豬瘟E2滅活疫苗與活疫苗免疫效果比較

文│齊亞輝（陜西省動物衛(wèi)生與屠宰管理站）

朱寶（陜西省動物疫病預防控制中心）

韓永剛（陜西省漢中市漢臺區(qū)畜牧獸醫(yī)技術推廣中心）

馮樹濤（陜西省靖邊縣寧條梁區(qū)域農(nóng)牧工作站）

豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟或古典豬瘟，是豬的一種急性、發(fā)熱接觸性傳染病，在自然條件下只感染豬。該病流行范圍很廣，而且致死率極高，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重危害。目前，豬瘟流行地區(qū)或國家主要采用接種C株弱毒疫苗的方法作為預防豬瘟的主要策略，但接種弱毒疫苗的傳統(tǒng)預防控制方法無法區(qū)別疫苗免疫抗體和自然野毒感染抗體，為了采用血清學方法凈化消滅豬瘟，新型基因標記疫苗的研究已經(jīng)迫在眉睫。近些年陸續(xù)有國內(nèi)外研究者應用分子生物學和基因工程方法，對豬瘟野毒株或弱毒株進行基因修飾構(gòu)建出新毒株，其中以Erns（或E0）和E2為基礎構(gòu)建新毒株的方法占據(jù)著重要地位。有中國臺灣研究者利用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)成功表達了重組豬瘟E2蛋白，并在其后的動物保護試驗中獲得成功。國內(nèi)研究者對亞單位疫苗的研究比較深入，一個商品化的桿狀病毒表達的重組E2亞單位疫苗已成功注冊，并推廣使用。此外，還有其他學者正在研究CHO表達E2等。

豬瘟C株活疫苗可以誘導產(chǎn)生針對不同強毒株和各種基因群的免疫保護，臨床保護率可達100%，被行業(yè)認定為控制豬瘟的“金標準”疫苗。但是經(jīng)典的C株疫苗不能區(qū)分主動免疫和自然野毒感染動物，為了完成中國《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》及《國家豬瘟防治指導意見（2017—2020年）》中的到2020年年底，全國所有種豬場和部分區(qū)域達到豬瘟凈化標準，并進一步擴大豬瘟凈化區(qū)域范圍的要求，新型豬瘟標記疫苗將在凈化、消滅豬瘟的過程中發(fā)揮重要作用。

當前，規(guī)模豬場開展豬瘟凈化時，需要先成為豬瘟穩(wěn)定控制場，即在進行豬瘟E2蛋白桿狀病毒重組滅活疫苗免疫6～8個月后的豬群中，完全清除所有豬瘟自然野毒感染產(chǎn)生的E0抗體陽性的豬只?？梢钥闯?，目標豬場內(nèi)進行豬瘟E2蛋白桿狀病毒重組滅活疫苗免疫是創(chuàng)建豬瘟穩(wěn)定控制場的一項必要步驟。因此，開展豬瘟病毒E2蛋白滅活疫苗及豬瘟C株活疫苗產(chǎn)品臨床免疫效果評價，是保證豬瘟免疫效果的必要工作。

漢臺區(qū)是陜西省漢中市政治、經(jīng)濟、文化中心，近年來隨著城鎮(zhèn)化快速發(fā)展，養(yǎng)殖用地逐年減少，生豬集約化飼養(yǎng)成為該區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的主攻方向。為此，開展不同豬瘟疫苗免疫效果評價，提高養(yǎng)殖場豬瘟防控水平，客觀評估疫情壓力及傳播風險，為經(jīng)典豬瘟防控提供技術支撐。

一、材料與方法

1.兩種豬瘟疫苗免疫方法。對比試驗豬場為規(guī)模養(yǎng)殖場，母豬存欄量540頭。實行程序化免疫。

豬瘟E2滅活疫苗：母豬于2018年7月26日普免50頭，免疫劑量為2毫升/頭；保育豬免疫日齡30天，免疫98頭，免疫劑量為2毫升/頭；5號育肥圈育肥豬首次為30日齡免疫C株活疫苗，60日齡二免滅活疫苗2毫升/頭，免疫50頭。

豬瘟C株活疫苗（脾淋）：全場剩余母豬于2018年7月27日普免，免疫劑量為2頭份/頭；保育豬、育肥豬首免日齡30天，55日齡二免；5號育肥圈育肥豬首次為30日齡免疫C株活疫苗，60日齡二免豬瘟活疫苗2頭份/頭，免疫300頭。

母豬上述豬瘟疫苗均每間隔4個月加強1次。

2.樣品采集。按照總體隨機抽樣的方式，保育豬在75日齡進行血液樣本采集；育肥豬在125日齡進行采樣；母豬在10月21日（疫苗免疫后85天）進行采樣。全血置室溫下自然凝固，分離血清于離心管中，編號后于－20℃保存待檢。本次共采集血清樣本母豬20份、保育豬20份、育肥豬20份；其中，豬瘟E2滅活疫苗、豬瘟C株活疫苗（脾淋源）各10份。

