新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿采集和質(zhì)量特征

李策生 ，謝勇 ，楊匯川 ，余鼎 ，侯繼鋒 ，袁明超 ，周東波 ，杜濤 ，吳曉 ，王丹 ，胡勇，喻劍虹，鄧琨，王月，龔欽，周志軍，彭焱，林連珍，韓韌，邢延濤，梁小龍，毛敏，梅宇，李陶敬，張勇，梁洪，董德梅，何彥林 ，，付道興 ，楊曉明

1.國(guó)藥集團(tuán)武漢血液制品有限公司,湖北武漢430207；2.北京天壇生物制品股份有限公司,北京100024；3.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司,北京100029；4.中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京102629；5.武漢血液中心,湖北武漢430030

世界衛(wèi)生組織(WHO)官網(wǎng)(https:／／covid19.who.int ／)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,截至 2021 年 5 月 31 日,在世界范圍內(nèi)新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)累計(jì)確診170 051 718 例,累計(jì)死亡3 540 437 例。在2020 年疫情暴發(fā)之初,尚無(wú)有效治療藥物,康復(fù)者血漿治療作為一種經(jīng)驗(yàn)療法,至今已有 130 年的歷史,曾在 2003 年“非典”、2009 年甲型H1N1 流感、埃博拉病毒(Ebola virus,EBV)感染、中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)等疫情或重大傳染病中作為經(jīng)驗(yàn)療法使用,有效治療了重癥患者［1-7］。但并未大規(guī)模使用,究其原因與血漿采集技術(shù)有一定的關(guān)系。單采漿技術(shù)使用一次性無(wú)菌密閉的單采血漿耗材,嚴(yán)格按照規(guī)程無(wú)菌操作,采集的血液經(jīng)離心分離紅細(xì)胞等有形成分還輸至獻(xiàn)漿員體內(nèi)。但此種采集技術(shù)目前在我國(guó)主要在各血液制品生產(chǎn)企業(yè)下屬的漿站規(guī)模使用,采集的血漿只對(duì)口供應(yīng)國(guó)內(nèi)血液制品企業(yè)。我國(guó)中心城市暫未規(guī)?；Ｒ?guī)開(kāi)展單采血漿工作。COVID-19 疫情暴發(fā)后,如何采集足夠的康復(fù)者恢復(fù)期血漿用于COVID-19 患者的救治,成為一道難題。為了挽救患者生命,中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司(簡(jiǎn)稱中國(guó)生物)及其下屬國(guó)藥集團(tuán)武漢血液制品有限公司等依托自身技術(shù)優(yōu)勢(shì),于2020 年1 月即開(kāi)始了康復(fù)者血漿采集計(jì)劃預(yù)案的制定,獲得政策許可后,迅速在全國(guó)18 個(gè)省設(shè)置了52 個(gè)血漿采集點(diǎn),開(kāi)展COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿采集工作,并將采集的COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿進(jìn)行亞甲藍(lán)病毒滅活,檢測(cè)合格后用于臨床救治,累計(jì)使近千人獲益。目前我國(guó)關(guān)于COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿的規(guī)模采集和病毒滅活血漿的質(zhì)量特征鮮有報(bào)道。本文對(duì)截至2020 年3 月26 日中國(guó)生物在湖北省采集的COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿捐獻(xiàn)者基本情況及血漿的質(zhì)量特征進(jìn)行初步匯總和分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒、單管多重呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒和GNcycler-96s 多重病原微生物核酸檢測(cè)儀均購(gòu)自上海捷諾生物科技有限公司；新型冠狀病毒IgG 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢科源安博生物技術(shù)有限公司；HBsAg、HCV 抗體、HIV-1 ／ HIV-2 抗體檢測(cè)試劑盒及HBV、HCV、HIV-1 核酸檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海永華細(xì)胞和基因高技術(shù)有限公司及北京端瑞科技有限公司；抗A 抗B血型定型試劑(單克隆抗體)購(gòu)自長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司；抗D(IgM + IgG)血型定型試劑(單克隆抗體)購(gòu)自宜美康生物制品有限公司；無(wú)菌檢查用培養(yǎng)基購(gòu)自北京三藥科技有限公司；血液成分單采漿機(jī)分別購(gòu)自重慶三大偉業(yè)制藥有限公司(FLY ／ XJ-1和FLY ／ XJ-2)、四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司(NGL-XJC 2000)和上海達(dá)華醫(yī)療器械有限公司(DHJ-1)；醫(yī)用血漿病毒滅活柜(ZBK-YBM-02)及一次性使用病毒滅活裝置配套用亞甲藍(lán)病毒滅活專用耗材(ZBKMB01)購(gòu)自山東中?？滇t(yī)療器具公司；GZR-IIA 高頻熱合機(jī)購(gòu)自蘇州市醫(yī)用儀器廠；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD 公司(SpectraMax Plus384)；固相萃取系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；GN-96S PCR 儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；UV-2550 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司。

