基于黃嘌呤氧化酶活性抑制和斑馬魚高尿酸血癥模型的降尿酸功效食藥材篩選

張瑛毓，普布多吉，盧 聰，王鳳忠,

（1.西藏農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏拉薩 850000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）與血液中尿酸水平升高有關(guān)，是常見的代謝性疾病之一。由于體液中尿酸含量超標(biāo)，尿酸單鈉晶體（MSU）會(huì)在關(guān)節(jié)內(nèi)以及關(guān)節(jié)周圍形成和沉積[1]。HUA 不僅是痛風(fēng)、急性關(guān)節(jié)炎、高血壓、尿酸性腎病和高脂血癥、糖尿病等的重要生化基礎(chǔ)，而且還與中風(fēng)、冠心病和心力衰竭等多種心血管疾病密切相關(guān)[2]。近年來，隨著生活水平的提高和高蛋白飲食的增加，人們的尿酸水平呈上升趨勢(shì)[3]。流行病學(xué)證據(jù)表明，HUA 的普遍化已經(jīng)成為一種亟待解決的公共衛(wèi)生問題[4]。

盡管當(dāng)前用于治療高尿酸血癥的化學(xué)藥物可以快速有效緩解患者的癥狀，但這些化學(xué)藥物具有潛在的副作用[5]，其中還包括許多不良反應(yīng)，可導(dǎo)致不同程度的肝損害，神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)和其它副作用，因此，有必要尋找更有效，更安全的藥物來治療高尿酸血癥和痛風(fēng)[6]。由于食藥材具有安全性高、來源廣、種類多、綜合療效好、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[7]，已成為研究降尿酸活性成分的新熱點(diǎn)。在本研究中，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研[8]，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，選取了在傳統(tǒng)應(yīng)用中具有清熱利濕，活血化瘀，利尿補(bǔ)虛功效的15 種常見的食藥材。

常用于篩選降尿酸活性成分的方法分為兩種：體外和體內(nèi)篩選法。常用的體外篩選方法主要是篩選黃嘌呤氧化酶（XOD）抑制劑，而體內(nèi)篩選方法是通過建立高尿酸血癥動(dòng)物模型進(jìn)行篩選[9]。因此，首先根據(jù)XOD 活性抑制，對(duì)15 種食藥材是否具有降尿酸功效進(jìn)行了體外篩選，然后通過斑馬魚高尿酸血癥模型進(jìn)一步對(duì)其降尿酸活性進(jìn)行驗(yàn)證，為揭示這些食藥材降尿酸功效以及進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為未來降尿酸活性成分的快速篩選提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AB 品系野生型斑馬魚 飼養(yǎng)條件：pH7.0～7.6，水溫27.5～29 ℃，晝夜光照控制為14 h:10 h，每天喂食豐年蝦兩次，斑馬魚胚胎孵育在28.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中；本試驗(yàn)使用食藥材見表1 來自西藏和北京同仁堂中藥店；氧嗪酸鉀（PO）、黃嘌呤、黃嘌呤鈉鹽（XSS）、黃嘌呤氧化酶（X1875）、別嘌呤醇（APL） 美國Sigma 公司；Amplex? Red 尿酸/尿酸酶檢測(cè)試劑盒 英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；其余試劑 均為分析純。

表1 15 種食藥材信息Table 1 List of edible herbs used in this study

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng) 上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Multiskan GO 型全波長酶標(biāo)儀 Thermo Fisher 公司；S-18KS 型手持微量電動(dòng)組織勻漿器 萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ-600DV 數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食藥材提取物的制備 各種食藥材粉碎成粗粉，稱取5.0 g，10 倍量75%乙醇，超聲提取兩次（40 ℃，40 min，480 W，40 kHz），抽濾，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（40 ℃），氮?dú)鈸]干，分別得到各種食藥材提取物。每種提取物分別用乙醇和水復(fù)溶，得到乙醇提取物醇溶液和水溶液。

1.2.2 基于XOD 活性抑制的體外降尿酸食藥材篩選 以黃嘌呤為底物，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)15 種食藥材XOD 抑制活性。反應(yīng)設(shè)置：空白組、酶反應(yīng)組、抑制劑組、對(duì)照組，每組總體積為200 μL。分組及劑量見表2。將提取物醇溶液和50 μL 黃嘌呤共孵育5 min后，加入50 μL XOD 引發(fā)反應(yīng)（XOD 需要在37 ℃下預(yù)孵30 min 以穩(wěn)定酶活），混合均勻，37 ℃，295 nm測(cè)定吸光度，所有測(cè)定均重復(fù)三次。本試驗(yàn)以APL 作為陽性對(duì)照。

表2 分組及劑量Table 2 Grouping and dosage

式中：A1、A2、A3、A4 分別代表酶反應(yīng)組、空白組、抑制劑組和對(duì)照組在295 nm 處的吸光度。

1.2.3 基于斑馬魚HUA 模型的體內(nèi)降尿酸食藥材篩選

1.2.3.1 構(gòu)建斑馬魚HUA 模型給藥劑量的選擇 斑馬魚HUA 模型構(gòu)建方法參考文獻(xiàn)[25]，簡述如下：通過PO+XSS 水溶給藥浸泡5dpf（5days post fertilization，即受精后5 d 斑馬魚，28.5 ℃孵育24 h 后檢測(cè)斑馬魚尿酸水平變化，以模型組與空白組相比尿酸含量顯著升高作為建模成功的指標(biāo)。