3.檢測方法。選用在疫苗免疫后早期抗體檢測中敏感性明顯高于進口阻斷ELISA試劑盒，而特異性與之沒有明顯差異的國產(chǎn)豬瘟間接ELISA試劑盒，操作步驟按照試劑盒說明進行。

4.儀器設備。Sunrise酶標儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、普蘭德移液槍（10～100微升、20～200微升）八道移液器、超純水機、微量振蕩器、量杯、200微升一次性槍頭等。

5.檢測試劑。豬瘟抗體間接ELISA檢測試劑盒，由北京世紀元亨動物防疫技術有限公司提供，有效期20190917。

6.判定標準。

（1）試驗結(jié)果同時符合下列條件，方為有效：陰性對照OD450平均值應≤0.20，本試驗中陰性對照OD450平均值＝（0.090+0.087）/2＝0.0885≦0.20；兩孔陽性對照OD450平均值應≥0.80，本試驗中陽性對照OD450平均值＝（1.45+1.387）/2＝1.4185≥0.80。均符合試驗要求條件，試驗有效。

（2）結(jié)果的判定。陽性：樣品OD450值≥陽性對照OD450平均值×0.3，即CSFV抗體陽性。本試驗陽性樣品判定條件為：1.4185×0.3＝0.4256；可疑：陽性對照OD450平均值×0.3≥樣品OD450值≥陽性對照OD450平均值×0.25，應再進行雙孔復試，若任意孔或兩孔均為陽性，則視為CSFV抗體陽性；若任意孔或兩孔均為陰性，則視為CSFV抗體陰性。本試驗中：1.4185×0.3＝0.4256≥樣品OD450值≥1.4184×0.25＝0.3546為可疑；陰性：樣品OD450值≤陽性對照OD450平均值×0.25，即CSFV抗體陰性。本試驗中：樣品OD450值≤1.4184×0.25＝0.3546為陰性。

7.數(shù)據(jù)處理。利用計算機統(tǒng)計分析軟件對結(jié)果進行對比分析，檢驗采用卡方檢驗，檢驗水平取0.05。

二、檢測結(jié)果

本次豬瘟疫苗免疫效果對比試驗結(jié)果見表1。

表1 對比試驗結(jié)果

三、討論與分析

豬瘟疫苗不同生產(chǎn)工藝抗原含量差距較大，相應工藝之間抗原含量標示方法也有較大差異；本次選用種度代次較低的脾淋C株疫苗進行對比；活疫苗可很快誘導細胞免疫，免疫早期檢測不到中和抗體的情況下，豬卻能抵抗強毒的攻擊，說明免疫早期細胞免疫的作用更加重要。如果接種后晚些時間攻毒，豬群中和抗體水平與攻毒保護之間呈一定相關性。張東東、寧宜寶等研究顯示抗體中和檢測方法（FVNT）與間接ELISA檢測方法對免疫豬血清抗體由陰轉(zhuǎn)陽的檢出時間大致一樣，而與阻斷ELISA試劑盒相差較大，因此雖然本次僅對兩種疫苗各階段豬只免疫抗體的間接ELISA檢測結(jié)果進行了比對研究，但比較結(jié)果仍具有一定指導意義。

對比試驗中豬瘟E2滅活疫苗與豬瘟（脾淋源）疫苗母豬、育肥豬、保育豬免疫抗體效價OD值數(shù)據(jù)經(jīng)兩樣本均數(shù)T檢驗分析分別為：母豬，t＝9.1283、P＜0.001（t0.001＝3.922），差異極其顯著；育肥豬，t＝3.8511、P＜0.01（t0.01＝2.878），差異極顯著；保育豬，T＝2.5455、P＜0.05（t0.05＝2.101），差異顯著。

本次試驗中豬瘟E2滅活疫苗與豬瘟（脾淋源）活疫苗免疫抗體效價OD值離散度分別為：母豬，7.08%、8.90%，差異不顯著；育肥豬16.09%、25.67%，豬瘟E2滅活疫苗免疫組整齊度更好；保育豬，24.83%、18.85%，豬瘟（脾淋源）活疫苗免疫組整齊度更好。

保育豬豬瘟E2滅活疫苗抗體效價OD值離散度大于（脾淋源）活疫苗加強免疫組，原因可能是本次試驗中鑒于母豬是初次免疫豬瘟E2滅活疫苗，且仔豬豬瘟E2滅活疫苗免疫受母源抗體影響較小，為保持豬場免疫程序穩(wěn)定，仔豬豬瘟E2滅活疫苗免疫安排在30日齡（疫苗說明書推薦首免日齡為70日齡），根據(jù)疫苗說明書使用方法，之后未再進行加強免疫；其次斷奶仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全也是原因之一，因此保育豬階段尚需要更多的試驗數(shù)據(jù)進行免疫效果對比。