1.2 COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿的采集及質(zhì)量分析 登記捐獻(xiàn)者基本信息,采用血液分離單采漿技術(shù)采集COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿。制定血漿采集標(biāo)準(zhǔn)及抗重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)滅活血漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)亞甲藍(lán)滅活前血漿進(jìn)行外觀、病毒標(biāo)志物等檢測(cè)；滅活后血漿進(jìn)行外觀、SARS-CoV-2抗體、SARS-CoV-2 核酸、亞甲藍(lán)殘留等檢測(cè),并分析檢測(cè)結(jié)果。對(duì)捐獻(xiàn)者采集過(guò)程和采集后隨訪發(fā)生的與單采漿相關(guān)不良事件進(jìn)行記錄,分析單采漿技術(shù)的安全性。統(tǒng)計(jì)在湖北省各地市州采集血漿情況,以血漿采集份數(shù)比地區(qū)確診人數(shù)計(jì)算血漿采集率。

采集率(%)= 采集份數(shù) ／ 確診例數(shù) × 100%

1.2.1 血漿捐獻(xiàn)者入選標(biāo)準(zhǔn) 捐獻(xiàn)者應(yīng)為符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案》最新版中解除隔離和出院標(biāo)準(zhǔn)的COVID-19 康復(fù)者。年齡應(yīng)不小于18周歲,不大于55 周歲,無(wú)經(jīng)血傳播疾病史,經(jīng)臨床醫(yī)師評(píng)估符合獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)者。兩次采漿間隔期不少于14 d。

1.2.2 血漿采集 按照《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019版)》要求,對(duì)捐獻(xiàn)者進(jìn)行知情告知捐獻(xiàn)血漿的利弊,可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)捐獻(xiàn)者進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢查。采用血液成分單采漿機(jī)采集200 ～400 mL ／ 次,具體采集量由捐獻(xiàn)者意愿和臨床醫(yī)師評(píng)估確定。同時(shí)留取全血,通過(guò)正定法進(jìn)行ABO ／ RhD 血型檢測(cè),血漿樣品用于病原學(xué)和理化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.3 抗SARS-CoV-2 滅活血漿的制備 COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿經(jīng)亞甲藍(lán)病毒滅活后,制備為抗SARS-CoV-2 滅活血漿,分裝成 50、75、100 mL ／ 袋等規(guī)格。-20 ℃及以下貯存,-15 ℃及以下冰凍狀態(tài)運(yùn)輸,如短期保存(24 h 內(nèi)),則保存于 2 ～ 8 ℃。

1.2.4 抗SARS-CoV-2 滅活血漿的關(guān)鍵質(zhì)量控制 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［8］中全血及成分血質(zhì)量要求,對(duì)滅活血漿進(jìn)行亞甲藍(lán)殘留、2019-nCoV 核酸(RT-PCR 法)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)標(biāo)志物(酶聯(lián)免疫法與核酸檢測(cè)法)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum,TP)標(biāo)志物(酶聯(lián)免疫法)和抗2019-nCoV(RBD-IgG)抗體等檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 單采漿技術(shù)的安全性 截至2020 年3 月26 日,中國(guó)生物在湖北省累計(jì)采集COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿933 份,其中在武漢市累計(jì)采集462 份,在地市州累計(jì)采集471 份。采集過(guò)程順利,未發(fā)生血漿采集相關(guān)嚴(yán)重不良事件。捐獻(xiàn)者捐獻(xiàn)血漿日期距離出院日期平均為18 d。采集后對(duì)捐獻(xiàn)者進(jìn)行至少1次回訪,均未報(bào)道血漿采集相關(guān)嚴(yán)重不良事件。

