負(fù)載槲皮素的酶法糖基化酪蛋白復(fù)合納米粒子的構(gòu)建與表征

樊永康，劉健華，劉 堯，吳曉琴，陳玉峰，沈建福,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江晟泰茶油科技有限公司，浙江衢州 324200）

酪蛋白（Casein，Cas）是牛乳中含量最多的蛋白質(zhì)，約占牛奶蛋白的80%。其由4 種蛋白質(zhì)組成，分別是αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，四種酪蛋白的比例為40:10:35:15[1]。酪蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常豐富[2]，含有人體必需的氨基酸，能夠滿足人體各種營(yíng)養(yǎng)需求。優(yōu)化酪蛋白的性質(zhì)以改善其對(duì)疏水性小分子的包埋及傳遞效果，對(duì)拓寬酪蛋白的應(yīng)用范圍具有重大意義。

槲皮素（Quercetin，Que），化學(xué)命名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，是一種植物類黃酮素，廣泛存在于水果蔬菜中[3]。槲皮素具有抗癌、抗病毒、抗炎等多種生物學(xué)功效[4-7]，但槲皮素的水溶性低的問(wèn)題限制了槲皮素的商業(yè)應(yīng)用。郝建鵬[8]利用大豆卵磷脂和殼聚糖復(fù)合物包埋槲皮素，制備負(fù)載槲皮素的納米微膠囊，以此來(lái)提高槲皮素的水溶性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明：槲皮素經(jīng)過(guò)包埋后，其水溶性大大增加，4 ℃避光保存2 周后仍有91%的殘留率。Li 等[9]用玉米醇溶蛋白和大豆多糖靜電復(fù)合物來(lái)包埋槲皮素以此來(lái)提高水溶性和抗氧化能力。結(jié)果表明，當(dāng)玉米醇溶蛋白與槲皮素的質(zhì)量比為20:1 時(shí)，槲皮素的包埋率最高，為82.5%，抗氧化性比槲皮素水溶液提高了10 倍以上。Nazanin 等[10]利用自組裝法來(lái)制備酪蛋白膠束，并用酪蛋白膠束來(lái)包埋槲皮素，以此來(lái)提高槲皮素的包埋率。結(jié)果表明：被酪蛋白包埋的槲皮素在25 ℃下儲(chǔ)存30 d 后，其仍有90%以上的包埋率。

本文以槲皮素、殼寡糖（Chitosan oligosaccharide，Cos）為原料，采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶法對(duì)酪蛋白進(jìn)行糖基化，并研究糖基化后的產(chǎn)物對(duì)槲皮素的包埋效果。首先制備酪蛋白-殼寡糖（Cas-Cos）糖基化復(fù)合物，并采用超聲自組裝法探究復(fù)合自組裝納米粒子的制備工藝，然后探究其對(duì)槲皮素的包埋機(jī)理、熱穩(wěn)定效果，為其應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白、辣根過(guò)氧化酶（酶活：200 U/g）、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（分子量：14.4-116 KDa）上海阿拉丁生化科技有限公司；殼寡糖（Cos，分子量1 KDa）浙江金殼藥業(yè)有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase，酶活：130 U/g）江蘇一鳴精細(xì)化工有限公司；無(wú)水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈣、三氯乙酸 分析純，上海國(guó)藥試劑有限公司。

UV-2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ 公司；Milli-Q 超純水儀 美國(guó)Millipore 公司；AVATAR370 傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)NICOLET 公司；JEM-1010 透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；高速離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS-90 納米粒徑電位分析儀 英國(guó) Malvern 公司產(chǎn)品；SLHW-4 四聯(lián)加熱數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機(jī)有限公司；HH-S 恒溫水浴鍋 常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子天平 賽多利斯有限公司；HZ-8812S-B 水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)華利達(dá)公司；pHS25 數(shù)顯pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪蛋白糖基化交聯(lián)及修飾產(chǎn)物的制備 參考王曉杰等[11]方法并作適當(dāng)修改。將質(zhì)量濃度為30 g/L的Cas 與質(zhì)量濃度為60 g/L 的Cos 按體積比2:3混合，TGase 的添加量為20 U/g 酪蛋白，用1 mol/L的NaOH 和HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 至7.5，混勻溶液置于37 ℃的水浴鍋中水浴震蕩加熱5 h。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品置于85 ℃的水浴鍋中加熱滅酶5 min，冷卻至室溫，4 ℃下透析7 d，除去未反應(yīng)的殼寡糖，樣品凍干，得到Cas-Cos 糖基化產(chǎn)物。

