漳州水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的流行狀況分析

胡元慶，陳錦芳，肖 蕓，朱秋強，張丹鳳

（閩南師范大學生物科學與技術(shù)學院，福建漳州 363000）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是弧菌科的一種嗜鹽厭酸、無莢膜無芽孢的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于全球的海洋環(huán)境中[1-2]。大多數(shù)菌株能很好地適應(yīng)環(huán)境而生存，但某些菌株會感染人并引起嚴重的胃腸炎，主要由于病人食用了污染致病菌株的全生或半生海產(chǎn)品[2-3]。每年夏秋季是該菌生長繁殖最旺盛的季節(jié)，食用帶菌的水產(chǎn)品常能引發(fā)食物中毒等不良反應(yīng)，潛伏期為2～24 h，表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹痛、胃痙攣、食欲不振等癥狀，嚴重者可導致死亡[4]。近年來的研究表明，副溶血弧菌已經(jīng)超過沙門氏菌成為中國南方引起胃腸炎最主要的病原微生物[5-7]。

隨著全球海產(chǎn)品消費量的快速增長，海洋食品安全問題越來越受到關(guān)注[8]。從海水環(huán)境和各種野生海產(chǎn)品都可以分離到副溶血弧菌，尤其以牡蠣為首的貝類攜帶率最高[3,9]。副溶血性弧菌幾乎可感染所有養(yǎng)殖的水生動物，如甲殼類動物、軟體動物和魚類，嚴重時能導致大量動物死亡[3,10-11]。養(yǎng)殖環(huán)境中被感染的水生動物，是致病菌向人類傳播的主要媒介[11]。目前，利用各種抗生素控制養(yǎng)殖水生動物的弧菌病造成了嚴重的環(huán)境壓力，致使病原菌的耐藥性迅速增強[12]，從魚類中分離的許多致病性弧菌均對多種抗生素有耐受性[13-14]。此外，在飼料中過量使用抗生素作為預防劑或生長促進劑，導致養(yǎng)殖的水產(chǎn)品中抗生素殘留量嚴重超標，可能引起消費者產(chǎn)生中毒、過敏反應(yīng)、正常菌群失調(diào)的癥狀，以及病原菌耐藥性加劇[11,15-16]。

RAPD 分型技術(shù)已被證明是鑒別微生物不同種或亞種的有效工具，并可用于分析各種微生物菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[17]。與脈沖場凝膠電泳（pulsedfield gel electrophoresis,PFGE）、腸桿菌重復基因間共有序列PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR,ERIC-PCR）和重復基因外回文序列PCR（repetitive extragenic palindromic sequence PCR,REP-PCR）相比，RAPD 具有速度快、效益高、勞動強度低等優(yōu)點，且該技術(shù)基于整個基因組中核苷酸序列的差異[18]。RAPD 方法已成功地應(yīng)用于不同海產(chǎn)品中副溶血弧菌的分型研究。Yang等[18]對251 個菌株的遺傳多樣性進行了評估，用RAPD 方法將33 個不同的遺傳模式分為9 個類群，相似度為82%。Chao 等[17]對341 株副溶血弧菌進行了RAPD 鑒定，將其分為6 個分子型和23 個亞型。Zhao 等[19]分析了157 個菌株的遺傳多樣性，共鑒定出73 個不同的模式，分為18 個類群。

世界各地副溶血弧菌在海產(chǎn)品中的分離率為8%～51%，其中致病性菌株的分離率僅為13%[20-21]。在中國，海洋沉積物中致病性菌株的分離率并不高，約為8.5%[20,22]。海洋及水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中非致病性分離株可以作為耐藥基因水平傳遞的媒介，促使更多耐藥菌株的出現(xiàn)，甚至通過食物鏈途徑到達人體內(nèi)環(huán)境，使病人攜帶更多的耐藥菌株而無有效的抗生素可選[23]。水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的細菌可以成為抗性基因的儲藏庫，促進抗生素耐藥基因的廣泛水平傳播[23-24]。因此，對養(yǎng)殖場中水產(chǎn)品的副溶血弧菌進行檢測、鑒定以及分型研究，可為消費者提供食品安全參考。漳州市地處福建省南部，海域面積廣闊，海鮮品種豐富多樣，副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒時有發(fā)生[7]。對漳州市養(yǎng)殖場的水產(chǎn)品中副溶血弧菌污染狀況進行調(diào)查研究，有利于預防由該菌引起的食源性疾病。本實驗研究了漳州7 個養(yǎng)殖場羅非魚、石斑魚、蝦樣品中副溶血弧菌的污染狀況，對分離株進行隨機擴增多態(tài)性分析，為降低由該菌引發(fā)的食源性疾病提供養(yǎng)殖環(huán)境流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚、石斑魚、蝦 捕撈于漳州市水產(chǎn)養(yǎng)殖保有量最大的時段（2019 年1～7 月份），從本市下轄7 個縣市（長泰、南靖、龍海、云霄、漳浦、詔安、東山）采樣點的養(yǎng)殖池中采集；tlh基因引物參考胡元慶等[7]設(shè)計，上游引物Tlh-F：5'-AAAGCGGATTA TGCAGAAGCACTG-3'，下游引物Tlh-R：5'-GCTA CTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3'；16S 基因的引物參考Harth 等[25]設(shè)計，上游引物16S-F：5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物16S-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 均委托上海捷瑞生物工程有限公司合成；TCBS 瓊脂 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；3%氯化鈉堿性蛋白胨水 青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；GelStain 核酸染料 北京全式金生物技術(shù)有限公司；2 × Taq Master Mix（含酶）上海捷瑞生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker 北京佳蘭生物科技有限公司。