2.2 湖北省地市州COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿捐獻(xiàn)區(qū)域分布 湖北省除武漢外14 個(gè)地市州,COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿采集量前3 位依次為宜昌、十堰、襄陽(yáng),采集率前3 位分別為十堰、宜昌、襄陽(yáng)。各地市州采集份數(shù)之和與武漢市采集份數(shù)相當(dāng)。見(jiàn)圖1 和圖2。

2.3 COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿捐獻(xiàn)年齡和血型分布 捐獻(xiàn)者平均年齡38 歲(n = 933),年齡分布見(jiàn)圖3。

圖1 湖北省各市COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿采集量和采集率Fig.1 Quantity and rate of COVID-19 CP collection in cities of Hubei Province

圖2 湖北省各區(qū)域采集量比例Fig.2 Percentages of COVID-19 CP collected from various regions of Hubei Province

圖3 COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿捐獻(xiàn)者年齡分布Fig.3 Age distribution of COVID-19 CP donors

2.4 抗SARS-CoV-2 滅活血漿ABO 血型結(jié)果 血型Rh 陽(yáng)性:A、B、AB、O 型占比分別為 33.4%、29.2%、10%和27.2%；Rh 陰性:累計(jì)采集到Rh 陰性B 型血 1 份。

2.5 抗SARS-CoV-2 滅活血漿的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)

2.5.1 核酸 收集的933 份COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.5.2 抗體 抗體效價(jià)低于1 ∶160 的占7.40%,其中SARS-CoV-2 抗體陰性血漿比例為5.04%,見(jiàn)表1。

表1 康復(fù)者血漿中抗SARS-CoV-2 抗體水平分布Tab.1 Distribution of antibody level against SARS-CoV-2 in COVID-19 CP

2.5.3 亞甲藍(lán)殘留 每份康復(fù)者血漿經(jīng)亞甲藍(lán)病毒滅活后,亞甲藍(lán)殘留為 0.03 ～ 0.04 μmol ／ L,遠(yuǎn)低于 0.3 μmol ／ L,符合要求。

2.5.4 經(jīng)血傳播感染性病原標(biāo)志物 檢測(cè)結(jié)果顯示,累計(jì)23 份采集的康復(fù)者血漿病原標(biāo)志物不合格,見(jiàn)表2。檢測(cè)合格的血漿才可放行,以保證產(chǎn)品的安全性。

表2 病原標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection result of virus markers

3 討 論

由中國(guó)生物采集的933 份COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿采集過(guò)程順利,未發(fā)生嚴(yán)重不良事件。對(duì)每位獻(xiàn)漿員進(jìn)行至少1 次回訪,目前未報(bào)道采血相關(guān)嚴(yán)重不良事件。表明單采漿技術(shù)安全可靠,未對(duì)人體產(chǎn)生不良影響。

武漢市累計(jì)確診逾5 萬(wàn)人,但本研究中來(lái)自武漢市COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿僅462 份。以血漿采集人次與地區(qū)確診人數(shù)計(jì)算血漿采集率,武漢市低于湖北省的各地市州區(qū)域,分析原因主要與疫情期間武漢市居民自覺(jué)居家隔離,社區(qū)通行和道路通行受限等因素有關(guān),導(dǎo)致武漢市采集率不高,但在武漢市采集的康復(fù)者血漿采集絕對(duì)數(shù)最高。本研究只統(tǒng)計(jì)了由中國(guó)生物采集的COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿,由中國(guó)生物之外采集的血漿未納入本研究統(tǒng)計(jì),因此與其他來(lái)源報(bào)道數(shù)據(jù)可能有差異。