1.2.2 糖基化樣品中殼寡糖的含量測(cè)定

1.2.2.1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考王曉杰等[11]方法，并作適當(dāng)修改。用氨基葡萄糖鹽酸鹽配制濃度分別為12.5、25、50、100、150、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液各2 mL。上述溶液各取1 mL 加入1 mL的DNS 試劑中，充分混勻，沸水浴加熱5 min，冷卻后各組分別加入4 mL 超純水，以空白組（將氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液換成超純水）調(diào)零，測(cè)定上述溶液在540 nm 處的吸光度值。以氨基葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品中氨基葡萄糖接入量的測(cè)定 參考王曉杰等[11]方法并作適當(dāng)修改。樣品中殼寡糖的含量用mg 氨基葡萄糖/g 蛋白來(lái)表示。取0.01 g 糖基化修飾的酪蛋白樣品于安瓿管中，加入2.5 mL 6 mol/L HCl，通過(guò)氮吹排除管內(nèi)的空氣以防止氧化，用酒精噴燈灼燒安瓿管管口使其密封，放入100 ℃水浴鍋中酸水解8.5 h。取出樣品，冷卻后用濾紙過(guò)濾到10 mL 離心管中，吸取1 mL 樣液，加入1 mL 6 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH，使pH 大于7.5，再?gòu)恼{(diào)節(jié)好pH 值的樣液中取0.5 mL，加入0.5 mL DNS 試劑，沸水浴加熱5 min，冷卻后加入4 mL 蒸餾水，混勻，測(cè)定540 nm 處的吸光度值。帶入氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算修飾樣品中的殼寡糖接入量。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）參考宋春麗等[12]的方法。采用恒壓法電泳分析，分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分比為12%和4%，樣品濃度為2.5 mg/mL，樣品進(jìn)樣量為10 μL，樣品處于入濃縮膠時(shí)的電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后，電壓為120 V，電泳結(jié)束后，進(jìn)行染色和脫色。

1.2.4 酪蛋白-殼寡糖和酪蛋白納米粒子的制備 參考閔敏[13]的方法并作適當(dāng)修改。以納米粒子的平均粒徑和PDI 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)探究納米粒子的最佳制備工藝。Cas-Cos、Cas 的濃度分別為1、2、4、6、8 g/L；超聲功率分別為0、50、100、150、200 W，超聲時(shí)間為6 min；pH 分別為5.8、6.1、6.4、6.7、7.0。每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次。

1.2.5 負(fù)載槲皮素的酪蛋白-殼寡糖和酪蛋白納米粒子的制備 參考于鈺[14]的方法并作適當(dāng)修改。配制Cas、Cas-Cos 的溶液4 g/L，pH 為5.8，取一定量的10 g/L 的Que 乙醇溶液加入20 mL 蛋白質(zhì)溶液中，使蛋白質(zhì)與槲皮素的質(zhì)量比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1，超聲頻率為200 W，超聲時(shí)間為6 min。取0.1 mL 10 g/L 的Que 乙醇溶液加入10 mL蛋白質(zhì)溶液中，磁力攪拌20 min 除去乙醇，將溶液超聲處理6 min 得到負(fù)載Que 的納米粒子溶液。

1.2.6 包埋率（EE）與載藥率（LC）的測(cè)定

1.2.6.1 槲皮素紫外光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制濃度為30 μg/mL 的Que 乙酸乙酯溶液5 mL，取3 mL置于石英皿中，于波長(zhǎng)300～450 nm 處進(jìn)行光譜掃描，得到光譜曲線，進(jìn)行分析。分別配制濃度為2、4、6、8、10 μg/mL 的Que 乙酸乙酯溶液，測(cè)定其在369 nm 處的吸光度值。以槲皮素的濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值y 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.2 EE 與LC 的測(cè)定 參考劉敏的方法[15]，并作適當(dāng)修改。采用分光光度法測(cè)定納米粒子的槲皮素含量。在自組裝納米粒子4 ℃放置24 h 后，取10 mL負(fù)載槲皮素的納米粒子溶液在10000 r/min 下離心10 min，上清液用40 mL 乙酸乙酯萃取，渦旋5 min使充分混合，混合液8000 r/min 離心5 min，分離得到乙酸乙酯相。萃取重復(fù)兩次，合并萃取液。將萃取液用乙酸乙酯適當(dāng)稀釋，測(cè)定369 nm 處的吸光值。計(jì)算槲皮素的包埋率（EE）和載藥率（LC）。

