海洋Arthrobacter protophormiae CDA2-2-2 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶發(fā)酵條件優(yōu)化

張曉彤，張曉萌，蘇永成，武波飛，劉 姝，盧 靜，楊 光，房耀維

（江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇連云港 222000）

幾丁質(zhì)普遍存在于無脊椎動(dòng)物的外骨骼和角質(zhì)層，也是構(gòu)成大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分[1]。全球水產(chǎn)品有機(jī)體中約8%富含幾丁質(zhì)（約占干重的8%～55%），包括蝦、蟹、魷魚、蠔和墨魚等[2-3]。僅在水生生態(tài)系統(tǒng)，幾丁質(zhì)每年的產(chǎn)量就超過1011噸[4]。在生物體中，幾丁質(zhì)常與其它結(jié)構(gòu)物質(zhì)交聯(lián)，在真菌細(xì)胞壁中與β-葡萄糖共價(jià)結(jié)合，在昆蟲等動(dòng)物中與特定的蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成各種有序結(jié)構(gòu)[5-6]。

幾丁質(zhì)是自然界中總量僅次于纖維素的天然多糖和可再生聚合物。幾丁質(zhì)的高結(jié)晶度導(dǎo)致其應(yīng)用受到極大限制[7]。殼聚糖是幾丁質(zhì)分子中乙?；徊糠只蛉棵摮蟮漠a(chǎn)物，因其分子中有大量游離的氨基，故其溶解性能相比幾丁質(zhì)得到很大改善，并具有生物可降解性，廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工、印染、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，具有很大的開發(fā)和推廣潛力[8-9]。

目前，工業(yè)上制備殼聚糖的方法主要是化學(xué)法，即使用濃堿熱解幾丁質(zhì)脫除乙酰基，容易導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，且獲得的殼聚糖產(chǎn)品中乙酰基的脫除程度不一致，產(chǎn)品均一性差[10]。酶法生產(chǎn)殼聚糖作為一種新型綠色環(huán)保的脫乙酰方法，反應(yīng)條件溫和，能耗值相對較低，污染小，可獲得脫乙酰程度均一穩(wěn)定的產(chǎn)品[11]。因此，運(yùn)用幾丁質(zhì)脫乙酰酶生產(chǎn)殼聚糖成為極具潛力的生產(chǎn)方式[12]。目前國內(nèi)外報(bào)道的幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌多為真菌，包括Aspergillus nidulans[13]、Schizosaccharomyces pombe[14]、Puccinia graminis[15]、Fusarium proliferatum[16]等。這些菌株發(fā)酵產(chǎn)酶水平較低，催化溫度較高。

海洋具有低溫、高鹽、寡營養(yǎng)等獨(dú)特多樣的生態(tài)環(huán)境，蘊(yùn)含了豐富的能夠產(chǎn)生新穎催化特性酶類的微生物資源。針對目前產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶微生物菌株發(fā)酵水平較低，催化溫度高等問題。本研究組從連云港高公島海域海泥樣品中篩選獲得一株低溫幾丁質(zhì)脫乙酰酶細(xì)菌Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2。本研究對該菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平，為工業(yè)化酶法催化幾丁質(zhì)脫乙酰制備殼聚糖提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

幾丁質(zhì) 澳新生物工程有限公司；蛋白胨、酵母粉、對硝基-N-乙酰苯胺、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4SO4等試劑均為分析純 上海博微生物科技有限公司；種子培養(yǎng)基（酵母粉0.1%，蛋白胨0.5%，NaCl 1%，陳海水配制，pH7.0）、2216E 培養(yǎng)基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，F(xiàn)ePO40.01%，瓊脂2%，陳海水配制，pH7.0）、發(fā)酵培養(yǎng)基（幾丁質(zhì)0.5%，酵母粉1%，葡萄糖0.5%，MgSO40.01%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，陳海水配制，pH7.0）實(shí)驗(yàn)室自制；陳海水 取天然海水，室溫靜止兩周后紗布過濾。

高速冷凍離心機(jī) 美國SIGMA 公司；分光光度計(jì) 杭州明基科學(xué)儀器有限公司；SPX-250B-2 生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；Nikon 90i 全電動(dòng)顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的制備 將保存于超低溫冰箱里的甘油菌株接到2216E 培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)過夜，接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃，140 r/min 搖床培養(yǎng)1 d 后培養(yǎng)得種子培養(yǎng)液，按2%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，于不同發(fā)酵條件下發(fā)酵后，8000×g 離心10 min，上清液過22 μm 濾膜，即為粗酶液[17]。