SW-CJ-1FD 型超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSM-30R 型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司；GSP-9050MBE 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；HSY-B-200 型恒溫振蕩搖床 金壇市鴻科儀器廠；MIKRO 220R 型高速冷凍離心機 德國Hettich 公司；Tprofessional Thermocycler 基因擴增儀 德國Biometra公司；Power B 型電泳儀 北京凱元信瑞儀器有限公司；Amersham Imager 600UV 超靈敏多功能成像儀美國通用電氣公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和處理 水產(chǎn)樣品采集遵守隨機原則，每月采集1 次，共采集228 份樣品。7 個采樣點分別是福建省漳州市長泰縣（S1：117.7867 °E,24.7190 °N）、南靖縣（S2：117.3596 °E,24.5054 °N）、龍海市（S3：117.8572 °E,24.4116 °N）、云霄縣（S4：117.4582 °E,23.9425 °N）、漳浦縣（S5：117.7687 °E,23.9301 °N）、詔安縣（S6：117.2670 °E,23.7535 °N）、東山縣（S7：117.4615 °E,23.6645 °N）。定期無菌采集疑似發(fā)病的羅非魚、石斑魚和蝦樣品，4 h 內(nèi)送達實驗室處理樣品。超凈工作臺中無菌操作對魚蝦進行解剖，選肝脾腎劃線接種至TCBS 培養(yǎng)基，37 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況。

1.2.2 疑似菌落純化和增菌 從TCBS 培養(yǎng)基上挑取藍綠色疑似單菌落，接種至新的TCBS 平板上，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h 后觀察菌落狀態(tài)。若平板上有特征菌落出現(xiàn)，接種3%氯化鈉堿性蛋白胨水，37 ℃恒溫搖床200 r/min 振蕩培養(yǎng)18～24 h。液體若呈渾濁表明細菌生長良好，加25%甘油-80 ℃保存菌種。

1.2.3 疑似副溶血弧菌鑒定擴增 16S rDNA 的1500 bp 和tlh基因的450 bp 片段初步鑒定該菌。模板制備用水煮法，25 μL 的擴增體系：12.5 μL 的2×Taq Master Mix（含酶），模板液3 μL，上下游引物各1 μL，7.5 μL ddH2O 補足體系。tlh基因擴增條件為：95 ℃，3 min 預變性；95 ℃，1 min 變性、58 ℃，1 min 退火、72 ℃延伸1 min,30 次循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。16S rDNA 的擴增體系組成同上。循環(huán)參數(shù)為：預變性95 ℃，2 min；變性95 ℃，2 min、退火58 ℃，1 min、72 ℃延伸 2 min，30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠100 V 電泳45 min 后成像拍照。電泳陽性的PCR 產(chǎn)物樣品送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 RAPD 分子分型 為探討副溶血弧菌分離株的基因多態(tài)性，采用隨機擴增多態(tài)性法進行分子分型。復蘇凍存菌株，液體培養(yǎng)后用試劑盒提取細菌基因組DNA。選取隨機引物P4-AAGAGCCGT[26]進行RAPD 分析。擴增反應(yīng)體系：DNA 模板2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、P4 引物（50 pmol/μL）1 μL、10 mmol/L dNTPs 0.2 μL、Taq DNA 酶0.5 μL、ddH2O補齊25 μL。循環(huán)參數(shù)如下：預變性94 ℃ 3 min；40 次循環(huán)，變性94 ℃ 1 min、退火36 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 2 min；終延伸72 ℃ 7 min。1%瓊脂糖凝膠在電壓80 V 電泳100 min，凝膠成像并保存圖片。