1.2.7 傅利葉紅外光譜分析（FITR）采用溴化鉀壓片法進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，掃描波長(zhǎng)為400～4000 cm-1。

1.2.8 X 射線衍射（XRD）參考Sun 等[16]的方法，并作適當(dāng)修改。將樣品研磨均勻后，在樣品池上鋪平，使用Unisantis XMD-300 型X 射線衍射儀測(cè)定樣品的XRD 光譜。具體參數(shù)為：入射波束發(fā)射狹縫1°，接收狹縫0.1 mm，樣品掃描范圍5°～70°，掃描速度2°/min。

1.2.9 透射電鏡（TEM）和外觀形態(tài)分析 采用JEM-1010（HR）型透射電鏡在200 kV 工作電壓下觀察納米粒子的形態(tài)。取一滴稀釋后的納米粒子樣品置于覆有支持膜的銅網(wǎng)上（40 目），自然晾干后，用醋酸雙氧鈾對(duì)載有樣品的銅網(wǎng)負(fù)染30 s。用濾紙吸走多余的液體后，將樣品置于透射電鏡下觀察、拍照。

1.2.10 熱穩(wěn)定性分析 將1 mg 的槲皮素分散在乙醇和超純水中，制成濃度為0.1 mg/mL 的溶液10 mL，將以上溶液與濃度為0.1 mg/mL 的槲皮素納米粒子溶液分成3 份，分別置于溫度為37、60、99 ℃的水浴鍋中，每隔2 h，取出1 mL 的溶液測(cè)定其中槲皮素殘留量，計(jì)算槲皮素的殘留率。以同濃度同體積的槲皮素水溶液和乙醇溶液作為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)使用Origin 8.0 或Excel 繪制相關(guān)圖表。每次測(cè)試前需更換樣品，且每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cas-Cos 接糖量的分析

Cas-Cos 經(jīng)過(guò)酸水解后，與氨基葡萄糖溶液一起進(jìn)行利用DNS 法進(jìn)行分析。利用DNS 外標(biāo)法分析Cas-Cos 中的氨基葡萄糖接入量。DNS 外標(biāo)法的結(jié)果可以證明殼寡糖已經(jīng)接入到Cas 中。本文中，分別配制含有12.5、25、50、100、150、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，利用氨基葡萄糖溶液得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖1）：y=0.0013x+0.0865（R2=0.9978），x、y 分別是氨基葡萄糖的濃度和吸光度。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得樣品的吸光度為0.143，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得Cas-Cos 的接糖量為43.4 mg/g 蛋白質(zhì)。

圖1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucosamine standard curve

2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)Cas、Cas-Cos 進(jìn)行分析。將電泳膠片分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)和高碘酸-希夫試劑（糖染色），對(duì)比分析電泳膠片的染色結(jié)果，可以確認(rèn)糖基化修飾反應(yīng)。Cas 及其糖基化產(chǎn)物的電泳圖譜如圖2 所示。由圖2A 可知，Cas 的分子量主要分布在25～35 kDa 之間。Cas 經(jīng)過(guò)自身交聯(lián)修飾和糖基化之后，原有的條帶消失，在Cas-Cos 的濃縮膠和分離膠頂端形成新的條帶。這是由于大分子聚合物分子量較大，所以其不能進(jìn)入濃縮膠和分離膠。由圖2B 可以看出，Cas-Cos 也顯示出了粉色條帶，顯示出了特異性的糖染色效果，而標(biāo)準(zhǔn)蛋白（M）和Cas 無(wú)明顯的糖染色效果。結(jié)果表明，Cas 經(jīng)過(guò)糖基化修飾之后在其泳道的頂端生成大分子糖蛋白聚合物，這表明殼寡糖以共價(jià)的形式接入到Cas 中。Sheng 等[17]利用美拉德反應(yīng)使支鏈淀粉共價(jià)接入溶菌酶中，其SDS-PAGE 也顯示出相似的電泳圖，這表明美拉德反應(yīng)也生成了糖蛋白。Guo等[18]利用干法美拉德反應(yīng)制備乳清分離蛋白-甜菜果膠糖基化產(chǎn)物，反應(yīng)5 h 后，SDS-PAGE 圖譜也顯示有較大分子量的聚合物生成，這表明干法美拉德反應(yīng)生成了大分子量的糖蛋白。

