南極磷蝦油中蝦青素分子種組成及其消化吸收特性研究

周慶新，黃子倩，谷彩霞，張志軒，李 璐，周瑾若，李玉環(huán)

（1.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋工程學(xué)院，山東日照 276826；2.日照市海洋食品資源高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東日照 276826；3.山東省海洋甲殼類資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，山東日照 276826；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100）

南極磷蝦油是以南極磷蝦為原料提取得到的復(fù)合功能脂質(zhì)產(chǎn)品[1]，具有降脂[2]、抗炎[3]、提高學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力[4]等多種功效。其中富含的重要功能伴隨物—蝦青素賦予了南極磷蝦油特有的深紅色外觀，被譽(yù)為“海洋中的紅寶石”，開發(fā)應(yīng)用潛力非常大[5]。研究表明，蝦青素具有卓越的抗氧化活性，其抗氧化能力是其他類胡蘿卜素（如玉米黃質(zhì)、葉黃素、番茄紅素、β-胡蘿卜素）的10 倍以上，是α-生育酚的100倍以上[6]。南極磷蝦油中蝦青素的含量范圍為40～5000 mg/kg，其含量主要取決于磷蝦原料、磷蝦油提取和純化精制方法等[7?9]。目前，有機(jī)溶劑法提取南極磷蝦油已有大量報(bào)道，且因其成本低、工藝簡(jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化[10]。但現(xiàn)有研究多以磷蝦油得率為指標(biāo)進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，在富蝦青素與富磷脂南極磷蝦油的提取溶劑選擇方面卻鮮有報(bào)道。

生物可接受率（Bioaccessibility）表示活性成分從食品中釋放出來可供腸細(xì)胞吸收的最大量，是評(píng)價(jià)功能因子生物學(xué)效價(jià)的重要指標(biāo)[11]。蝦青素作為一種脂溶性類胡蘿卜素，在攝取后能否發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵因素在于其被吸收利用或儲(chǔ)存在人體中的比例。研究顯示，類胡蘿卜素的生物可接受率主要受分子結(jié)構(gòu)、在食物中的物理結(jié)合方式、膳食中脂肪含量以及胃腸道中胰酶和膽鹽的含量等因素影響[12]。南極磷蝦中蝦青素分子種組成復(fù)雜多樣，且其中富含磷脂、多不飽和脂肪酸等多種脂質(zhì)成分[13]。目前，對(duì)于南極磷蝦油中蝦青素的消化吸收情況尚缺乏直觀系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)來闡明。因此，在探究富蝦青素磷蝦油提取溶劑選擇和分子種組成基礎(chǔ)上，研究磷蝦油中蝦青素在模型動(dòng)物體內(nèi)的消化吸收行為，對(duì)磷蝦油的應(yīng)用開發(fā)具有重要意義。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量分析蝦青素含量、磷脂含量和磷蝦油得率等指標(biāo)，綜合考察不同溶劑體系對(duì)磷蝦油提取效果的影響，優(yōu)選體系條件；然后對(duì)此優(yōu)選體系條件下制備的磷蝦油中蝦青素分子種組成進(jìn)行了定性定量表征；并選取ICR 小鼠作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯磕蠘O磷蝦油中蝦青素在其體內(nèi)的消化、排泄和生物可接受率情況，以期為南極磷蝦油在功能食品中的科學(xué)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)ICR 雄性小鼠 體重20～25 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011），實(shí)驗(yàn)開始前自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周；南極磷蝦粉 山東辰亞生物科技有限公司提供；雨生紅球藻蝦青素油 總蝦青素含量≥10.0%，云南愛爾發(fā)生物技術(shù)股份有限公司；全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（all-trans-astxanthin） 純度為95.8%±0.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；甲基叔丁基醚（MBTE） 色譜純，Burdick &Jackson；甲醇 色譜純，德國(guó)Merck 公司；無水乙醇、丙酮、氯仿、正己烷 分析純，國(guó)藥集團(tuán)；玉米油（脂肪酸組成為：15wt%飽和脂肪酸，30.8wt%單不飽和脂肪酸，54.1wt%多不飽和脂肪酸） 山東西王食品有限公司；小鼠基礎(chǔ)飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