隨機(jī)選取5dpf 斑馬魚于4 個(gè)6 孔板中，分成8組，每組三個(gè)復(fù)孔（40 尾/孔），每孔容量4 L。空白組：給予等量斑馬魚培養(yǎng)用水；模型組PX2：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS；模 型 組 PX4：400 μmol/L PO+20 μmol/L XSS；模 型 組 PX6：600 μmol/L PO+30 μmol/L XSS；模 型 組 PX8：800 μmol/L PO+40 μmol/L XSS；模型組PX10：1 mmol/L PO+50 μmol/L XSS；模 型 組 PX20：2 mmol/L PO+100 μmol/L XSS；模 型 組PX40：4 mmol/L PO+200 μmol/L XSS。每組水溶給藥浸泡斑馬魚24 h后，測(cè)定斑馬魚尿酸水平變化，選擇與空白組相比尿酸水平顯著升高的濃度作為構(gòu)建斑馬魚HUA 模型給藥劑量。

1.2.3.2 每種食藥材給藥劑量的選擇 隨機(jī)選取5dpf 斑馬魚于2 個(gè)6 孔板中，分成6 組，每組三個(gè)復(fù)孔（60 尾/孔），每孔容量4 mL。6 組：1000、500、100、50、20、10 μg/mL 提取物水溶給藥浸泡斑馬魚，28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，記錄各組死亡率。

1.2.3.3 基于斑馬魚高尿酸模型的體內(nèi)降尿酸食藥材篩選 構(gòu)建斑馬魚HUA 模型，對(duì)具有良好XOD抑制活性的食藥材做進(jìn)一步降尿酸活性驗(yàn)證。隨機(jī)選取5dpf 斑馬魚于6 孔板中，每組三個(gè)復(fù)孔（40 尾/孔），每孔容量4 mL?？瞻捉M：等量斑馬魚培養(yǎng)用水；模型組：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS；食藥材給藥組：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS+不同濃度提取物（每種食藥材的給藥劑量根據(jù)1.2.2.1 的結(jié)果確定）；陽性對(duì)照組：200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS+APL 2 mmol/L。除空白組外，其余組先用PO 和XSS 處理斑馬魚，然后加入相應(yīng)劑量的APL 和食藥材提取物，每組均為水溶給藥浸泡斑馬魚，28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，測(cè)定尿酸水平。

1.2.3.4 斑馬魚尿酸含量測(cè)定 28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，收集斑馬魚于1.5 mL EP 管中，吸凈EP 管中的液體，加入40 μL PBS，使用手持勻漿器將收集到的斑馬魚勻漿破碎，直至無明顯組織碎塊，15000×g，4 ℃，離心15 min；使用Amplex? Red 尿酸/尿酸酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定斑馬魚尿酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（d）表示。采用方差分析和t 檢驗(yàn)來確定其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇粗提物對(duì)XOD 活性的體外抑制

XOD 是催化嘌呤代謝最后兩個(gè)步驟的關(guān)鍵酶，該酶會(huì)增加血液中尿酸的積累，抑制XOD 活性可以阻斷次黃嘌呤向黃嘌呤和黃嘌呤向尿酸的轉(zhuǎn)化，從而有效降低血清尿酸水平，達(dá)到預(yù)防和治療高尿酸血癥的目的[26]，在長期的研究中，XOD 已成為治療HUA的重要靶標(biāo)。新型XOD 抑制劑的開發(fā)在HUA 治療領(lǐng)域具有廣闊的前景，因此，本研究以XOD 為體外篩選的靶標(biāo)，對(duì)15 種食藥材的降尿酸活性進(jìn)行了體外初步篩選。

如表3 所示，15 種食藥材的乙醇粗提物均具有XOD 抑制活性，其中有8 種在濃度400 μg/mL 時(shí)抑制率達(dá)到50%以上，這8 種食藥材分別是紅景天、兔耳草、牡丹皮、敗醬草、黃柏、綠蘿花、決明子和雪菊，其中紅景天XOD 抑制活性最強(qiáng)，其IC50值為（140.96±2.76）μg/mL。在測(cè)定條件下，陽性藥物APL 的IC50值為6.769 μg/mL。

表3 15 種食藥材XOD 抑制率及IC50 值Table 3 Percentage of XOD inhibition and IC50 value of 15 edible herbs

2.2 構(gòu)建斑馬魚HUA 模型給藥劑量的選擇

如圖1 所示，水溶給藥PO+XSS 浸泡斑馬魚24 h 后，測(cè)定斑馬魚尿酸水平變化，以模型組與空白組相比尿酸含量出現(xiàn)顯著升高作為建模成功的指標(biāo)。結(jié)果顯示PX2、PX4 和PX6 處理組尿酸水平顯著高于空白組（P<0.001 或P<0.01），其中，PX2 處理組尿酸含量最高，斑馬魚存活率100%，此濃度下能夠成功構(gòu)建斑馬魚HUA 模型，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS作為構(gòu)建斑馬魚HUA 模型給藥劑量。

