紙片協(xié)同試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶檢測的價(jià)值

張逸 朱錢迎 張青 陳霜 夏菲 戴其鋒 錢定良

碳青霉烯酶是指可以水解碳青霉烯類抗菌藥物如美羅培南（MEM）和亞胺培南的一類β-內(nèi)酰氨酶，它包括Ambler分子結(jié)構(gòu)分類的A、B、D三類酶。其中A類酶、D類酶為絲氨酸酶，B類酶為金屬酶，A類酶的活性可以被硼酸類化合物所抑制；B類酶分布廣泛，活性可被乙二胺四乙酸鈉（EDTA）所抑制；D類酶主要為OXA型碳青霉烯酶[1]，其活性不被酶抑制劑和EDTA抑制。近年來，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）遍布全球，由于逐年升高的檢出率和高歸因死亡率，已構(gòu)成了重大的公共衛(wèi)生威脅[2]。CRE對碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制分為兩類：一為產(chǎn)碳青霉烯酶，二為一些非產(chǎn)酶的機(jī)制，產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE最常見的耐藥機(jī)制，且已有文獻(xiàn)證實(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE）比非產(chǎn)碳霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌毒性大、預(yù)后差、易傳播且病死率高[3]，因此，臨床需要一種快速、準(zhǔn)確的方法來檢測碳青霉烯酶并區(qū)分類型而指導(dǎo)臨床用藥。本研究參考2017年歐洲藥敏試驗(yàn)委員會（EUCAST）推薦的碳青霉烯酶表型檢測試驗(yàn)，以PCR耐藥基因序列分析為金標(biāo)準(zhǔn)，評估紙片協(xié)同試驗(yàn)用于CPE檢測的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2015年1月至2018年12月瑞安市人民醫(yī)院從各種臨床標(biāo)本中分離非重復(fù)送檢的可疑CPE共75株，其中肺炎克雷伯菌51株，大腸埃希菌17株，陰溝腸桿菌3株，霍氏腸桿菌1株，產(chǎn)氣腸桿菌1株，產(chǎn)酸克雷伯菌1株，布氏檸檬酸桿菌1株；來自血液24株（32.0%），尿液20株（26.7%），痰液12株（16.0%），其他無菌體液胸腹水、膽汁、分泌物等19株（25.3%）。來自男性患者54株（占72.0%），女性患者21株（占28.0%），患者平均年齡64歲。同時(shí)選取非CPE 10株作為陰性對照組。

1.2 主要試劑與儀器 Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀、Vitek-MS及其配套板卡購自法國生物梅里埃公司；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀和電泳儀購自美國Bio-Rad公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購自上海生工生物有限公司；2×Taq Master Mix及DNA marker購自上海生工生物有限公司；50×TAE、瓊脂糖、GoldViewTM核酸染料購自上海賽百威基因技術(shù)有限公司；苯基硼酸（PBA）購自美國Sigma公司；氯唑西林購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；EDTA購自上海生工生物有限公司；MEM紙片（10 μg）、哌拉西林-他唑巴坦（TZP）紙片（110 μg）購自英國Oxid公司；替莫西林紙片（30 μg）購自意大利Liofilchem公司；哥倫比亞血瓊脂平板、M-H培養(yǎng)基購自廣州迪景微生物科技有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選、鑒定及藥敏 將收集到的菌株進(jìn)行MEM、TZP紙片擴(kuò)散法，藥敏結(jié)果參照CLSI2017年標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)EUCAST指南，MEM抑菌圈直徑＜28 mm（除外25～27 mm且TZP敏感或中介）為可疑CPE（流程見圖1）。所有篩選出的CPE菌株均采用法國梅里埃公司ViteK MS質(zhì)譜儀進(jìn)行菌株鑒定并采用Vitek2 Compact微生物分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，由中國疾病預(yù)防控制中心提供。

圖1 CPE檢測流程圖（1：沒有協(xié)同，也可能是菌株體內(nèi)存在幾種碳青霉烯酶，此時(shí)需要分子方法；2：MBL為B類金屬酶；3：替莫西林高水平耐藥是MIC＞128 mg/L，或抑菌圈≤10 mm。這是OXA-48的表型標(biāo)志；4：R代表耐藥；5：S代表敏感）

1.3.2 碳青霉烯酶耐藥基因的檢測 35℃培養(yǎng)24 h復(fù)蘇待測菌株，用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA待用。采用PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM-1、blaOXA-48）、ESBL 基因 （blaCTXM-1、blaCTX-M-9）、AmpC 酶基因（blaDHA、blaEBC）。所用引物序列及退火溫度見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像并記錄。

表1 耐藥基因PCR引物

1.3.3 碳青霉烯酶表型確認(rèn)試驗(yàn)