YMC-Carotenoid-C30色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm） 日本YMC 株式會(huì)社；Millipore Q 純水機(jī) 美國(guó)Millipore 公司；MS 3B-S25 型電動(dòng)高速勻漿器 德國(guó)IKA 公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；CP100MX 型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；SD-50 型制冰機(jī) 上海雪人機(jī)電設(shè)備有限公司；DW-86L486 型立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；N-EVAP1 12 氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates 公司；UV-800PC-DS2 型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；1260 型液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD） 美國(guó)Agilent 公司；G6410B 三重四極桿質(zhì)譜儀，配大氣壓化學(xué)電離源（APCI） 美國(guó)Agilent 公司；KQ-300E超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南極磷蝦油的提取工藝 通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定南極磷蝦油的提取方法如下：準(zhǔn)確稱取100.00 g（精確至0.01 g）南極磷蝦蝦粉于三角瓶，加入2000 mL提取溶劑，在冰?。? ℃）條件下超聲輔助提取90 min，提取結(jié)束后過濾，收集提取液，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無溶劑流出，得南極磷蝦油。

1.2.2 不同提取溶劑對(duì)南極磷蝦油提取效果的影響 按照1.2.1 南極磷蝦油的提取方法，分別選擇95%乙醇-水、無水乙醇、10%正己烷-乙醇、20%正己烷-乙醇、40%正己烷-乙醇、60%正己烷-乙醇、80%正己烷-乙醇、正己烷作為提取溶劑制備南極磷蝦油。測(cè)定其中總蝦青素、磷脂含量和蝦油得率。

1.2.2.1 樣品中總蝦青素含量的測(cè)定 根據(jù)Zhou 等[14]研究報(bào)道，本試驗(yàn)可通過在489 nm 下測(cè)定不同樣品溶液的吸光度值來計(jì)算出總蝦青素的含量。具體測(cè)定方法：稱取南極磷蝦油樣品15.00 mg（精確至0.01 mg），置于帶有刻度的具塞玻璃離心管中，并向離心管中加入二甲基亞砜和醋酸的混合溶液（量取2.5 mL 醋酸溶液，將其添加到100 mL 二甲亞砜溶液中，得到二甲亞砜和醋酸混合溶液）2 mL，搖勻后，于70 ℃水浴條件下震蕩保溫5 min，然后將液體轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用二甲亞砜和醋酸混合溶液定容至刻度，測(cè)定其在489 nm 波長(zhǎng)下吸光度值，記為A。以二甲基亞砜和醋酸的混合溶液來做空白。按式（1）計(jì)算樣品中的總蝦青素含量。

式中：X 為蝦青素的總含量，mg/kg；A489為樣品在489 nm 下的吸光度值；V 為提取樣品的體積，mL；A 為稀釋倍數(shù)；1908 為消光系數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2.2 樣品中磷脂含量的測(cè)定 抗壞血酸-鉬藍(lán)比色法。參照孫甜甜[15]測(cè)定方法，準(zhǔn)確稱取2.00 g（精確至0.01 g）樣品，加25 mL 的濃硝酸與高氯酸混合溶液（4:1,V/V)浸泡，冷消化2 h，再進(jìn)行灰化，在抗壞血酸存在的條件下與鉬酸銨反應(yīng)生成鉬藍(lán)，測(cè)定其在650 nm 下的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測(cè)算磷蝦油中磷脂的含量。磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=3.707X?0.026，r=0.9999。