1.2.2 酶活的測定 根據(jù)Chai 等報(bào)道的方法制備對硝基乙酰苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。試管中加入30 ℃預(yù)保溫的0.05 mol/L pH7.0 磷酸緩沖液3 mL，200 mg/L的對硝基乙酰苯胺水溶液1 mL，粗酶液1 mL，于30 ℃水浴反應(yīng)15 min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，12000 r/min離心10 min，測定上清液的吸光度（A400)。以添加1 mL 同樣濃度沸水浴滅活15 min 的酶液為對照。酶活單位（U）定義：在上述反應(yīng)條件下每小時(shí)產(chǎn)生對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位[18]。

相對酶活：單因素變量產(chǎn)生的最高酶活為100%，其他因素產(chǎn)生的酶活占最高酶活的比例即為相對酶活（%）。

1.2.3 單因素優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件

1.2.3.1 培養(yǎng)基成分對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵條件：以3%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，以pH7.0、裝液量30%、30 ℃、180 r/min 發(fā)酵48 h 為基本條件，進(jìn)行幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活測定。

碳源的確定：分別添加1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、白砂糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、藕粉。

氮源的確定：分別添加1%的氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、豆粕、米糠、麩皮、黃豆粉、酵母粉。

無機(jī)鹽的確定：分別添加0.015%的KCl、ZnCl2、CaCl2、FeSO4、CuSO4、CoCl2、MgSO4、MnSO4，考察無機(jī)鹽對菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的影響。

1.2.3.2 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)方法：以3%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，以pH7.0、裝液量30%、30 ℃、180 r/min 發(fā)酵48 h 為基本條件，進(jìn)行幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活測定。分別對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、裝液量、初始pH、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素優(yōu)化。接種量：0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%；裝液量：20%、30%、40%、50%、60%；發(fā)酵溫度：20、25、30、35、40、45、50 ℃；初始pH：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；轉(zhuǎn)速：100、120、140、160、180、200 r/min；發(fā)酵時(shí)間：12、24、36、60、72、84、96、108、120 h。

1.2.4 PB 試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖、黃豆粉、MgSO4、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始PH、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)了高（1）低（-1）2 個(gè)水平（表1），運(yùn)用Design-Expert V8.0.6 軟件進(jìn)行12 次PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別對9 個(gè)因素進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定影響相對酶活大小的顯著性因素[19]。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Test factor level of Plackett-Burman

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 在單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和PB 試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對發(fā)酵水平影響顯著的3 個(gè)因子，選定基礎(chǔ)發(fā)酵條件，根據(jù)PB 試驗(yàn)中t 值選定效應(yīng)方向，設(shè)定一定步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)[20]。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和PB 試驗(yàn)結(jié)果，確定具有顯著性的3 因素為變量，以酶活大小為響應(yīng)值，運(yùn)用Design of Experiments設(shè)計(jì)3 因素3 水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素水平表見表2。根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)選擇因素水平。響應(yīng)面發(fā)采用多遠(yuǎn)二次方程來擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)因素，并對模型進(jìn)行驗(yàn)證，以得到菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件[21]。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平表Table 2 Test factor level of Box-Behnken

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3 組平行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（n=3）表示，使用Origin2018 作圖，PB 試驗(yàn)和響應(yīng)面采用Design Expert 10 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，該圖所得線性方程為y=0.0556x+0.00467。該方程決定系數(shù)為0.9997，契合度高。

圖1 對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of p-nitroaniline

2.2 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶條件單因素優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 碳源對CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響如圖2。碳源為葡萄糖時(shí)相對酶活最大，為5.33 U/mL?？扇苄缘矸?、蔗糖和乳糖的相對酶活在75%以上，玉米淀粉和木薯淀粉的相對酶活較低，因此確定碳源為葡萄糖。前期研究發(fā)現(xiàn)，Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2 所產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙?；笧榉钦T導(dǎo)酶，即添加幾丁質(zhì)并不能增加發(fā)酵產(chǎn)酶水平，且?guī)锥≠|(zhì)不溶于水，作為碳源發(fā)酵水平較低，因此在碳源優(yōu)化中沒有添加幾丁質(zhì)[17,22]。