1.3.3.1 抑制劑紙片的制備 用打孔器制作直徑6 mm的圓形濾紙，分裝、高壓滅菌備用。取PBA 60 mg溶解于1.5 ml的二甲基亞砜中，加入1.5 ml蒸餾水，配成20 mg/ml的溶液[4]；取氯唑西林75 mg溶解于1 ml蒸餾水中，配成75 mg/ml的溶液[5]；稱取3.72 g EDTA-Na2加入200 ml的干凈燒杯中，加入75 ml蒸餾水，邊攪拌邊用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，定容至1 000 ml，配成濃度為0.1 mmol/L的溶液[6]，配置完成后，均高壓滅菌后備用。將20 mg/ml PBA、75 mg/ml氯唑西林、0.1 mmol/L EDTA各取10 μl分別滴加于空白紙片制成抑制劑紙片，干燥30、60 min內(nèi)使用。

1.3.3.2 紙片協(xié)同試驗(yàn) 根據(jù)CLSI指南進(jìn)行紙片藥敏試驗(yàn)，挑取血平皿上35℃培養(yǎng)18～24 h的待測菌落，用無菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?；將菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平皿上，靜置10 min待干燥；每個(gè)接種受試菌的MH平板平均分成兩部分，其中一部分貼上MEM紙片，在MEM紙片左右兩側(cè)貼上PBA、氯唑西林紙片，與MEM紙片距離均為1～2 cm，另一部分MEM紙片周邊貼EDTA紙片，與MEM紙片距離為1～2 cm；當(dāng)結(jié)果顯示PBA和EDTA協(xié)同試驗(yàn)均無協(xié)同作用時(shí)，再進(jìn)行替莫西林紙片擴(kuò)散法。MEM抑菌圈靠近抑制劑紙片一側(cè)明顯擴(kuò)大者為陽性，協(xié)同試驗(yàn)的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 PBA、氯唑西林、EDTA協(xié)同試驗(yàn)和替莫西林紙片擴(kuò)散結(jié)果判定

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算PBA協(xié)同試驗(yàn)、EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值，分別與基因檢測結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)分析：Kappa值＞0.75，說明兩種方法診斷結(jié)果一致性較好；Kappa值在0.4～0.75，說明一致性一般；Kappa值＜0.4，說明一致性較差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果 可疑CPE對大部分β-內(nèi)酰胺類藥物呈高度耐藥，耐藥率接近100.0%，對阿米卡星的耐藥率為48.0%。不同菌屬中CPE菌株對不同抗菌藥物的耐藥率見表3。10株非CPE中大腸埃希菌8株，陰溝腸肝菌2株，對亞胺培南均敏感，對厄他培南的耐藥率為30.0%。

表3 75株可疑CPE對抗菌藥物的耐藥率（%）

2.2 耐藥基因的檢測結(jié)果 75株可疑CPE經(jīng)PCR擴(kuò)增，共檢出66株產(chǎn)碳青霉烯酶（其中產(chǎn)KPC 46株，產(chǎn)NDM-1 18株，產(chǎn)IMP 1株，產(chǎn)VIM 1株，無產(chǎn)OXA-48基因型），6株產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）（CTX-M-1 1株，CTX-M-1+CTX-M-1 2株，CTX-M-9 3株），3株未檢測出基因。部分電泳結(jié)果見圖2-3；10株非CPE均未檢出碳青霉烯酶耐藥基因。

圖2 NDM-1和KPC基因部分電泳圖（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，7、14分別為NDM-1和KPC基因的陽性對照，6、13分別為NDM-1和KPC基因的陰性對照）

圖3 VIM和IMP基因部分電泳圖（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，7、14分別為VIM和IMP基因的陽性對照，6、13分別為VIM和IMP基因的陰性對照）

2.3 紙片協(xié)同試驗(yàn)檢測結(jié)果 依據(jù)上述方法中介紹的判定依據(jù)，紙片協(xié)同試驗(yàn)部分結(jié)果見圖4，性能評價(jià)見表4～6。PBA協(xié)同試驗(yàn)陽性菌株有48株，氯唑西林協(xié)同均陰性，結(jié)合PCR的結(jié)果有1株陰溝腸桿菌和1株大腸埃希菌未檢測出耐藥基因，結(jié)果顯示假陽性。對KPC碳青霉烯酶的檢測，PBA協(xié)同試驗(yàn)靈敏度為100.0%（46/46），特異度為93.1%（27/29），準(zhǔn)確度為97.3%（73/75），陽性預(yù)測值為 95.8%（46/48），陰性預(yù)測值為100.0%（27/27），Kappa值為 0.943（P＜0.001），提示與基因檢測結(jié)果一致性高。對于B類碳青霉烯酶的檢測，EDTA協(xié)同試驗(yàn)陽性菌株有20株，PCR結(jié)果也為20株，靈敏度和特異度均為100.0%，準(zhǔn)確度為100.0%，陽性預(yù)測值為100.0%，陰性預(yù)測值為100.0%，Kappa值為1（P＜0.001），與基因檢測結(jié)果一致性較好。10株非CPE中，紙片協(xié)同試驗(yàn)均陰性。