本研究中COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿捐獻(xiàn)者平均年齡為38 歲,由于捐獻(xiàn)血漿有年齡限制,能夠在出院兩周后捐獻(xiàn)血漿者多為輕型和普通型患者,身體一般狀態(tài)良好,因此在此年齡段的人員數(shù)量最多,少有導(dǎo)致COVID-19 惡化風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)疾病,如糖尿?。?］,與老年人相比,年輕人患 COVID-19 后有更高的生存率［10］,身體狀況更適合捐獻(xiàn)血漿。

有文獻(xiàn)報(bào)道,COVID-19 患者A 型血比例高于正常比例,A 型普遍易感,武漢市3 694 名正常人A、B、AB 和 O 型血分布分別為 32.16%、24.90%、9.10%和33.84%,武漢金銀潭醫(yī)院1 775 名COVID-19 患者 A、B、AB 和 O 型血分布分別為 37.75%、26.42%、10.03%和25.80%,COVID-19 患者中A 型血的比例顯著高于正常人群(P ＜0.001)［11］。本研究收集COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿 A 型、B、AB、O 型血占比分別為33.4%、29.2%、10%和27.2%,患病血型比例與捐獻(xiàn)血漿比例不等同,可能與疾病嚴(yán)重程度、年齡、區(qū)域分布、宣傳力度、捐獻(xiàn)血漿便利程度等有關(guān)。本研究中累計(jì)僅采集到Rh 陰性B 型血COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿1 份,主要原因?yàn)镽h 陰性血型稀缺所致。

采集的933 份COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)均為陰性,以其為原料經(jīng)亞甲藍(lán)光照滅活制備的抗SARS-CoV-2 滅活血漿亞甲藍(lán)殘留檢測(cè)結(jié)果顯示,均明顯低于0.3 μmol ／ L,符合要求,亞甲藍(lán)病毒滅活步驟使得安全性進(jìn)一步得到保證。亞甲藍(lán)光照滅活病毒的原理是血漿的亞甲藍(lán)表面攜帶正電荷,與病毒核酸結(jié)合后可嵌入DNA／RNA中,與病毒核酸帶負(fù)電荷的G-C 堿基對(duì)相結(jié)合。在有光照的條件下,亞甲藍(lán)分子吸收光能后可激發(fā)產(chǎn)生單態(tài)分子氧,單態(tài)分子氧通過(guò)修飾鳥(niǎo)嘌呤堿基而影響核酸,使其產(chǎn)生缺口,引起核酸鏈的斷裂或?qū)е聣A基位點(diǎn)丟失,從而達(dá)到滅活病毒的目的。大量數(shù)據(jù)表明,亞甲藍(lán)光化學(xué)法能高效滅活血漿中的脂包膜病毒。亞甲藍(lán)對(duì)冠狀病毒的滅活效果明顯［12］。

抗SARS-CoV-2 滅活血漿抗體陰性率為5.04%,陰性及滴度小于1 ∶80 合計(jì)占比7.40%?？贵w水平可能與機(jī)體狀態(tài)有關(guān),癥狀輕微的年輕人和老年患者產(chǎn)生的抗體滴度是否低于青年人,抗體隨時(shí)間的變化,以及抗體產(chǎn)生后能否保護(hù)機(jī)體免于再次感染［13］,尚有待研究。

COVID-19 疫情暴發(fā)后,中國(guó)生物積極響應(yīng),率先提出康復(fù)者恢復(fù)期血漿療法。并借助公司技術(shù)和資源優(yōu)勢(shì),按照《單采血漿站技術(shù)操作規(guī)程(2011版)》和《血站技術(shù)操作規(guī)程2019 版》相關(guān)要求,調(diào)集人員和單采漿機(jī)等設(shè)備,在全國(guó)18 個(gè)省市自治區(qū)共設(shè)置52 個(gè)血漿捐獻(xiàn)點(diǎn),采用血液成分單采漿機(jī)進(jìn)行康復(fù)者恢復(fù)期血漿采集,截至2020 年03 月26 日,全國(guó)共采集血漿1 000 余人次,其中武漢市采集的462人次血漿經(jīng)亞甲藍(lán)病毒滅活,并進(jìn)行各種病原學(xué)等檢測(cè)。檢測(cè)合格的血漿用于臨床救治,任一項(xiàng)目檢測(cè)不合格的血漿均未用于臨床,進(jìn)一步保障了抗SARSCoV-2 滅活血漿在臨床COVID-19 患者救治中使用的安全性。采集或制備的COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿進(jìn)行臨床救治至今,尚無(wú)病毒安全性事件報(bào)道,不僅在本次疫情期間對(duì)于患者救治具有重大意義,更對(duì)今后可能面臨的突發(fā)疫情防控措施的制定及疫情應(yīng)對(duì)提供了經(jīng)驗(yàn)。