圖2 碳源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響圖Fig.2 Effect of carbon source on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.2 氮源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 氮源對CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響如圖3。氮源為酵母粉時(shí)酶活產(chǎn)酶水平最高，為5.37 U/mL，黃豆粉和豆粕為氮源時(shí)產(chǎn)酶水平達(dá)到最高水平的97%和80%，硝酸銨、硫酸銨為氮源時(shí)產(chǎn)酶水平較低，可能是無機(jī)氮營養(yǎng)單一，而有機(jī)氮源富含微生物活動(dòng)必需的生物因子和微量元素，在生長過程中更易被生物吸收利用或?qū)锥≠|(zhì)脫乙酰酶本身具有激活作用[9]。由于酵母粉價(jià)格昂貴，綜合考慮成本和產(chǎn)酶量，選擇黃豆粉為氮源進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化研究。

圖3 氮源對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響圖Fig.3 Effect of nitrogen source on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.3 無機(jī)鹽對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 無機(jī)鹽對CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響如圖4。無機(jī)鹽為MgSO4時(shí)相對酶活最大為5.28 U/mL，而MnSO4、CoCl2、CuSO4、FeSO4、KCl 的相對酶活在60%以下，因此無機(jī)鹽確定為MgSO4。金屬離子通過影響菌株生長、酶的分泌，以及酶活性從而影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶水平[7]。

圖4 金屬離子對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響圖Fig.4 Effect of inorganic salt on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.4 接種量對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 接種量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖5。隨著接種量的增加，酶活變大，到2%時(shí)產(chǎn)酶最高，最高酶活為5.33 U/mL。接種量大于2%后酶活逐漸變小，因此確定接種量為2%。接種量通過影響發(fā)酵菌株的延遲期，接種量過小，延遲期增長，不利于產(chǎn)酶[12]。

圖5 接種量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.5 Effect of inoculum size on enzyme production of strain CDA2-2-2

2.2.5 裝液量對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 裝液量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖6。裝液量30%～40%時(shí)產(chǎn)酶較高，裝液量高于40%時(shí)，酶活快速下降。裝液量為40%時(shí)相對酶活最高，為5.35 U/mL，因此裝液量確定為40%。裝液量較少時(shí)，產(chǎn)酶水平較高，隨著裝液量增加，溶氧量降低，降低菌株生長及產(chǎn)酶水平[12]。

圖6 裝液量對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.6 Effect of loaded volume on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.6 發(fā)酵溫度對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵溫度對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖7。產(chǎn)酶水平從20 ℃開始隨溫度的升高而增大，在30～35 ℃內(nèi)酶活較高，當(dāng)發(fā)酵溫度超過35 ℃時(shí)，酶活開始迅速下降。35 ℃時(shí)產(chǎn)酶最高，酶活為5.435 U/mL，因此發(fā)酵溫度確定為35 ℃。溫度影響微生物生長及代謝，同時(shí)影響酶活性，因此對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶有明顯影響[23]。

圖7 發(fā)酵溫度對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.7 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.7 培養(yǎng)基初始pH 對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)基初始pH 對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖8。培養(yǎng)基的初始pH 為5.0 或8.0 時(shí)，相對酶活較低。但在pH6.5～7.5 時(shí)，酶活較高，保持90%以上的酶活。pH 為7.0 時(shí)產(chǎn)酶最高，最高酶活為5.41 U/mL，因此初始pH 確定為7.0。

圖8 培養(yǎng)基初始pH 對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖Fig.8 Effect of initial pH on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.8 轉(zhuǎn)速對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 轉(zhuǎn)速對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖9。當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r/min 時(shí)產(chǎn)酶較低，轉(zhuǎn)速為140 r/min 時(shí)產(chǎn)酶最高，相對酶活為5.45 U/mL。當(dāng)轉(zhuǎn)速140 r/min 以上后，酶活開始迅速下降，因此轉(zhuǎn)速確定為140 r/min。轉(zhuǎn)速影響三角瓶內(nèi)的溶氧，從而影響菌株的生長和發(fā)酵產(chǎn)酶水平[12]。

圖9 轉(zhuǎn)速對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of the speed of centrifugal on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.2.9 發(fā)酵時(shí)間對菌株CDA2-2-2 產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵時(shí)間對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖10。隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步增加，相對酶活先上升后呈下降趨勢。發(fā)酵時(shí)間84 h 產(chǎn)酶最高，最高酶活為5.61 U/mL，因此發(fā)酵時(shí)間確定為84 h。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of ferrnentation time on enzyme production of strain CDA-2-2-2

2.3 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選影響酶活大小的顯著因素

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖、黃豆粉、MgSO4、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)了高（1）低（-1）2 個(gè)水平（表1），運(yùn)用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行12 次PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表3），分別對9 個(gè)因素進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定影響相對酶活大小的顯著性因素[22]。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experimental design and results

