非洲豬瘟多基因家族MGF-505-3R 基因重組原核表達質粒的構建及表達

武悅 ，許會會 ，徐一鳴 ，王楠 ，王澤宇 ，楊蓮花 ，魯中爽，蔡維北，呂忠蕾，李霜

1.吉林元和元生物工程有限公司,吉林長春130102；2.吉林省疫病預防控制中心,吉林長春130102

2018 年8 月1 日,遼寧沈陽一養(yǎng)豬戶飼養(yǎng)的豬陸續(xù)死亡,疑似非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染。經檢測,確診為ASFV 核酸陽性,序列分析發(fā)現(xiàn),其基因序列與俄羅斯毒株100%匹配。這是我國發(fā)現(xiàn)的首起非洲豬瘟。

ASFV 是一種大型雙鏈DNA 病毒,是Asfarviridae 家族的唯一成員。ASFV 可感染家豬、野豬,它們可能會成為一個載體,主要靶點是豬單核巨噬細胞。ASFV 能引起高燒,出血性損傷,家豬厭食,甚至死亡。目前尚無沒有可用的ASFV 疫苗,也無有效的措施控制病毒傳播,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的負擔［1-3］。

MGF 嚴格來說不是指一個單獨的基因,而是一個多基因家族,MGF 505 是其中更小的家族基因,MGF-505-3R 中的3R 為非洲豬瘟基因缺失疫苗缺失毒株的基因結構向右側方向的第3 段基因,只是位次關系,并無特殊含義。ASFV 編碼的多個多基因家族蛋白中MGF 505 決定了ASFV 的細胞嗜性,與病毒在巨噬細胞內的復制密切相關,是ASFV 毒力的決定因素［2,4-6］。MGF 505 還參與抑制宿主干擾素的產生和調控促炎性細胞因子表達,并通過延長感染細胞的存活時間來提高病毒在宿主細胞內的增殖效率和數(shù)量［7-8］。此前,軍事獸醫(yī)研究所以我國首起非洲豬瘟病毒中分離到的流行毒株(SY-18)為親本構建了MGF 基因缺失的ASFV 基因缺失疫苗候選株,結果顯示,接種豬能夠100%抵抗親本毒株SY-18 的攻擊,因此,以MGF 為靶標的基因缺失毒株是較有前景的ASFV 疫苗候選毒株［9］。

本研究旨在構建ASFV SY-18 株多基因家族MGF-505-3R 基因的重組原核表達質粒,并表達重組蛋白,以期提供有效的抗原蛋白用于ASFV 的臨床診斷及防控。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及基因組 大腸埃希菌DH5α 和BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；原核表達載體pET-32a(+)購自諾唯贊生物公司；ASFV 基因組由軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良研究員惠贈。

1.2 主要試劑 基因組提取試劑盒、質粒DNA 小量純化試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒均購自康寧生命科學有限公司；Premix Prime-STAR HS 高保真DNA聚合酶、限制性內切酶XhoⅠ和EcoRⅠ及DNA marker均購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；IPTG 購自諾唯贊生物公司；單片段無縫克隆試劑盒購自莫納(武漢)生物科技有限公司。

1.3 引物設計及合成 根據(jù)NCBI 中ASFV SY-18 株基因的核苷酸序列(MN393476.1)設計1 對特異性引物,上游引物 MGF-505-3R-F 序列:5′-ggtggtggtgctcgagatgtcctcttctcttcaggaac-3(′下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點),下游引物 MGF-505-3R-R 序列:5′-tatcggatccgaattcctagctttcccaggtttcgaag-3(′下劃線部分為XhoⅠ酶切位點),并加入保護性堿基,擴增片段大小為843 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司長春分部合成。

1.4 MGF-505-3R 基因的擴增 以ASFV 基因組為模板,PCR 擴增MGF-505-3R 基因。反應體系:Premix Prime-STAR HS 10 μL,ddH2O 7 μL,上、下游引物各 1 μL,模板 1 μL,共 20 μL。反應條件:95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s,退火溫度設置為梯度(45 ～ 55 ℃之間)15 s,72 ℃延伸 15 s,共 35 個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。經凝膠電泳驗證后,發(fā)現(xiàn)在51 ℃時條帶最亮,因此用上述20 μL 體系做了5 管PCR 擴增,共100 μL。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,用膠回收試劑盒純化MGF-505-3R 基因片段。