表4 PBA協(xié)同試驗(yàn)檢測腸桿菌科KPC型碳青霉烯酶（株）

表5 EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測腸肝菌科MBL（株）

表6 紙片協(xié)同試驗(yàn)用于CPE檢測的整體性能評價(jià)

圖4 紙片協(xié)同試驗(yàn)表型結(jié)果（a：產(chǎn)NDM-1型大腸埃希菌；b：產(chǎn)KPC型肺炎克雷伯菌；c：產(chǎn)CTX-M型大腸埃希菌）

3 討論

自1993年首次在陰溝腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)由染色體編碼的NmcA碳青霉烯酶以來，CRE在世界范圍內(nèi)廣泛出現(xiàn)，其主要機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，這種酶現(xiàn)多由質(zhì)粒介導(dǎo)，容易在細(xì)菌間傳播[7]。CPE的流行傳播給臨床治療和感染控制帶來極大的挑戰(zhàn)，故快速準(zhǔn)確檢測CPE對有效控制感染、預(yù)防產(chǎn)酶菌株傳播有重要的價(jià)值?；赑CR檢測方法成本高，操作復(fù)雜及需要專業(yè)的儀器和技術(shù)人員，更重要的是，該法無法檢測出新的碳青霉烯酶基因，故臨床應(yīng)用受到限制。本研究采用碳青霉烯酶表型檢測方法，該法操作簡便、成本低且能夠有效地區(qū)分不同類型的碳青霉烯酶，可以更好地指導(dǎo)臨床對抗菌藥物的選擇，對臨床治療和感染控制具有重大意義。

PBA和氨基苯硼酸（APBA）協(xié)同試驗(yàn)均能檢測出產(chǎn)A類碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌，但有研究表明PBA對產(chǎn)KPC等A類酶的檢測性能要優(yōu)于APBA[8]。本研究使用200 μg PBA進(jìn)行PBA協(xié)同試驗(yàn)，可檢測出所有產(chǎn)KPC腸肝菌科細(xì)菌，靈敏度達(dá)100.0%，有2株分離菌株出現(xiàn)假陽性結(jié)果，可能與試驗(yàn)只擴(kuò)增了KPC基因，并未對其他A類碳青霉烯酶如GES、IMI、SIM等進(jìn)行研究有關(guān)。此外PBA協(xié)同試驗(yàn)在產(chǎn)AmpC合并孔蛋白缺失菌株中也能出現(xiàn)陽性，有研究表明，使用氯唑西林（AmpC酶抑制劑）可區(qū)分兩者[7-9]。

對于產(chǎn)MBL（即B類金屬酶）腸肝菌科細(xì)菌，EDTA協(xié)同試驗(yàn)靈敏度和特異度均達(dá)到100.0%，這與Teethaisong等[10]研究結(jié)果一致。Giske等[11]研究發(fā)現(xiàn)吡啶二羧酸對產(chǎn)MBL肺炎克雷伯菌的檢測特異度要高于EDTA，靈敏度相似，本研究中EDTA協(xié)同試驗(yàn)特異度達(dá)100.0%，但本研究的陽性例數(shù)不多，在今后還將繼續(xù)研究。此外，有研究報(bào)道紙片協(xié)同試驗(yàn)對于檢測同時(shí)存在KPC和MBL的菌株，結(jié)果會出現(xiàn)假陰性，只有在紙片上同時(shí)滴加PBA和EDTA時(shí)才出現(xiàn)陽性結(jié)果[12]，但由于本研究收集的菌株均為單個(gè)產(chǎn)KPC或MBL，所以對該結(jié)論還有待進(jìn)一步研究。

有研究報(bào)道替莫西林抑菌圈直徑≤10 mm且MEM與EDTA或PBA無協(xié)同作用可檢測出所有產(chǎn)OXA-48腸桿菌科細(xì)菌，靈敏度和特異度均達(dá)100.0%[10，13]。本研究所收集的75株腸桿菌科細(xì)菌均未檢測到OXA-48，主要是因?yàn)檫@類碳青霉烯酶在國內(nèi)非常罕見，迄今為止，中國所報(bào)道OXA陽性的CRE不到50株[14-15]。故無法對該方法進(jìn)行評價(jià)。

協(xié)同試驗(yàn)與目前微生物實(shí)驗(yàn)室常用的改良Hodge試驗(yàn)相比，特異度更高，研究指出改良Hodge試驗(yàn)對高產(chǎn)Ampc酶或CTX-M類型ESBL的腸肝菌科細(xì)菌容易產(chǎn)生假陽性[15-17]；與Carba NP、mCIM及MALDI-TOF質(zhì)譜分析法相比，靈敏度和特異度相差不大。但目前沒有可用的表型檢測方法被證明是完全具有靈敏度和特異度[18]，要根據(jù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的流行病學(xué)情況和可用資源選擇合適的方法。

綜上所述，PBA和EDTA協(xié)同試驗(yàn)對于檢測產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌來說是一種方便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的表型確認(rèn)試驗(yàn)，并且操作簡便、成本低，適合在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院感染管理科及疾病預(yù)防控制中心等單位普及應(yīng)用。