1.2.2.3 樣品南極磷蝦油的得率 采用稱重法計(jì)算南極磷蝦油的提取得率，得率按照式（2）計(jì)算：

式中：M1為濃縮后所得南極磷蝦油的重量，g；M2為南極磷蝦蝦粉重量，g。

1.2.3 南極磷蝦油中蝦青素分子種組成研究 參照文獻(xiàn)[14]報(bào)道方法，制備純化南極磷蝦油中的總蝦青素。稱取優(yōu)選條件下制備的南極磷蝦油100.00 mg（精確至0.01 mg），加5 mL 正己烷重新溶解，使用正己烷活化SEP-PAK 正相硅膠柱進(jìn)行純化。取1 mL溶解液上樣，依次用正己烷/丙酮（100/0→95/5→90/10→0/100,V/V）進(jìn)行洗脫純化，并利用薄層層析（TLC）和HPLC 對(duì)洗脫組分進(jìn)行檢測(cè)，收集并合并蝦青素雙酯、蝦青素單酯和游離態(tài)蝦青素洗脫液，氮吹后再用3 mL 丙酮復(fù)溶，即得純化后的總蝦青素樣品溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，采HPLC-MS 對(duì)其中蝦青素分子種組成進(jìn)行定性定量分析。

HPLC 條件：流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：甲基叔丁基醚；線性梯度洗脫：0～15 min：B 為0%；15～22 min：B 由0%升至為22%；22～48 min：B 維持在22%；48～56 min：B 由22%升至40%；56～76 min：B 為40%。流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：476 nm；柱溫：35 ℃；DAD 全波長(zhǎng)掃描范圍：200～800 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

MS 條件：對(duì)質(zhì)譜主要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定APCI 源，正離子模式，一級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)量掃描范圍為m/z 300～1400。霧化氣壓力 60 psi；干燥氣（N2）流速 5 L/min，干燥氣溫度350 ℃，離子源溫度450 ℃。毛細(xì)管壓力3.7 kV，電暈電流4 μA。二級(jí)質(zhì)譜采用母離子掃描及子離子掃描模式，碎裂電壓100 V，碰撞能量25 eV，質(zhì)量掃描范圍 m/z 100～1500。質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理采用Mass Hunter 軟件，利用解卷積（分子特征提取算法）功能，提取色譜峰信息并處理。

1.2.4 南極磷蝦油中蝦青素在小鼠體內(nèi)消化吸收情況測(cè)定

1.2.4.1 南極磷蝦油灌胃液的制備 準(zhǔn)確稱量一定量（0.01 mg）的南極磷蝦油樣品，將其分散于適量的玉米油中，在冰浴和氮?dú)獗Ｗo(hù)下超聲波震蕩5 min，使其充分分散均勻，按照后續(xù)試驗(yàn)設(shè)定的灌胃劑量和灌胃體積，分別配制成濃度為10、30 和50 mg/mL 的南極磷蝦油-玉米油灌胃液。

1.2.4.2 小鼠糞便中蝦青素排泄情況試驗(yàn) 試驗(yàn)小鼠按照體重隨機(jī)分為2 組，分別為南極磷蝦油組和對(duì)照組，每組6 只小鼠。飼料和水自由攝取，適應(yīng)喂養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前，禁食不禁水10 h。南極磷蝦油組試驗(yàn)小鼠按照南極磷蝦油300 mg/kg·體重的劑量和10 mL/kg·體重的灌胃體積灌胃1.2.4.1 方法制備的灌胃液，對(duì)應(yīng)蝦青素的當(dāng)量灌胃劑量為0.078 mg/kg·體重；為考察灌胃南極磷蝦油是否影響試驗(yàn)小鼠的排便量，進(jìn)而影響蝦青素的排泄情況，特設(shè)立對(duì)照組試驗(yàn)，對(duì)照組按照10 mL/kg·體重灌胃體積灌胃玉米油。灌胃結(jié)束后正常進(jìn)食進(jìn)水，并分別于灌胃后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 和24 h 收集對(duì)照組和南極磷蝦油組小鼠糞便，真空冷凍干燥，分別稱量，計(jì)算各試驗(yàn)組排便量；稱重后，將南極磷蝦油組小鼠糞便進(jìn)行研磨，?80 ℃冰箱保存，利用HPLC 分析其中蝦青素存在形態(tài)及含量。

