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)菌株，在鈣離子含量為1.2 mg/mL 中的氯化鈣溶液中進(jìn)行富集，比較富集鈣效果。從圖10 可以看出，溫度對(duì)于各組間鈣富集量的影響具有一定差異，四組乳酸菌總體趨勢(shì)為隨著溫度升高鈣富集量呈先上升后下降趨勢(shì)。其中Z7+YP4-5 組的最適溫度為37 ℃，其余三組的最適溫度為40 ℃。Mrv?ic 等[28]研究溫度對(duì)于乳酸菌富集鋅的影響，結(jié)果顯示乳酸菌富集鋅的能力隨著溫度的升高而提高，原因可能是溫度影響了菌體的活性或乳酸菌與金屬結(jié)合物的穩(wěn)定性。

圖10 培養(yǎng)溫度對(duì)鈣富集量的影響Fig.10 Effect of culture temperature on the enrichment of calcium

2.6 原子力顯微鏡觀察富集前后菌體變化

原子力顯微鏡（AFM）可以在接近生理?xiàng)l件的溶劑體系中直接觀測(cè)生物分子的表面特征，可用于表征不同軟度的生物樣品甚至活體細(xì)胞，并且具有樣品處理簡單、圖像重復(fù)性強(qiáng)、力學(xué)靈敏度高和空間分辨率高的優(yōu)勢(shì)，是研究生物學(xué)的有力工具[29-31]。以植物乳桿菌CY1-1 為觀察對(duì)象，觀察乳酸菌富集鈣前后菌體細(xì)胞變化。圖11 顯示的是植物乳桿菌富集鈣前后原子力顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)的影響，在三維形貌圖中，較暗的區(qū)域?yàn)楸砻孑^低的部分，較亮的區(qū)域?yàn)楸砻孑^高的部分[32]，可以看出，乳酸菌富集鈣后的顏色差異較大，細(xì)胞表面高度差較大；正常乳酸菌表面凸起形狀平坦圓滑，富集后的凸起形狀尖銳，說明乳酸菌在與鈣結(jié)合后聚集顆粒大且多。綜上所述，乳酸菌富集鈣離子后，菌體表面聚集了大量鈣離子，致使細(xì)胞形態(tài)與正常菌株差異較大。

圖11 原子力顯微鏡觀察乳酸菌富集鈣前后菌體細(xì)胞變化Fig.11 Atomic force microscopy observation of changes in bacterial cells before and after calcium enrichment by lactic acid bacteria

3 結(jié)論

本文對(duì)七種乳酸菌的生長能力、產(chǎn)酸能力、富集鈣能力進(jìn)行了測(cè)定，篩選出鈣富集量最高的是植物乳桿菌CY1-1，富集量為45.41 mg/g；其次為植物乳桿菌Z7，富集量為37.9 mg/g。將以上兩種菌株與其他乳酸菌菌株復(fù)合，結(jié)果表明植物乳桿菌Z7+清酒乳桿菌YP4-5 復(fù)合菌株，植物乳桿菌CY1-1+嗜酸乳桿菌DL12 復(fù)合菌株在鈣富集量和乳酸含量上均有提升。選取以上四種組合進(jìn)行富集條件優(yōu)化，分別考察了培養(yǎng)時(shí)間、鈣離子濃度、pH、溫度對(duì)鈣富集量的影響，結(jié)果顯示在穩(wěn)定期進(jìn)行富集，最適鈣離子濃度為1.2 mg/mL，Z7 的最適pH 為6，Z7+YP4-5、CY1-1、CY1-1+DL12 組的最適pH 為7.2，Z7+YP4-5 組的最適溫度為37 ℃，其余各組的最適溫度為40 ℃。利用原子力顯微鏡觀察乳酸菌富集鈣前后菌體細(xì)胞，結(jié)果表明乳酸菌富集鈣前后細(xì)胞形態(tài)差異較大，是鈣離子在乳酸菌中的富集導(dǎo)致的。后續(xù)可將篩選出的鈣富集能力強(qiáng)的乳酸菌用于魚骨等天然富鈣原料的發(fā)酵，提取其中的鈣離子，用于制備新型補(bǔ)鈣制劑。