圖1 不同處理組尿酸濃度變化Fig.1 Concentration of uric acid in different treatment groups

斑馬魚基于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，不僅被應(yīng)用于遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究，而且已經(jīng)擴(kuò)展到疾病模型和活性物質(zhì)篩選領(lǐng)域。通過化學(xué)誘導(dǎo)，遺傳學(xué)和其他方法，研究人員創(chuàng)建了一系列可用于活性物質(zhì)篩選的斑馬魚人類疾病模型[27]。通過構(gòu)建斑馬魚高通量活性成分篩選平臺(tái)，斑馬魚已被廣泛用于食藥材活性成分和天然化合物的篩選[28]。在之前的工作中，已經(jīng)成功地構(gòu)建了斑馬魚高尿酸血癥模型[25]，該模型可以進(jìn)行高通量的食藥材篩選，基于此使用斑馬魚高尿酸血癥模型來篩選具有降尿酸功效的食藥材。與現(xiàn)有的動(dòng)物高尿酸血癥模型相比，篩選時(shí)間大大縮短，篩選效率提高。

2.3 每種食藥材給藥劑量的選擇

表4 統(tǒng)計(jì)了8 種食藥材不同濃度乙醇提取物水溶液浸泡給藥24 h 后，斑馬魚幼魚的死亡率。以此作為體內(nèi)篩選時(shí)給藥劑量的選擇依據(jù)。紅景天選擇一個(gè)濃度劑量組：10 μg/mL；牡丹皮選擇兩個(gè)濃度劑量組：10、20 μg/mL；綠蘿花選擇三個(gè)濃度劑量組：10、20、50 μg/mL；決明子選擇三個(gè)濃度劑量組：20、50、100 μg/mL；雪菊、兔耳草、敗醬草、黃柏三個(gè)濃度劑量組：50、100、500 μg/mL。

表4 不同濃度給藥組斑馬魚幼魚死亡率（%）Table 4 Mortalities of zebrafish larvae at different concentrations (%)

2.4 乙醇粗提物對(duì)HUA 模型斑馬魚尿酸水平的影響

在對(duì)15 種食藥材體外XOD 抑制活性驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，對(duì)8 種體外抑制效果明顯的食藥材乙醇粗提物的降尿酸活性做進(jìn)一步驗(yàn)證?？瞻捉M、模型組、食藥材給藥組、陽性對(duì)照組水溶給藥浸泡斑馬魚，28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，對(duì)各處理組的尿酸水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2 所示。藥物處理24 h 后，模型組尿酸水平與空白組相比顯著升高（P<0.01），表明模型建立成功。除空白組外，紅景天組，兔耳草低中高劑量組，牡丹皮高劑量組，敗醬草低中劑量組，黃柏中高劑量組，綠蘿花低中高劑量組，決明子低中高劑量組，雪菊低中高劑量組和APL 組尿酸水平均顯著低于模型組（P<0.05）。除敗醬草和決明子以外，其他6 種提取物對(duì)尿酸水平的影響與濃度呈正相關(guān)，與體外XOD活性抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 8 種乙醇粗提物對(duì)斑馬魚尿酸水平的影響Fig.2 Effect on uric acid level in zebrafish of 8 edible herbs’ ethanol crude extracts

關(guān)于紅景天、綠蘿花、敗醬草和雪菊的XOD 抑制活性和降尿酸活性研究很少。其中，紅景天和綠蘿花降尿酸效果與陽性對(duì)照組APL 非常接近，表明其降尿酸能力更具有明顯的優(yōu)勢(shì)。這四種是典型的傳統(tǒng)藏藥，歷史悠久，具有扎實(shí)的應(yīng)用基礎(chǔ)，對(duì)多種頑固性疾病有良好的療效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)這四種中藥具有抗炎、抗菌和抗腫瘤作用，并且對(duì)代謝疾?。ɡ缣悄虿　⒏哐獕汉透咧Y）的治療也具有一定的作用。這四種中藥在降尿酸藥物的研究中將具有很大的開發(fā)價(jià)值，其具有降尿酸功效的關(guān)鍵活性化合物也有待進(jìn)一步分離和提取。

3 結(jié)論

通過體外體內(nèi)相結(jié)合的方法對(duì)15 種食藥材是否具有降尿酸活性進(jìn)行了篩選，為揭示這些食藥材降尿酸功效以及進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，隨著相關(guān)研究的不斷深入和完善，斑馬魚高尿酸血癥模型在篩選新的降尿酸活性物質(zhì)方面將具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。此外，隨著關(guān)鍵活性成分的逐漸分離和提取，紅景天、綠蘿花、敗醬草和雪菊在未來降尿酸產(chǎn)品的研發(fā)中將具有極好的開發(fā)價(jià)值。