COVID-19 疫情期間,COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿和血液制品在疫情防控中發(fā)揮了重要作用,康復(fù)者恢復(fù)期血漿及靜注人免疫球蛋白被列入COVID-19 重型、危重型及兒童 COVID-19 患者治療方案［14］。中國(guó)生物在此次COVID-19 疫情期間,倡導(dǎo)康復(fù)者恢復(fù)期血漿采集生產(chǎn)的抗SARS-CoV-2 滅活血漿用于臨床救治、臨床研究和靜注COVID-19 人免疫球蛋白的研發(fā),累計(jì)使上千人獲益。國(guó)外采用COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿也開(kāi)展了多項(xiàng)臨床研究［15-21］。由此可見(jiàn),血液制品與疫苗一樣,其供應(yīng)直接關(guān)系到人民健康和國(guó)家安全。

疫情期間收到捐獻(xiàn)血漿近萬(wàn)次咨詢,成功捐獻(xiàn)血漿比例在10% ～15%。民眾對(duì)采集血漿的知識(shí)了解程度是影響是否捐獻(xiàn)血漿決定的相關(guān)因素。疫情初期,醫(yī)務(wù)工作者獻(xiàn)漿比例較高,由于職業(yè)原因,醫(yī)務(wù)工作者對(duì)于血漿的認(rèn)識(shí)以及捐獻(xiàn)血漿的知識(shí)了解和認(rèn)可程度高于普通人群,提示對(duì)于血漿捐獻(xiàn)的宣傳政策和知識(shí)普及程度將影響捐獻(xiàn)血漿的預(yù)期。來(lái)訪咨詢中,超過(guò)獻(xiàn)漿年齡人員和疾病恢復(fù)期人員均有強(qiáng)烈的捐獻(xiàn)血漿訴求。身體暫時(shí)不適合獻(xiàn)漿的人員,在其身體狀況恢復(fù)后,近3 ／ 4 再次聯(lián)系,最終實(shí)現(xiàn)了捐獻(xiàn)血漿。

在歐美,捐獻(xiàn)血漿已成為一種生活方式。我國(guó)有規(guī)模龐大的潛在獻(xiàn)漿員人群,提升普通群眾對(duì)捐獻(xiàn)血漿的意識(shí),創(chuàng)造捐獻(xiàn)血漿的條件,我國(guó)的血漿采集量可以預(yù)見(jiàn)會(huì)有顯著提升。期望有積極的政策引導(dǎo),合適的宣傳方式讓國(guó)人參與到獻(xiàn)漿隊(duì)伍中。

綜上所述,單采血漿技術(shù)安全,在此次疫情中發(fā)揮了重要作用,采集的COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿具有較高的抗體滴度,SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性,經(jīng)病原學(xué)檢測(cè),合格的血漿用于臨床救治。亞甲藍(lán)滅活后,亞甲藍(lán)殘留均遠(yuǎn)低于0.3 μmol ／ L,符合要求。城市人群有捐獻(xiàn)血漿需求,因此我們呼吁在中心城市建立規(guī)?；瘑尾裳獫{技術(shù)平臺(tái)及應(yīng)急血漿采集制度,進(jìn)行康復(fù)者血漿儲(chǔ)備,增設(shè)漿站,發(fā)展血漿采集事業(yè),開(kāi)發(fā)血液制品,實(shí)現(xiàn)我國(guó)血漿和血液制品自給自足。