圖2 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶Fig.2 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis band

2.3 蛋白質(zhì)濃度對(duì)納米粒子粒徑和PDI 的影響

如圖3a 所示，Cas、Cas-Cos 兩種納米粒子的粒徑隨濃度的增加呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)。n-Cas 納米粒子在蛋白質(zhì)濃度為2 g/L 時(shí)，納米粒子的粒徑為190.2 nm，納米粒子的粒徑隨著濃度的增加呈現(xiàn)出減小的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵诔暪β氏嗤那闆r下，蛋白質(zhì)濃度越低，分散到每個(gè)蛋白質(zhì)分子上的能量就越大，產(chǎn)生較強(qiáng)的剪切作用。當(dāng)剪切力高于一定水平時(shí)，蛋白質(zhì)分子就會(huì)去折疊而發(fā)生聚集[19-20]，使得粒徑較大。因此，在濃度較低的蛋白質(zhì)分子中，剪切作用會(huì)使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)發(fā)生暴露，在疏水性作用力下蛋白質(zhì)重新發(fā)生自組裝形成較為規(guī)則的納米粒子。n-Cas-Cos 納米粒子也表現(xiàn)出同樣的特性，在蛋白質(zhì)濃度為4 g/L 時(shí)，粒徑為126.8 nm。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度逐漸增大，分散到每個(gè)蛋白質(zhì)上的剪切力較小，不均一的蛋白質(zhì)顆粒會(huì)發(fā)生聚集形成納米粒子[13]。同時(shí)，n-Cas 的粒徑要高于n-Cas-Cos，這可能是因?yàn)镃as 經(jīng)過(guò)糖基化后，分子內(nèi)的疏水基團(tuán)暴露更多，疏水作用力加強(qiáng)，蛋白分子間相互作用增加，納米粒子發(fā)生收縮[14]。兩種納米粒子的PDI（如圖3b所示）也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。本文選取4 g/L 作為納米粒子的最佳濃度。

圖3 不同的蛋白質(zhì)濃度對(duì)納米粒子的平均粒徑及PDI 的影響Fig.3 Effect of different protein concentrations on the average particle size and PDI of nanoparticles

2.4 超聲功率對(duì)納米粒子粒徑和PDI 的影響

如圖4 所示，兩種納米粒子的粒徑和PDI 都隨著超聲功率的增加而減小。這表明在一定的超聲功率范圍內(nèi)，納米粒子的粒徑隨著超聲功率的增大變得更加均一，形成較小的納米粒子。在較大的超聲功率下，超聲波的空化作用產(chǎn)生很大的剪切力和壓強(qiáng)，使得粒子間發(fā)生猛烈的碰撞和使原來(lái)伸展在粒子表面的不規(guī)則產(chǎn)物發(fā)生結(jié)構(gòu)斷裂，體系中的粒子形態(tài)更加規(guī)則[13]。當(dāng)超聲功率增加到200 W 時(shí)，n-Cas、n-Cas-Cos 的粒徑分別為167.8 nm 和133.4 nm，PDI 分別為0.213 和0.179。本文選取200 W 作為納米粒子的最佳超聲功率。

圖4 不同的超聲功率對(duì)納米粒子的平均粒徑及PDI 的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic power on the average particle size and PDI of nanoparticles

