禽流感H5亞型流行病學(xué)監(jiān)測調(diào)查

文│呂艷秋 黃東風(fēng) 姚學(xué)軍 康曉杰 劉志忠 白若雨 薛勇 王岳偉 邱海蓮 劉鑫 袁夢儀（北京市昌平區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

張震東（北京市昌平區(qū)中醫(yī)院）

陳繼鋒（北京市昌平區(qū)流村鎮(zhèn)動(dòng)物衛(wèi)生防疫站）

趙志榮（北京市昌平區(qū)十三陵鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心）

禽流感作為影響禽業(yè)發(fā)展的主要疫情，在世界范圍內(nèi)時(shí)有發(fā)生，2020年在國內(nèi)外均有H5N6亞型和H5N8亞型高致病性禽流感疫情發(fā)生的報(bào)道，給養(yǎng)殖者造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

為了了解北京市昌平區(qū)高致病性禽流感防控措施的效果，筆者隨機(jī)抽檢了一個(gè)存欄量40000只蛋雞的養(yǎng)殖場，該場雞只均經(jīng)過重組禽流感病毒（H5＋H7）三價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，H5N1 Re-11株＋Re-12株，H7N9H7-Re2株）的免疫。并且免疫在有效期內(nèi)，抽檢30只蛋雞血樣，采用HA-HI試驗(yàn)檢測免疫抗體；抽檢30只雞的咽喉和肛門拭子，采用膠體金技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)檢測AIV抗原。通過隨機(jī)抽檢，及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情隱患，并確保禽群處于有效抗體保護(hù)。

一、材料

1.疫苗及檢測試劑。

（1）使用疫苗為重組禽流感病毒（H5＋H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11株＋Re-12株，H7N9 H7-Re2株），生產(chǎn)廠家為哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司。

（2）AIV H5亞型Re-11/ Re-12血凝抑制試驗(yàn)抗原和陽性血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

（3）雞紅細(xì)胞懸液購自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為SPF級(jí)公雞紅細(xì)胞。

（4）禽流感病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司。

（5）禽流感H5亞型抗原檢測卡（膠體金法）購自鄭州中道生物技術(shù)有限公司。

以上疫苗和試劑均在有效期內(nèi)，為合格產(chǎn)品。

2.被檢動(dòng)物。被檢動(dòng)物來自昌平區(qū)某養(yǎng)雞場。

二、方法

1.被檢動(dòng)物。

（1）昌平區(qū)某雞場蛋雞存欄量40000只，隨機(jī)抽檢臨床健康的成年蛋雞60只。

（2）免疫期。雞群免疫重組三價(jià)滅活疫苗后1～3個(gè)月內(nèi)。

（3）樣品數(shù)量。雞血樣品30份；咽喉/肛門拭子樣品分2組，各30份，即同一只雞分別采集咽肛拭子各2份。

2.抗體檢測。將采集的血樣離心，分離血清，血凝抑制（HI）試驗(yàn)法測定抗體效價(jià)。具體操作參照GB/T18936—2003進(jìn)行。禽流感抗體血凝抑制試驗(yàn)（HI）抗體效價(jià)≥24判定為合格。禽群免疫抗體合格率≥70%判定為合格。

3.抗原檢測。

（1）膠體金法。用棉簽拭子取新鮮的蛋雞排泄物或喉氣管分泌物約0.1克或100微升，立即將棉簽拭子插入裝有樣品稀釋液的樣品管內(nèi)，充分?jǐn)噭?dòng)，直至棉簽拭子上的樣品全部溶入稀釋液，將棉簽在管壁上擠干后丟棄，樣本液靜置備用，用禽流感H5亞型抗原檢測卡（膠體金法）檢測抗原，具體操作參照禽流感H5亞型抗原檢測卡（膠體金法）使用說明書。樣品加入加樣孔后，與膠體金標(biāo)記物一起沿層析膜移動(dòng)，若樣本中存在AIV-H5抗原，則與膠體金標(biāo)記物結(jié)合使檢測線顯示紫紅色；若樣本中不存在AIV-H5抗原則不產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

（2）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法。用棉拭子取蛋雞新鮮呼吸道分泌物或排泄物，置于50%甘油生理鹽水中，采用禽流感病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法檢測病毒，具體操作參照《禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》（GB/T 19438.1-2004）。

三、結(jié)果

隨機(jī)抽檢昌平區(qū)某養(yǎng)雞場臨床健康的成年蛋雞60只，血液樣品30份。用于血凝抑制（HI）試驗(yàn)法測定抗體效價(jià)；咽喉/肛門拭子分2組，各30份（即同1只雞分別采集咽肛拭子各2份）。其中，30份采用禽流感H5亞型抗原檢測卡（膠體金法）檢測抗原，另30份蛋雞的咽喉/肛門拭子樣品，采樣實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法檢測病毒。血液樣品共計(jì)30份，咽肛/拭子樣品共計(jì)60份，檢測結(jié)果見表1、表2。

從表1中可以看出，檢測免疫后37天的蛋雞群，隨機(jī)抽檢30份血樣， AIV-H5N1 Re-11平均免疫抗體合格率為100%；其中2份樣品免疫抗體為5log2，3份樣品免疫抗體為6log2，16份樣品免疫抗體為7log2，6份樣品免疫抗體為8log2，3份樣品免疫抗體為9log2。AIV-H5N1 Re-12平均免疫抗體合格率為100%；其中2份樣品免疫抗體為5log2，3份樣品免疫抗體為6log2，16份樣品免疫抗體為7log2，6份樣品免疫抗體為8log2，3份樣品免疫抗體為9log2。

表1 雞群AIV H5N1 Re-11＋Re-12免疫抗體檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

從表2中可以看出，30份咽肛拭子，經(jīng)膠體金法檢測AIV抗原，結(jié)果全部為陰性；另一組30份咽肛拭子樣品，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)方法檢測AIV，結(jié)果全部為陰性。

表2 雞群AIV-通用型/H5檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

四、討論與小結(jié)

此次監(jiān)測AIV-H5亞型抗體，檢測免疫后37天的蛋雞群，隨機(jī)抽檢30份血樣， AIV-H5N1 Re-11平均免疫抗體合格率為100%，免疫抗體在較高的水平。高于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的禽群免疫抗體合格率≥70%判定為合格的標(biāo)準(zhǔn)。

監(jiān)測蛋雞群AIV-H5亞型抗原，30份咽肛拭子，經(jīng)膠體金法檢測AIV抗原，結(jié)果全部為陰性；另一組30份咽肛拭子樣品，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)方法檢測AIV，結(jié)果全部為陰性。群體未檢測出禽流感病毒。

在昌平區(qū)范圍內(nèi)的養(yǎng)殖場及養(yǎng)殖戶嚴(yán)格落實(shí)制訂防疫制度，包括進(jìn)行重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗的免疫，實(shí)施封閉管理，定期消毒，飼養(yǎng)人員每天進(jìn)出雞舍更換工作服，并且紫外線和消毒液消毒，病死禽只無害化處理等綜合防控技術(shù)。

五、結(jié)論

從此次AIV抗原抗體抽檢結(jié)果得出，北京市昌平區(qū)規(guī)模蛋雞群未檢測出禽流感病毒，AIV-H5亞型免疫抗體處于較高的保護(hù)水平。