云南哈尼族驗方“魔吶奇”抑制缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬流誘導(dǎo)卒中后神經(jīng)保護(hù)研究

張雪玉，鄧儀昊，郭 濤，臧 瑞，武煜明，蔡恩麗

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650000；2. 昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650000)

缺血性腦卒中是危害人類生命健康的一大疾患。目前，全球卒中患者超過8 000萬，而缺血性腦卒中患者占比高達(dá)80%以上[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)血管內(nèi)介入診療雖能恢復(fù)血流，但再灌注后的級聯(lián)反應(yīng)難以控制，往往造成比缺血階段更為嚴(yán)重的缺血再灌注損傷[2]，且有嚴(yán)格的時間窗限制，臨床應(yīng)用嚴(yán)重受限[3]。早在1995年，Nitatori等[4]就在腦缺血模型中檢測到了細(xì)胞自噬并伴有溶酶體活性增強(qiáng)，說明自噬及溶酶體功能是腦缺血疾病發(fā)生發(fā)展的重要風(fēng)險因子。自噬作為溶酶體依賴的嚴(yán)格調(diào)控分解過程[5]，與清除異常蛋白質(zhì)聚集體及受損細(xì)胞器[6]，抵抗軸突結(jié)構(gòu)和功能變性[7-8]，維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。自噬流是近年來提出的新概念，既往研究大多通過檢測自噬體數(shù)量來評價自噬，但單純觀察自噬體的激活或抑制并不能完整動態(tài)地反映自噬在腦缺血過程中的變化[9]。自噬流不僅檢測自噬體數(shù)量，還需動態(tài)監(jiān)測自噬底物來證實底物是否到達(dá)溶酶體，以及自噬水平與自噬底物降解率的變化[10]，故研究缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬流對于進(jìn)一步揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點具有重要意義?！澳绕妗笔窃颇瞎嶙鍙V為流傳、應(yīng)用比較成熟的卒中驗方，本課題組前期研究已證實“魔吶奇”可誘導(dǎo)大鼠腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，改善大鼠卒中后神經(jīng)功能，減輕炎癥反應(yīng)，對腦卒中后的腦組織及神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要保護(hù)作用[11]。在此基礎(chǔ)上，本實驗通過建立大腦中動脈梗死模型，進(jìn)一步觀察“魔吶奇”對大鼠腦缺血損傷后神經(jīng)保護(hù)作用及其與細(xì)胞自噬流的關(guān)系。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠54只，體重200～230 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0004。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食。

1.2藥物 “魔吶奇”制備：天紅地綠15 g、老虎刺皮15 g、滿山香15 g、黑皮跌打15 g、山皮條9 g、大荃麻9 g、藤蕉9 g、松節(jié)9 g、楊梅皮9 g，上述中藥飲片購自云南墨江縣委黨校醫(yī)務(wù)室。用蒸餾水漂洗干凈，磨成粗粉，輔以1 000 mL黃酒，制成生藥濃度約為1.2 g/mL的酒劑，用0.45 μm孔徑混合膜過濾除菌，無菌裝瓶，4 ℃冷藏備用。

1.3試劑及儀器 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、Beclin-1兔多抗、Ubiquitin鼠單抗、P62兔多抗、Beta-聯(lián)蛋白、HRP標(biāo)記的羊抗鼠、HRP標(biāo)記的羊抗兔、DAPI均購自Cell Signaling Technology公司；RIPA組織/細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司； LC3B兔多抗 (Sigma)，CathepsinB鼠單抗(SANTA CRUZ)，LAMP1兔多抗(ABclonal) 。電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)；脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；冰凍切片機(jī)(德國萊卡公司)；熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4實驗方法 將54只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、魔吶奇組，每組18只。除假手術(shù)組(僅分離各血管，不插入栓線，逐層縫合皮膚)外，其余各組均參照改良Longa線栓法[12]制備大鼠左側(cè)大腦中動脈梗死模型，大鼠自然蘇醒后，Longa 5分法[12]評分為1～3分的大鼠為造模成功，進(jìn)行后續(xù)實驗。造模24 h后，魔吶奇組大鼠按2.5 mL/kg的劑量腹腔注射“魔吶奇”(根據(jù)70 kg成人與動物體重藥量折算表及給藥方式生物利用度換算)，模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，均每天1次，持續(xù)腹腔注射14 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1神經(jīng)功能缺損評分及腦梗死體積 注射14 d后，于斷頸處死前對大鼠進(jìn)行改良神經(jīng)缺損評分(mNSS)，分別包括運(yùn)動測試、置地測試、感覺測試、平衡木測試、反射缺失以及有無異常運(yùn)動測試[13]。mNSS評分后，按照TTC染色檢測方法進(jìn)行操作，通過Image J分析軟件測定正常側(cè)和梗死側(cè)腦組織體積，然后計算腦梗死區(qū)域百分比[(左側(cè)大腦梗死白色區(qū)域體積/右側(cè)大腦總體積)×100%]。