1.2.4.3 灌胃劑量對(duì)南極磷蝦油中蝦青素生物可接受率的影響試驗(yàn) 考慮到安全性與有效性，根據(jù)目前南極磷蝦油的日推薦服用量3 g 進(jìn)行相應(yīng)換算，分別制定100、300 和500 mg/kg·體重三個(gè)灌胃劑量。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將試驗(yàn)小鼠按照體重隨機(jī)分為4 組，每組6 只小鼠。飼料和水自由攝取，適應(yīng)喂養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前，禁食不禁水10 h。分別按照南極磷蝦油0 mg/kg·體重（對(duì)照組）、100 mg/kg·體重（低劑量組）、300 mg/kg·體重（中劑量組）和500 mg/kg·體重（高劑量組）的劑量和10 mL/kg·體重的灌胃體積灌胃1.2.4.1 方法制備的灌胃液，對(duì)應(yīng)蝦青素當(dāng)量灌胃劑量分別為0、0.026、0.078 和0.13 mg/kg·體重，灌胃結(jié)束后正常進(jìn)食進(jìn)水。收集24 h 內(nèi)的小鼠糞便，真空冷凍干燥，稱量，研磨，?80 ℃冰箱保存，利用HPLC分別測(cè)定其中總蝦青素含量。

1.2.4.4 小鼠糞便中總蝦青素的檢測(cè)及生物可接受率計(jì)算方法 將糞便樣品充分研磨并混勻，精確稱取60 mg 于15 mL 離心管中，加入3 mL 氯仿/甲醇溶液（2:1，V/V），超聲5 min 后靜置10 min，然后以3500 r/min 離心30 min，小心吸取上層有機(jī)相，重復(fù)提取3 次并合并提取液，氮吹后用1 mL 甲醇/MBTE（1:1,V/V）復(fù)溶，使用0.22 μm 有機(jī)膜過濾2 次后按1.2.3 中色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總蝦青素量及各形態(tài)蝦青素相對(duì)含量。

參照Failla 等[16]學(xué)者提出計(jì)算生物可接受率的方法，生物可接受率的計(jì)算公式如下：

式中：灌胃量為灌胃樣品中總蝦青素量，mg；排泄量為灌胃后24 h 內(nèi)糞便中總蝦青素量，mg。

1.2.5 南極磷蝦油和雨生紅球藻藻油中蝦青素的生物可接受率比較 試驗(yàn)小鼠按照體重隨機(jī)分為3 組，每組6 只小鼠。飼料和水自由攝取，適應(yīng)喂養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前，禁食不禁水10 h。以20%（V/V）正己烷-乙醇溶劑提取的南極磷蝦油和雨生紅球藻藻油為試驗(yàn)樣品，按照1.2.4.1 的方法制備灌胃液，使灌胃液中的總蝦青素當(dāng)量濃度為0.06 mg/mL。按照10 mL/kg·體重的灌胃體積灌胃樣品，灌胃結(jié)束后正常進(jìn)食進(jìn)水。收集24 h 內(nèi)的小鼠糞便，真空冷凍干燥，稱量，研磨，?80 ℃冰箱保存，利用HPLC 分別測(cè)定其中總蝦青素含量，按照1.2.4.4 方法計(jì)算蝦青素的生物可接受率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±SD 表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差One-way ANOVA 分析，并采用Tukey’s 法進(jìn)行兩兩比較分析，以P<0.05 為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑組成對(duì)南極磷蝦油中蝦青素提取效果的影響

南極磷蝦中蝦青素類化合物屬于一類低極性脂溶類胡蘿卜素，依據(jù)提取溶劑與提取目標(biāo)物相似相溶的原理，分別考察了8 種溶劑體系對(duì)南極磷蝦油提取效果的影響情況，如表1 所示。