2.5 pH 對(duì)納米粒子粒徑和PDI 的影響

本文選取5.8～7.0 之間的pH 為考察范圍。當(dāng)pH 低于5.8 時(shí)，蛋白質(zhì)接近等電點(diǎn)，靜電斥力減小，發(fā)生蛋白質(zhì)聚集，形成沉淀。如圖5a 所示，隨著pH 增大，蛋白質(zhì)納米粒子粒徑呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著pH 增大，納米粒子間靜電斥力會(huì)越強(qiáng)，分子間的疏水作用力、氫鍵變?nèi)?，納米粒子結(jié)構(gòu)會(huì)變得松散，蛋白質(zhì)粒徑表現(xiàn)為增加的趨勢(shì)，PDI 也有同樣的趨勢(shì)[21]。因此，本文選取5.8 作為納米粒子自組裝的最佳pH。綜上，在蛋白質(zhì)濃度為4 g/L、超聲功率為200 W、pH 為5.8、超聲時(shí)間為6 min 條件下，n-Cas、n-Cas-Cos 納米粒子的粒徑分別為169.1 nm和125.6 nm、PDI 分別為0.217 和0.161。

圖5 不同的pH 對(duì)納米粒子的平均粒徑及PDI 的影響Fig.5 Effect of different pH on the average particle size and PDI of nanoparticles

2.6n-Cas-Que 和n-Cas-Cos-Que 納米粒子包埋率和載藥率的測(cè)定

由圖6a 可以看出，隨著蛋白質(zhì)與Que 的質(zhì)量比的逐漸增加，包埋率呈現(xiàn)出一直上升并趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到40:1 時(shí)n-Cas-Que 的包埋率為74.14%，而n-Cas-Cos-Que 的包埋率為85.21%。荷載能力分別為1.85%和2.13%。當(dāng)質(zhì)量比較低時(shí)（低于30:1），兩種納米粒子的包埋率較低，原因可能是Que 的含量過(guò)多，導(dǎo)致大量的Que 沒(méi)有被包埋進(jìn)納米粒子的疏水性內(nèi)核中，絕大部分Que 以微晶的形式分散在溶液中；隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量的不斷增大，有更多的Que 被包埋進(jìn)納米粒子的疏水性內(nèi)核中，所以包埋率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與Que 的質(zhì)量比增加到40:1 之后，n-Cas-Que 和n-Cas-Cos-Que 的包埋率增加緩慢，同時(shí)考慮到納米粒子的荷載能力不能過(guò)低，選取Cas、Cas-Cos 與Que 的質(zhì)量比為40:1 作為最佳工藝條件。從圖中還可以看出n-Cas-Cos-Que 納米粒子的包埋率高于n-Cas-Que，這表明蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)糖基化之后，可以提高其對(duì)Que 的包埋效果。原因可能是酪蛋白經(jīng)過(guò)糖基化之后，分子間提供更強(qiáng)的疏水作用力和氫鍵，從而更好的與Que 結(jié)合，提高包埋能力。郝建鵬[8]利用脂質(zhì)體/殼聚糖復(fù)合載體包埋與本研究質(zhì)量相同的槲皮素，得到槲皮素的包埋率為71.14%，低于本研究的包埋率。綜上，酶法糖基化能提高酪蛋白納米粒子對(duì)Que 的包埋效果。

圖6 不同的質(zhì)量比對(duì)槲皮素包埋率和載藥率的影響Fig.6 Effect of different mass ratios on quercetin embedding rate and drug loading rate

2.7 槲皮素納米粒子的紅外特性分析

由圖7 可知，槲皮素有以下特征吸收峰:O-H 伸縮振動(dòng)吸收峰（3385 cm-1）、C=O 伸縮振動(dòng)吸收峰（1658 cm-1）、苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)吸收峰（1513 cm-1、1615 cm-1）、C-O、C-C、C-C-O 的伸縮振動(dòng)吸收峰（1093 cm-1）[22]。