1.5.2皮質(zhì)缺血半影區(qū)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 按照 Western blot 檢測方法進(jìn)行操作，其中一抗?jié)舛?Beclin1 1∶500,LC3 1∶12 000,P62 1∶1 000,Ub 1∶1 000,LAMP1 1∶1 000,CathepsinB 1∶1 000 ，以Beta-actin 1∶1 000為內(nèi)參。采用ImageJ 軟件測量條帶灰度值，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平以目的蛋白/內(nèi)參的比值表示。

1.5.3皮質(zhì)缺血半影區(qū)LC3陽性表達(dá)情況 按照免疫熒光雙標(biāo)檢測方法進(jìn)行操作，其中LC3兔多克隆一抗及Neun鼠多克隆一抗?jié)舛葹?∶400，羊抗鼠和羊抗兔熒光二抗?jié)舛葹?∶800，于顯微鏡下調(diào)至高倍鏡視野(×400)，觀察皮質(zhì)缺血半影區(qū)組織細(xì)胞形態(tài)并拍照，采用Image J軟件計算LC3陽性細(xì)胞占比。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能mNSS評分比較 模型組大鼠mNSS評分為(5.16±0.98)分，魔吶奇組mNSS評分為(2.67±0.52)分，魔吶奇組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.2各組大鼠腦梗死體積比較 模型組大鼠梗死腦組織占比為(23.87±3.78)%，魔吶奇組梗死腦組織占比為(18.35±1.75)%，魔吶奇組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3各組大鼠缺血半影區(qū)自噬流相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 模型組大鼠缺血半影區(qū)Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、 LAMP1蛋白表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，P62(Souble)蛋白表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；魔吶奇組大鼠缺血半影區(qū)Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，P62(Souble)蛋白表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的代表性條帶

圖2 各組大鼠缺血半影區(qū)自噬流相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4各組大鼠缺血半影區(qū)LC3陽性神經(jīng)元表達(dá)情況 顯微鏡下觀察到假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)偶見神經(jīng)元LC3表達(dá)，陽性表達(dá)占比為(17.09±2.33)%；模型組大鼠腦皮質(zhì)缺血半影區(qū)內(nèi)可見大量點狀LC3分布于神經(jīng)元細(xì)胞，陽性表達(dá)占比為(30.35±3.2)%；魔吶奇組大鼠腦皮質(zhì)缺血半影區(qū)內(nèi)LC3陽性神經(jīng)元數(shù)量較少，陽性表達(dá)占比為(24.81±4.31)%。模型組LC3陽性表達(dá)率明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，魔吶奇組明顯低于模型組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠缺血半影區(qū)LC3陽性神經(jīng)元表達(dá)情況

3 討 論

缺血性腦卒中歸屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，中風(fēng)多發(fā)生于老年人，病機(jī)特點為元氣不足，瘀血阻絡(luò)[14]，其中氣虛血瘀為中風(fēng)病機(jī)關(guān)鍵，治宜益氣活血化瘀[15]?！澳绕妗痹诠嵴Z中意譯為“中風(fēng)、風(fēng)濕麻木藥”，全方活血兼止血、行氣，能起到氣順血行、開閉通腑的作用，對氣滯痰凝、經(jīng)絡(luò)痹阻導(dǎo)致的卒中后半身不遂、肢體痿弱不用有良好療效[16]，輔以黃酒，入血分，能溫運(yùn)血脈，以助藥勢，達(dá)到補(bǔ)氣活血之功。