鑒于目前行業(yè)把蝦青素和磷脂含量作為衡量南極磷蝦油品質(zhì)的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)時(shí)，同時(shí)考察了不同提取溶劑體系對(duì)蝦青素、磷脂和得率的影響情況。由表1 可知，60%正己烷-乙醇提取所得的南極磷蝦油中蝦青素含量最高，約為268.6 mg/kg。而20%（V/V）正己烷-乙醇溶劑提取得到的南極磷蝦油中磷脂含量最高，約為44.2%，顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.05）。據(jù)Lambertsen 等[17]報(bào)道，南極磷蝦油中蝦青素主要以酯化態(tài)形式存在，其含量約占總蝦青素的90%以上。由于酯化態(tài)蝦青素分子與脂肪酸相鏈接，使其分子整體極性低于游離態(tài)蝦青素。故根據(jù)相似相溶原理和表1 結(jié)果可以得出，在正己烷體積分?jǐn)?shù)≤60%（V/V）范圍內(nèi)，隨著正己烷含量的增加，溶劑的整體極性降低，提取得到的南極磷蝦油中蝦青素的含量不斷升高，且以60%正己烷-乙醇提取所得的南極磷蝦油中蝦青素含量最高，而當(dāng)正己烷體積分?jǐn)?shù)為80%和100%時(shí)，提取得到的南極磷蝦油中蝦青素的含量有所降低。在試驗(yàn)過程中值得關(guān)注的是，當(dāng)提取溶劑中正己烷體積分?jǐn)?shù)高于80%（V/V）時(shí)，提取液會(huì)出現(xiàn)一定程度的分層現(xiàn)象，這可能是因?yàn)槟蠘O磷蝦蝦粉原料中所含的部分水分所致，高濃度正己烷體系與水分不互溶，提取時(shí)溶劑難以充分滲透到蝦粉原料內(nèi)部，致使蝦青素類化合物無法被有效的浸提出來[18?19]。另外，表1 結(jié)果顯示，95%乙醇-水溶劑提取得率較高，而正己烷溶劑的提取率顯著低于其它試驗(yàn)組（P<0.05），原因可能是95%乙醇-水溶劑將南極磷蝦蝦粉中部分極性相對(duì)較高的物質(zhì)提取出來，而正己烷僅能提取低極性脂[20]。試驗(yàn)過程也發(fā)現(xiàn)，95%乙醇-水提取得到的南極磷蝦油粘稠，流動(dòng)性差，雜質(zhì)較多。綜上所述，該部分試驗(yàn)結(jié)果可以為南極磷蝦油的定向化提取提供參考，行業(yè)可根據(jù)產(chǎn)品對(duì)蝦青素和磷脂含量的不同需求，選擇合適的提取溶劑組成進(jìn)行南極磷蝦油的提取。

表1 溶劑組成對(duì)南極磷蝦油中總蝦青素、磷脂含量以及蝦油得率的影響Table 1 Effects of solvents composition on astaxanthin,myelin content and extraction of astaxanthin