n-Cas 主要有O-H 和N-H 伸縮振動(dòng)吸收峰（3416 cm-1）、C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰（2961 cm-1）、C=O 伸縮振動(dòng)吸收峰（1654 cm-1、酰胺I 帶）、N-H彎曲吸收峰（1538 cm-1、酰胺II 帶）、C-O、C-C、CC-O 的伸縮振動(dòng)吸收（1096 cm-1）等特征峰[23]。當(dāng)n-Cas 包裹槲皮素后，n-Cas-Que 的紅外特性吸收峰與n-Cas 相似，但n-Cas-Que 的紅外吸收峰中無(wú)苯環(huán)骨架等特征吸收峰，這表明Cas 已經(jīng)成功包裹槲皮素。此外，n-Cas 在包裹槲皮素后形成n-Cas-Que 納米粒子，O-H 和N-H 伸縮振動(dòng)吸收峰由3416 cm-1位移至3419 cm-1，C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰由2961 cm-1位移至2964 cm-1處、N-H 彎曲吸收峰由1538 cm-1位移至1540 cm-1，這表明槲皮素與n-Cas 發(fā)生相互作用，作用的方式可能是氫鍵、疏水作用等作用力。

n-Cas-Cos-Que 的特征吸收峰與n-Cas 相似，有O-H 和N-H 伸縮振動(dòng)吸收峰（3405 cm-1）、C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰（2928 cm-1）、C=O 伸縮振動(dòng)吸收峰（1652 cm-1、酰胺I 帶）、N-H 彎曲吸收峰（1539 cm-1、酰胺II 帶）、C-O、C-C、C-C-O 的伸縮振動(dòng)吸收（1076 cm-1）。當(dāng)槲皮素與n-Cas-Cos-Que 作用后，苯環(huán)骨架特征吸收峰消失（1513、1615 cm-1），O-H 和N-H 伸縮振動(dòng)吸收峰由3405 cm-1位移至3420 cm-1、C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰由2956 cm-1位移至2960 cm-1，這也同樣表明了槲皮素與蛋白結(jié)合被包埋進(jìn)蛋白內(nèi)部，作用方式為氫鍵和疏水作用力。

2.8 X 射線衍射（XRD）

X 射線衍射反映了物質(zhì)的結(jié)晶度。在2θ 角度處，如果分子有尖銳的結(jié)晶峰，則表明這種物質(zhì)有結(jié)晶度；如果只有彌散的散峰，則該種物質(zhì)是一種無(wú)定型態(tài)的物質(zhì)，沒(méi)有明顯的的結(jié)晶狀況。如圖8 所示，槲皮素在5.77°、10.27°、11.36°、12.07°、13.20°、14.18°、17.02°、22.24°、26.62°等處有非常尖銳的結(jié)晶峰。然而n-Cas、n-Cas-Cos、n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que 的XRD 都沒(méi)有明顯的大的尖銳峰，均在10°和20°左右存在著小的彌散峰，槲皮素的結(jié)晶峰在兩種納米粒子中均未觀察到，這表明槲皮素已經(jīng)被包埋進(jìn)納米粒子內(nèi)，以無(wú)定型態(tài)的方式分布在納米粒子中[24]。

圖8 槲皮素及各納米粒子的X 射線衍射圖譜Fig.8 X-ray diffraction pattern of quercetin and each nanoparticle

2.9 透射電鏡（TEM）和外觀形態(tài)分析

n-Cas、n-Cas-Que、n-Cas-Cos、n-Cas-Cos-Que 納米粒子的透射電鏡圖如圖9c、9d、9e、9f 所示。從圖9a 和9b 可以看出，Cas 和糖基化的Cas-Cos 在未組裝的情況下呈現(xiàn)出一種比較松散的狀態(tài)且分布不均一，較為零散，這種狀態(tài)下的Cas 和Cas-Cos 非常不利于自組裝，疏水性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很容易從蛋白中析出。這是因?yàn)槔业鞍捉Y(jié)構(gòu)缺乏剛性的三維構(gòu)象[25]。經(jīng)過(guò)超聲自組裝之后，Cas 和Cas-Cos 會(huì)自發(fā)的形成圖9c 和圖9d 中所示的類球狀的納米粒子，n-Cas 和n-Cas-Cos 的粒徑在10～200 nm 之間，這與我們前面所測(cè)的粒徑大小相符。包埋槲皮素后，納米粒子的形態(tài)變化不大，略有增加。但n-Cas-Cos-Que 表現(xiàn)出更好的分散性，Nazanin 等[10]利用酪蛋白自組裝包埋槲皮素和姜黃素，透射電鏡下納米粒子顯示出與圖中相似的形狀。從圖中還可以看出，n-Cas-Cos-Que 粒子的分散效果要好于n-Cas-Que，這與我們前面所測(cè)得的PDI 結(jié)果相符。納米粒子的外觀形態(tài)如圖所示，槲皮素經(jīng)過(guò)包埋之后，增大其水溶性，未出現(xiàn)沉淀。