1.3 數(shù)據(jù)處理與RAPD 指紋圖譜聚類分析

將16S rDNA 和tlh基因的測序結(jié)果用Contig-Express 軟件進行序列峰圖校對，雙向拼接。用NCBI 網(wǎng)站的BLAST 程序?qū)蛐蛄羞M行比對，選擇相似性最高的物種信息用于菌株分類和基因注釋。RAPD 擴增條帶圖譜用Gel-pro 4.5 軟件分析條帶大小，相同條帶大小的位點記為1，沒有相同位點記0，將條帶圖轉(zhuǎn)化為0、1 數(shù)據(jù)。利用NTsys 2.10軟件，將輸出的結(jié)果以SM 為系數(shù)采用非加權(quán)平均法（UPGMA）構(gòu)建樹狀圖進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌分離和純化的結(jié)果

2019 年1～7 月份從漳州市7 個養(yǎng)殖場共采集了228 份樣品，包括57 份羅非魚，65 份石斑魚，106 份蝦。微生物培養(yǎng)初步得到111 株疑似菌株，分別為9 株羅非魚、23 株石斑魚、74 株蝦，分離率為46.49%。將111 份疑似副溶血弧菌單菌落進一步純化培養(yǎng)，使其在新的TCBS 培養(yǎng)基上均呈藍綠色、半透明、微渾濁的典型菌落（圖1）。

圖1 疑似副溶血弧菌TCBS 培養(yǎng)基分離及純化Fig.1 Isolation and purification of Vibrio parahaemolyticus on TCBS medium

2.2 疑似菌鑒定結(jié)果

tlh基因是副溶血弧菌的特異性靶基因，可以擴增tlh基因的部分序列初步鑒定該菌。若在450 bp處出現(xiàn)特異性條帶，則是副溶血弧菌陽性，反之為陰性（見圖2）。16S rDNA 普遍存在于原核生物中，可據(jù)此來分析絕大部分細菌。若特異性條帶在1500 bp處被檢出（見圖3），則可以證明疑似菌屬于弧菌科。111 株疑似菌株經(jīng)tlh基因檢測后初步確定74 株為副溶血弧菌。將111 株疑似菌株進行16S rDNA 基因檢測，共有105 個菌株的DNA 條帶在1500 bp 處被檢測出。對74 個tlh基因和105 個16S rDNA 基因陽性菌株測序，BLAST 在線序列比對，tlh基因與副溶血弧菌的同源性高于90%，16S rDNA 基因與弧菌科的同源性高于90%。tlh基因和16S rDNA基因均為陽性的菌株共69 株，可確定為副溶血弧菌。

圖2 部分疑似副溶血弧菌tlh 基因的PCR 電泳圖Fig.2 Results of PCR detection of tlh gene of some suspected Vibrio parahaemolyticus

圖3 部分疑似副溶血弧菌16S rDNA 的PCR 電泳圖Fig.3 Results of PCR detection of 16S rDNA of some suspected Vibrio parahaemolyticus

2.3 流行病學分析

2019 年1～7 月，在漳州市7 個養(yǎng)殖場中總共采集到228 份樣品，初篩得到了111 株菌株，這111 株菌株共來源于106 份樣品（由于魚類接種器官有三處，一條魚有可能獲得多株菌株）。經(jīng)PCR 方法檢測和序列比對，確定69 株為副溶血弧菌陽性（菌株信息見表1），陽性率是30.26%。

表1 副溶血弧菌分離株結(jié)果Table 1 Results of Vibrio parahaemolyticus isolates

2.3.1 不同水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分離狀況 因不同類別的水產(chǎn)動物有不同的解剖結(jié)構(gòu)、生理特征和生活習性，副溶血弧菌在不同類別的水產(chǎn)品中的污染情況也不同，結(jié)果見表2。實驗共采集了蝦、羅非魚和石斑魚三種不同的水產(chǎn)樣品，Vp 陽性率分別為38.53%、15.79%和27.69%。蝦類的Vp 陽性率要顯著高于魚類，可能是因為在養(yǎng)殖環(huán)境中蝦更易富集副溶血弧菌。

表2 三種水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分離狀況Table 2 Isolation of Vibrio parahaemolyticus from 3 aquatic products