2.2 南極磷蝦油中蝦青素分子種組成分析

為了進(jìn)一步分析制得南極磷蝦油中蝦青素的分子種組成，選用60%（V/V）正己烷-乙醇提取得到的南極磷蝦油為樣本，經(jīng)HPLC-MS 分析檢測(cè)和峰面積歸一化處理，得到其中蝦青素各分子種組成及相對(duì)含量如表2 所示，采用60%（V/V）正己烷-乙醇提取所得南極磷蝦油中蝦青素主要以單酯和雙酯形態(tài)存在，酯化態(tài)蝦青素約占蝦青素總量的98.38%，游離態(tài)蝦青素僅占1.62%。其中蝦青素雙酯共鑒定出12 種，總體相對(duì)含量達(dá)73.5%，遠(yuǎn)超蝦青素單酯及游離態(tài)蝦青素；蝦青素單酯共鑒定出5 種，相對(duì)含量為24.88%。從蝦青素酯的分子種組成來看，在南極磷蝦油中與蝦青素相鏈接脂肪酸主要為C14:0、C16:0、C16:1、C18:1、C20:0、C20:5和C22:6，該分析結(jié)果與Grynbaum等[21]研究相吻合。另外需要指出的是，前期Lambertsen 等[17]研究報(bào)道的南極磷蝦中蝦青素雙酯、蝦青素單酯和游離態(tài)蝦青素相對(duì)含量分別為51%、43%和6%，其中酯化態(tài)蝦青素的相對(duì)百分含量約為94%。而本試驗(yàn)結(jié)果中酯化態(tài)蝦青素的相對(duì)百分含量為98.3%，略高于Lambertsen 等[17]的報(bào)道。這主要是因?yàn)轷セ瘧B(tài)蝦青素的分子極性要低于游離態(tài)蝦青素，根據(jù)相似相溶原理，隨著提取溶劑中正己烷比例的增大，溶劑整體極性降低，對(duì)酯化態(tài)蝦青素的親和性逐漸增強(qiáng)，而對(duì)游離態(tài)蝦青素的親和性逐漸下降，當(dāng)提取體系中正己烷-乙醇體積分?jǐn)?shù)到達(dá)60%時(shí)，相比游離態(tài)蝦青素而言，更多的酯化態(tài)蝦青素被提取出來，與Foss 等[22]和 Yamaguchi 等[23]的研究報(bào)道相一致。

表2 南極磷蝦油中蝦青素各分子種組成及相對(duì)含量Table 2 Composition and relative content of astaxanthin in Antarctic krill oil

2.3 南極磷蝦油中蝦青素在小鼠體內(nèi)消化吸收情況

2.3.1 小鼠糞便中蝦青素的分子形態(tài)組成隨時(shí)間變化 為考察南極磷蝦油中蝦青素在小鼠體內(nèi)的消化吸收過程，該部分考察了灌胃南極磷蝦油后，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠糞便中游離態(tài)蝦青素、蝦青素單酯、蝦青素雙酯相對(duì)含量的變化情況，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 小鼠糞便中蝦青素分子形態(tài)隨時(shí)間的變化Fig.1 Morphological changes of astaxanthin in mouse feces

圖1 試驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃后2～4 h 南極磷蝦油中蝦青素在小鼠體內(nèi)開始代謝。蝦青素雙酯在4 h達(dá)到最大值，達(dá)64.54%，隨后其相對(duì)含量迅速下降，至14 h 已不足2%，24 h 時(shí)僅有0.61%；蝦青素單酯自2 h 開始不斷上升至8 h 達(dá)到最大值，隨后略有下降，但14 h 時(shí)又出現(xiàn)回升并保持相對(duì)穩(wěn)定；游離態(tài)蝦青素自2 h 開始相對(duì)含量逐漸上升，至12 h 達(dá)到最大值，隨后略有下降并保持相對(duì)穩(wěn)定。自14 h 開始小鼠糞便中蝦青素主要以游離態(tài)和蝦青素單酯形式存在，且相對(duì)含量差別不大。同時(shí)，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦油組和對(duì)照組小鼠在排便量隨時(shí)間變化方面無顯著差異（圖2 所示），說明灌胃南極磷蝦油對(duì)試驗(yàn)小鼠的排便量無明顯影響。

圖2 不同試驗(yàn)組24 h 排便量比較Fig.2 Faeces amount comparison of different group in 24 h

據(jù)前述試驗(yàn)結(jié)果可知，南極磷蝦油中蝦青素主要以雙酯形式存在，其次為單酯，游離態(tài)蝦青素含量很低。故可以推測(cè)，蝦青素雙酯在小鼠體內(nèi)被分解轉(zhuǎn)化為蝦青素單酯和游離態(tài)蝦青素進(jìn)而被吸收利用，該結(jié)果與前期研究報(bào)道的雨生紅球藻蝦青素酯消化吸收特性結(jié)果一致[24?25]。