圖9 納米粒子的外觀圖及TEM 圖像Fig.9 Appearance and TEM images of nanoparticles

2.10 熱穩(wěn)定性分析

Que-水、Que-乙醇、n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que在不同溫度下的熱穩(wěn)定性如圖10 所示。在37 ℃條件下，隨著加熱時(shí)間的的延長(zhǎng)，n-Cas-Cos-Que 表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性。在加熱8 h 后，Que-水、Que-乙醇、n-Cas-Que、n-Cas-Cos-Que 中的槲皮素殘留率分別為53.4%、64.8%、73.2%、87.6%；在60 ℃下也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，加熱8 h 后，槲皮素的殘留率分別為38.9%、42.13%、57.2%、63.5%；在99 ℃下加熱8 h 后，槲皮素的殘留率分別為2.13%、2.41%、4.27%、5.13%。以上結(jié)果表明n-Cas-Cos 能夠提高槲皮素的熱穩(wěn)定性，可能是因?yàn)镃as 經(jīng)過(guò)糖基化交聯(lián)之后，提高了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，對(duì)槲皮素起到了更好的保護(hù)效果。Yang 等[26]利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶法制備乳鐵蛋白-殼寡糖納米粒子，并用這種納米粒子來(lái)包埋蘆丁。熱穩(wěn)定性表明：與未糖基化的乳鐵蛋白相比，乳鐵蛋白-殼寡糖-蘆丁納米粒子在50 ℃下加熱20 h 后，殘留率為60%；而乳鐵蛋白包埋的蘆丁殘留率為51.2%。

圖10 不同的溫度加熱對(duì)槲皮素的殘留率的影響Fig.10 Effect of heating at different temperatures on the residual rate of quercetin

3 結(jié)論

本文利用TGase 催化Cos 糖基化接入Cas，制備Cas-Cos 二元復(fù)合物。然后利用超聲自組裝法制備二元復(fù)合納米粒子，探究其對(duì)Que 的包埋效果和穩(wěn)定效果。結(jié)果如下：Cas 中殼寡糖的接入量為43.4 mg/g 酪蛋白。SDS-PAGE 表明Cos 已經(jīng)成功的接入Cas 中。二元復(fù)合納米粒子的最佳工藝為：pH為5.8、蛋白質(zhì)濃度為4 g/L、超聲功率200 W、超聲時(shí)間為6 min，n-Cas-Cos 納米粒子的粒徑為125.6 nm、PDI 為0.161。蛋白質(zhì)濃度與Que 的比值為40:1時(shí)，復(fù)合納米粒子對(duì)槲皮素包埋率和載藥率為最佳，分別為85.21%、2.13%。FTIR、XRD 表明Que 已經(jīng)成功的包埋進(jìn)納米粒子的疏水性內(nèi)核中，且通過(guò)疏水作用力和氫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，TEM 結(jié)果表明納米粒子成圓球狀且包埋槲皮素前后，納米粒子無(wú)明顯變化。熱穩(wěn)定性表明Cas 經(jīng)過(guò)糖基化后制備的二元復(fù)合納米粒子能夠更好的保護(hù)Que。

本實(shí)驗(yàn)制備的均勻穩(wěn)定的酶法糖基化酪蛋白納米粒子（n-Cas-Cos）能夠顯著提高Cas 對(duì)Que 的包埋效果和保護(hù)效果，提高了Que 的水溶性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步拓寬了酶法蛋白質(zhì)糖基化在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用。在今后的研究中，可建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄈ缧∈螅┨骄縩-Cas-Cos-Que 的體內(nèi)生物利用度和生物學(xué)功效（如降血糖、抗癌等），并嘗試?yán)帽緦?shí)驗(yàn)制備的酶法糖基化酪蛋白納米粒子包埋其他水溶性較差的功能性小分子，將其應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、日化、醫(yī)藥等領(lǐng)域。