在腦缺血早期，激活自噬可加速變性蛋白的清除，挽救大腦殘存的神經(jīng)元功能[17]。隨著腦缺血發(fā)展，蛋白質(zhì)聚積物越來越多，自噬溶酶體活性不足，最終自噬的過度激活、不足或缺陷均可加速細(xì)胞死亡進(jìn)程[18-19]。由此可見，在腦缺血晚期，通過調(diào)控自噬預(yù)防和治療疾病的關(guān)鍵是維持自噬穩(wěn)態(tài)，保證自噬流的通暢。Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、P62(Souble)蛋白水平可反映自噬活性的強(qiáng)弱。Beclin-1是自噬啟動的關(guān)鍵蛋白，參與自噬隔離膜的形成，隔離膜通過LC3與P62相互作用被吸收到隔離體中，自噬體生長在隔離體表面[20]，LC3亞型LC3Ⅱ和可溶性P62(Souble)可作為自噬體的標(biāo)記蛋白[21]。自噬底物募集蛋白P62有可溶性和不可溶性之分[22]，細(xì)胞發(fā)生自噬時，自噬體通過細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)將其包裹物運(yùn)輸至溶酶體，自噬底物募集蛋白P62將破損蛋白及大分子物質(zhì)經(jīng)過泛素化蛋白Ubiquitin修飾后與LC3Ⅱ一同運(yùn)送至溶酶體途徑降解[23]，溶酶體降解率受體內(nèi)酸性水解酶 CathepsinsB影響[24]，溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1反映了溶酶體完整性[25]， CathepsinB及LAMP1共同參與溶酶體降解過程，可以顯示溶酶體功能的變化。而不溶性P62(Insouble)、泛素化蛋白Ubiquitin蛋白能反映自噬產(chǎn)物降解水平。上述自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平可以完整反映自噬與溶酶體清除之間的動態(tài)平衡情況，是判斷自噬流是否通暢的依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)上調(diào)，P62(Souble)表達(dá)下調(diào)，提示大鼠腦缺血14 d后，半影區(qū)自噬活性增強(qiáng)；且P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1表達(dá)顯著上調(diào)，推斷為應(yīng)對腦缺血的發(fā)展，大量溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1及酸性水解酶蛋白CathepsinB活化，但也不能充分降解胞內(nèi)大量異常積聚的自噬體和底物，導(dǎo)致底物P62(Insouble)及泛素化蛋白Ubiquitin在自噬下游堆積，阻礙自噬流通暢。提示自噬溶酶體清除障礙及缺陷導(dǎo)致大腦中動脈梗死大鼠腦中存在大量的自噬體和自噬溶酶體，故免疫熒光檢測見大量LC3表達(dá)于Neun，且大鼠神經(jīng)功能表現(xiàn)嚴(yán)重缺損及腦梗死體積顯著增加。而魔吶奇組Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)下調(diào)，P62(Souble)表達(dá)有增高，免疫熒光可見定位于Neun的LC3占比減少，提示“魔吶奇”可抑制缺血半影區(qū)自噬活性； P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1表達(dá)顯著下調(diào)，表明“魔吶奇”可減少自噬產(chǎn)物堆積，同時大鼠神經(jīng)功能損傷顯著逆轉(zhuǎn)，腦梗死體積占比減少。

綜上所述，持久的缺血損傷或高水平的自噬消耗引起溶酶體功能障礙及溶酶體活性不足，導(dǎo)致過量自噬體及底物在神經(jīng)元中異常集聚，最終觸發(fā)細(xì)胞死亡。故防止過量自噬體和底物的積累，保障自噬流通暢是一個潛在的治療靶點，能有效改善缺血性損傷?！澳绕妗笨赏ㄟ^抑制皮質(zhì)缺血半影區(qū)過度誘導(dǎo)的自噬流，保障自噬與溶酶體清除動態(tài)維穩(wěn)，有效逆轉(zhuǎn)缺血誘導(dǎo)的過量自噬產(chǎn)物滯留，促進(jìn)自噬流通暢，從而顯著逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損傷，發(fā)揮卒中后神經(jīng)保護(hù)作用。最近一項研究表明過度的自噬可以通過溶酶體系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，抑制自噬可以穩(wěn)定溶酶體膜，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號通路，這揭示了缺血性腦卒中中自噬的“黑暗面”[26]。對于“魔吶奇”抑制缺血性腦卒中后自噬與凋亡之間的關(guān)系及對其神經(jīng)元的最終影響有待深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。