2.3.2 南極磷蝦油中蝦青素的生物可接受率 運(yùn)用Failla 等[16]提出的生物可接受率概念，評(píng)價(jià)不同灌胃劑量條件下南極磷蝦油中蝦青素的生物利用情況。圖3 為灌胃不同劑量南極磷蝦油后，根據(jù)計(jì)算公式得到的南極磷蝦油中蝦青素的生物可接受率。結(jié)果顯示，低、中、高劑量試驗(yàn)組中，南極磷蝦油蝦青素的生物可接受率差異不顯著，數(shù)值上約為74%。這可能系試驗(yàn)時(shí)按照目前南極磷蝦油的推薦日入量分別設(shè)計(jì)了100、300 和500 mg/kg 體重三個(gè)灌胃劑量組，而南極磷蝦油總蝦青素含量約為260 mg/kg 蝦油，故三個(gè)劑量組對(duì)應(yīng)的蝦青素當(dāng)量灌胃劑量分別僅約為0.026、0.078、0.13 mg/kg 體重，劑量相對(duì)較低，從而致使三個(gè)劑量組在生物可接受率方面表現(xiàn)出不明顯差異，該結(jié)果與周慶新等[24]研究報(bào)道一致。

圖3 不同試驗(yàn)組蝦青素生物可接受率比較Fig.3 Bioaccessibility comparison of astaxanthin in different test group

2.4 南極磷蝦油和雨生紅球藻藻油中蝦青素的生物可接受率比較

根據(jù)Capelli 等[26]研究推薦的常規(guī)成人每日蝦青素?cái)z入劑量為4 mg，換算到相對(duì)應(yīng)的小鼠灌胃劑量為0.6 mg/kg 體重。圖4 為灌胃南極磷蝦油源蝦青素與雨生紅球藻源蝦青素后，得到的不同試驗(yàn)組蝦青素的生物可接受率比較圖。結(jié)果顯示，南極磷蝦油源蝦青素的生物可接受率明顯高于雨生紅球藻源蝦青素，約為雨生紅球藻源蝦青素生物可接受率的1.25 倍。據(jù)研究報(bào)道[27?29]，類胡蘿卜素類化學(xué)物的生物利用率受其結(jié)構(gòu)、溶解特性和基質(zhì)效應(yīng)等因素的影響。因此我們推測(cè)，這可能是由于南極磷蝦油中存在的磷脂類等兩性物質(zhì)[30]，有助于南極磷蝦油中酯化態(tài)蝦青素水解成游離態(tài)蝦青素，并促進(jìn)其進(jìn)入混合膠束，從而使蝦青素在消化道內(nèi)表現(xiàn)出更好的吸收特性。

圖4 南極磷蝦油和雨生紅球藻藻油中蝦青素的生物可接受率比較Fig.4 Bioaccessibility comparison of astaxanthin from Antarctic krill oil and Haematococcus pluvialis oil

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)研究了不同濃度正己烷-乙醇溶劑對(duì)南極磷蝦油提取效果的影響，并通過體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，考察了南極磷蝦油中蝦青素在模型動(dòng)物體內(nèi)的消化吸收情況。結(jié)果表明：60%（V/V）正己烷-乙醇溶劑提取蝦青素的效果最佳，所制得的南極磷蝦油中共檢測(cè)出酯化態(tài)蝦青素17 種，其中蝦青素雙酯12 種，相對(duì)含量占73.5%，蝦青素單酯5 種，相對(duì)含量占24.88%，游離態(tài)蝦青素相對(duì)含量約占1.62%；蝦青素雙酯在小鼠體內(nèi)被分解為蝦青素單酯和游離態(tài)蝦青素；灌胃24 h 后，低、中、高劑量組蝦青素的生物可接受率差異不顯著，其生物可接受率約為74%；南極磷蝦油源蝦青素的生物可接受率明顯高于雨生紅球藻源蝦青素，約為雨生紅球藻源蝦青素生物可接受率的1.25 倍。本研究為下一步研究南極磷蝦油中蝦青素在生物體內(nèi)的吸收代謝轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，并為南極磷蝦油的產(chǎn)業(yè)定向化提取應(yīng)用以及膳食營(yíng)養(yǎng)特性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。