2.3.2 七個養(yǎng)殖場水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分離狀況 不同養(yǎng)殖場的環(huán)境條件大不相同，因此同種水產(chǎn)品在不同養(yǎng)殖場中副溶血弧菌的分離狀況也不同，結(jié)果見表3。詔安、龍海養(yǎng)殖場的Vp 陽性率明顯高于其他養(yǎng)殖場，這可能由于這兩個養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的水產(chǎn)品種類是蝦的原因所導致的。

表3 七個養(yǎng)殖場水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分離狀況Table 3 Isolation of Vibrio parahaemolyticus from aquatic products of 7 farms

2.3.3 不同月份水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分離狀況不同月份養(yǎng)殖場水體的環(huán)境溫度、濕度、溶氧量等因素差異很大。從表4 中可看出3 月份的Vp 陽性率最高，1 月份陽性率最低，1～7 月份陽性率整體呈上升趨勢，但5～6 月份突然下降。由于漳州市3 月份開始氣溫明顯升高，既有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖，也為副溶血弧菌的污染與傳播提供了條件。5～6 月份陽性率突然下降可能與養(yǎng)殖單位使用抗生素有關(guān)。7 月份漳州地區(qū)的氣溫升至更高水平，副溶血弧菌更容易快速繁殖，所以養(yǎng)殖場水產(chǎn)品陽性率繼續(xù)升高。

表4 七個月份水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分離狀況Table 4 Isolation of Vibrio parahaemolyticus from aquatic products in 7 months

2.4 RAPD 分子分型結(jié)果

本實驗用RAPD 技術(shù)對69 株副溶血性弧菌分離株進行了遺傳性分析，指紋圖譜結(jié)果顯示具有較高的遺傳多樣性（圖4）。利用Ntsys2.10 軟件進行UPGMA 聚類分析，得到系統(tǒng)進化樹（見圖5）。以83%相似度為界，可將69 株副溶血弧菌分為9 個主要基因型。其中Ⅱ群數(shù)量最多，占比37.68%（26/69），包含7 個采樣點的菌株，為副溶血弧菌的優(yōu)勢群。Ⅶ和Ⅳ群均僅含2 株，占比2.9%（2/69），其中Ⅶ群包含2 個采樣點的菌株，Ⅳ群只包含1 個采樣點的分離株。Ⅰ群中僅有1 株來源于魚，其余菌株來源于蝦樣品（89%）。采樣點S6 的分離株在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ群中均有分布，S3 采樣點的分離株在Ⅰ～Ⅶ群中均有分布。

圖4 副溶血弧菌RAPD-PCR 電泳圖Fig.4 Results ofRAPD-PCR of Vibrio parahaemolyticus isolates

圖5 副溶血弧菌的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of different V.parahaemolyticus isolates

3 討論

養(yǎng)殖場是水產(chǎn)食品流通環(huán)節(jié)的上游，也是各種病原菌高密度共生的復雜環(huán)境。為有效控制水產(chǎn)品的安全，科學監(jiān)督和管理養(yǎng)殖環(huán)境中的病原微生物是關(guān)鍵。2019 年1～7 月份，本實驗分析了漳州市7 個不同縣養(yǎng)殖場的水產(chǎn)品中副溶血弧菌的污染狀況。調(diào)查結(jié)果表明了漳州市養(yǎng)殖場的水產(chǎn)動物已被副溶血弧菌一定程度地污染，平均檢測陽性率約為30.26%，比林強等[27]報道的牡蠣養(yǎng)殖環(huán)境中94.38%的檢出率低很多。Kunbawui Park 等[28]對2004～2016 年韓國京南海岸的海水和雙殼類樣品的副溶血弧菌污染情況進行了研究，結(jié)果得到平均檢出率約29%。Silva 等[29]對巴西沿海自然環(huán)境中副溶血弧菌的分布調(diào)查顯示：蘇巴埃河口的分離率大約為75%。通過與國內(nèi)外相關(guān)研究比較分析，漳州市的水產(chǎn)動物養(yǎng)殖環(huán)境中的副溶血弧菌污染為正常水平，合理干預能防止其向下游食物鏈傳播。

Chen 等[6]分析了2010～2014 年浙江省水產(chǎn)市場樣品中的副溶血弧菌污染水平，結(jié)果表明約38%的樣品攜帶該菌。Xie 等[30]考查了南方11 個城市水產(chǎn)品的帶菌狀況，陽性率為43.75%。Yu 等[31]對上海市的水產(chǎn)品帶菌狀況也進行了研究，約30.8%的水產(chǎn)品帶菌。與以上水產(chǎn)市場樣品的分離率比較，本實驗中漳州市養(yǎng)殖環(huán)境的副溶血弧菌攜帶率基本穩(wěn)定，但也存在通過市場流通進一步被放大的風險。