運(yùn)用Design-Expert V8.0.6 軟件對表3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4 可知，MgSO4、發(fā)酵溫度、葡萄糖對相對酶活大小影響均顯著，且顯著性大小排序?yàn)镸gSO4（X3）＞發(fā)酵溫度（X5）＞葡萄糖（X1）；其他因素對相對酶活大小的影響不顯著。因此選擇MgSO4（X3）、發(fā)酵溫度（X5）、葡萄糖（X1）作為響應(yīng)面模型的考察因素。

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 4 Plackett-Burman analysis of variance of test design

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)可以選擇出對發(fā)酵水平影響顯著的因子，但是不能預(yù)測變量的最佳水平，因此，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，以確定重要因素的最佳水平領(lǐng)域[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。3 個(gè)重要因素在第2 組水平，酶活性達(dá)到最大值，隨后隨著數(shù)值的增加，酶活性下降，因此，選定第2 組因素水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株CDA2-2-2 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵條件

2.5.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)PB 試驗(yàn)結(jié)果確定優(yōu)選的MgSO4（A）、發(fā)酵溫度（B）、葡萄糖（C）3 個(gè)因素為變量，以酶活大小為響應(yīng)值，運(yùn)用Design of Experiments 設(shè)計(jì)3 因素3 水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken 響應(yīng)面分析試驗(yàn)（表6）。

表6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken test design and results

2.5.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多項(xiàng)式方程：

由表7 可知：從F值的大小可以得到，一次項(xiàng)中各因素對幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活的影響順序是B＞C＞A。對幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活的方差分析可得模型P＜0.01，表明該方程模型極顯著，不同處理間的差異性極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著；模型的R2為0.965，說明該模型能解釋96.5%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可以用于預(yù)測最優(yōu)發(fā)酵條件參數(shù)[25]。

表7 幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活的回歸方差分析表Table 7 Regression analysis of variance of chitinic deacetylase activity

響應(yīng)面三維圖11 表明，響應(yīng)面開口朝下，響應(yīng)值隨各自變量的值先增加后減少，說明此模型有突出穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是該模型的最大值。葡萄糖0.5%，當(dāng)MgSO4在0.015%～0.022%，發(fā)酵溫度在35.5～37.5 ℃時(shí)酶活最大；發(fā)酵溫度35 ℃時(shí)，當(dāng)MgSO4在0.015%～0.023%，葡萄糖0.53%～0.59%，酶活力最大；MgSO40.1%時(shí)，發(fā)酵溫度在35.5～38 ℃，葡萄糖0.53%～0.59%，酶活最大。

圖11 MgSO4、發(fā)酵溫度、葡萄糖的交互作用對幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活的影響圖Fig.11 Effects of MgSO4,fermentation temperature and glucose interaction on enzyme activity

2.5.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 使用響應(yīng)面法對發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[24]，得到最佳培養(yǎng)基組合為：MgSO40.01%、發(fā)酵溫度37.76 ℃、葡萄糖0.57%，發(fā)酵產(chǎn)酶活預(yù)測值為14.2932 U/mL。為了保證試驗(yàn)的方便可行，對各個(gè)條件做少許修正進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，MgSO40.01%，發(fā)酵溫度38 ℃，葡萄糖0.57%進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活為14.582 U/mL，與理論值相對誤差＜5%，較優(yōu)化前提高了2.5 倍，優(yōu)化后菌株CDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶水平為14.582 U/mL，高于部分報(bào)道的細(xì)菌發(fā)酵幾丁質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵水平[5，25]，說明響應(yīng)面分析得到的模型準(zhǔn)確可靠且具有實(shí)用性。

3 結(jié)論

采用優(yōu)化發(fā)酵條件提高海洋Arthrobacter protophormiaeCDA2-2-2 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶水平，在考察了單因素對相對酶活影響的基礎(chǔ)上，運(yùn)用PB 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出顯著性影響因素，確定顯著性影響因素為MgSO4、發(fā)酵溫度、葡萄糖。使用響應(yīng)面法對發(fā)酵工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化獲得最佳培養(yǎng)基組合為：MgSO40.01%、發(fā)酵溫度38 ℃、葡萄糖0.57%。在此條件下，幾丁質(zhì)脫乙酰酶水平較優(yōu)化前提高了2.5 倍，達(dá)到14.58 U/mL。本研究僅通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高產(chǎn)酶水平，進(jìn)一步研究可通過誘變育種進(jìn)一步提高發(fā)酵水平，以及對酶基因進(jìn)行克隆和高效表達(dá)和定性進(jìn)化研究，提高發(fā)酵產(chǎn)酶水平，提高酶的比活力和催化晶體幾丁質(zhì)的活性。