本實驗對蝦、羅非魚和石斑魚三種水產(chǎn)動物的帶菌狀況進行了研究，其中蝦的感染率最高，達到了60.38%?？赡苁且驗樵诒镜貐^(qū)，蝦苗來源比較集中，所以容易通過引種而使病原區(qū)域性擴散。另外，調(diào)查中也對養(yǎng)殖場周圍的大環(huán)境進行了分析，龍海和東山的采樣點養(yǎng)殖規(guī)模雖小，但管理水平一般，且周邊還有其他水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)聚集，這可能是其污染水平較高的原因之一。其中龍海點養(yǎng)殖場呈半開放狀態(tài)，沒有與周邊環(huán)境進行有效的隔離，在場門堆放大量加工后的牡蠣殼。漳浦點企業(yè)規(guī)模較大，產(chǎn)區(qū)嚴格與周邊環(huán)境隔離，入場消毒設(shè)施齊全，有專業(yè)的養(yǎng)殖專家蹲場指導，所以該采樣點的副溶血弧菌檢出率較低。不同采樣月份檢出率不同，隨氣溫升高呈逐漸上升趨勢，但3～4 月份，本地區(qū)的蝦池爆發(fā)了一起小規(guī)模的弧菌病疫情，所以檢出率相對較高，5～6 月份疫情趨緩，7 月份又隨著氣溫升高檢出率再次上升。以上表明：養(yǎng)殖場周邊環(huán)境及科學的管理水平是決定副溶血弧菌污染傳播的重要因素，科學管理及有效的環(huán)境凈化可以保障養(yǎng)殖安全。

本實驗還采用了隨機擴增多態(tài)性DNA 的方法對副溶血弧菌分離株做分子分型。RAPD 將69 個分離菌株分為9 個型，其中Ⅱ型是優(yōu)勢型，總體上呈現(xiàn)基因多態(tài)性分布。從分離的時間上來看，在RAPD 系統(tǒng)進化樹中Ⅱ型包含了所有采樣月份的菌株，而Ⅷ型和Ⅸ型中只有單月的分離株，其他組群中也均包含多個月份的分離株（圖5）。由此可以推測：本地區(qū)養(yǎng)殖場環(huán)境中不同時間點的副溶血弧菌呈現(xiàn)交錯分布，進化關(guān)系復雜，可能與養(yǎng)殖場持續(xù)生產(chǎn)，沒有清除環(huán)境中的污染菌株，導致其持續(xù)性在環(huán)境中存在并進化。從分離點的地理分布上看，9 個組群中只有Ⅱ型包含了所有7 個分離點的菌株，其次是Ⅲ群包含6 個采樣點的分離株，包含4 個采樣點菌株的有Ⅰ、Ⅳ和Ⅵ型，Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ群中均包含2 個采樣點的菌株。值得注意的是Ⅵ型中4 個分離株來自不同的采樣點，而Ⅸ型中是唯一來自同一個地點的群。Ⅴ和Ⅶ群均包含龍海的分離株，而與其同群的另外兩個采樣點東山和詔安距離龍海較遠，分析原因可能是在引進種苗環(huán)節(jié)時污染了同一來源的副溶血弧菌。從RAPD 系統(tǒng)進化樹無法判定不同采樣點與菌株分布的相關(guān)性，整體表現(xiàn)為交錯分布狀態(tài)。以龍海蝦的分離株為例，大體隨著采樣月份菌株呈小規(guī)模聚集，但也有部分菌株均勻分布于進化樹的不同群中，表明該點菌株呈現(xiàn)進化多樣性。RAPD 技術(shù)可以在食源性疾病暴發(fā)流行時，有效地篩選相關(guān)菌株，是一種簡便快速、高效率、易操作的方法[32]。但其也有缺點，如RAPD 標記沒有辦法得到完好的遺傳信息，可重復性與分型能力較低，不同實驗室的結(jié)果無法比較等。如果RAPD 聯(lián)用其他分型技術(shù)，如脈沖場凝膠電泳或核糖體基因分型，可以顯著提高其溯源分辨能力[33]。最后提醒消費者，在享用鮮美的海鮮產(chǎn)品時，要關(guān)注這類食品的安全風險，務(wù)必將食物完全煮熟后再食用，以保證食物中的病原微生物被完全殺死。此外，為減少食源性疾病的發(fā)生，購買海鮮產(chǎn)品，請盡量到正規(guī)的、有經(jīng)營許可的海鮮市場購買。