1.5 重組原核表達質粒的構建 用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-32a(+)載體,膠回收試劑盒純化回收。用無縫克隆試劑盒將純化回收的目的基因MGF-505-3R 及雙酶切載體pET-32a(+)連接,連接產物轉化至大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細胞中,涂布于含1 mg ／ mL 氨芐西林的固體 LB 平板上,37 ℃靜置過夜。挑取7 個單菌落,進行菌液PCR(反應體系:高保真 DNA 聚合酶 Premix Prime-STAR HS 10 μL,上下游引物各 1 μL,模板 1 μL,ddH2O 補足體積至 20 μL。反應條件:95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性 15 s,51 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,共35 個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min)及質粒雙酶切鑒定,并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 生物信息學分析 通過ExPASy 在線預測分析蛋白質的理化性質,TMPred 法和HMM 法預測分析蛋白質的跨膜區(qū),PSIPRERD 法在線預測分析蛋白質的二級結構,通過同源建模SWISS-MODEL 在線預測蛋白質的三級結構。

1.7 重組MGF-505-3R 蛋白的誘導表達及純化 將鑒定正確的重組原核表達質粒pET-32A(+)-MGF-505-3R 轉化入大腸埃希菌BL21(DE3)中,挑取單個菌落,接種至含1 mg／mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,當菌液A600為0.8 ～1時,加入 1 mol ／ L IPTG,使其終濃度為 1 mmol ／ L,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h；分別各取1 mL 誘導前后菌液,6 000 × g離心10 min,收集菌體沉淀,用30 μL PBS 重懸,取樣進行10%SDS-PAGE 分析,經考馬斯亮藍染色3 h,脫色2 次后觀察結果。

純化過程利用凝膠掃描法計算融合蛋白的表達量,菌體超聲破碎后獲得的上清液經Ni-NTA 親和層析和CMSepharose FF 陽離子交換層析純化,10%SDS-PAGE 分析蛋白純度,BCA 法測定蛋白產量。

2 結 果

2.1 MGF-505-3R 基因擴增產物的鑒定 PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見843 bp 的特異性條帶,大小與預期一致,見圖1。

圖1 ASFV MGF-505-3R 基因PCR 產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of ASFV MGF-505-3R gene

2.2 重組原核表達質粒的鑒定 重組原核表達質粒pET-32A(+)-MGF-505-3R 經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切及菌液PCR 鑒定,均可見843 bp 的目的基因片段,見圖2 和圖3。測序結果表明,重組質粒構建正確。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 蛋白質的理化性質 ExPASy 在線預測分析顯示,MGF-505-3R 基因編碼氨基酸數(shù)量為843 個,經分析,不穩(wěn)定指數(shù)為45.78,將MGF-505-3R 蛋白分類為不穩(wěn)定的蛋白。親水性平均值(GRAVY)為0.801,為疏水蛋白。

2.3.2 蛋白質跨膜區(qū)預測 TMPred 法和HMM 法分析蛋白質的跨膜區(qū),預測圖形結果見圖4 和圖5,分析的3 個蛋白質的TM-螺旋長度均在17 ～33 之間。TMH 數(shù)為24,為跨膜蛋白。

2.3.3 蛋白質二級結構預測 PSIPRERD 法在線預測分析蛋白二級結構顯示,該蛋白由無規(guī)卷曲(random coil)、α 螺旋(alpha helix)和 β 折疊(β-sheet)組成為主要結構,見圖6。

圖2 重組原核表達質粒的菌液PCR 鑒定Fig.2 Identification of recombinant prokaryotic expression vector by PCR

圖3 重組原核表達質粒的雙酶切鑒定(EcoRⅠ／ XhoⅠ)Fig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid pET-32a(+)(EcoRⅠ／ XhoⅠ)

圖4 TMPred 法蛋白質跨膜域分析Fig.4 Analysis of transmembrane domain of protein by TMPred

圖5 HMM 法蛋白質跨膜域分析Fig.5 Analysis of transmembrane domain of protein by HMM

圖6 蛋白質二級結構分析Fig.6 Secondary structure of protein

2.3.4 蛋白質三級結構預測 蛋白質同源建模結構見圖7。無規(guī)則卷曲、α 螺旋 和β 折疊組成為主要成分,預測結果與二級結構預測相符。

圖7 編碼蛋白質的三級結構Fig.7 Tertiary structure of protein

2.4 表達及純化產物的鑒定 10% SDS-PAGE 分析顯示,表達的HIS 標簽重組蛋白相對分子質量約為33 000,大小與預期相符,見圖8。經凝膠掃描法計算融合蛋白表達量為37.8 mg ／ L。BCA 法測定重組蛋白產量可達19.8 mg ／ L。軟件分析純化后蛋白純度為97%。

圖8 表達及純化產物的SDS-PAGE 分析Fig.8 SDS-PAGE profile of expressed and purified protein

3 討 論

非洲豬瘟暴發(fā)速度極快,致死率接近百分之百。目前尚無有效的預防疫苗及治療措施,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。因此,在無法建立該病血清學檢測技術的情況下,利用重組ASFV 抗原建立快速、安全的診斷和檢疫方法十分必要。

ASFV 的基因家族十分龐大,且MGF 多基因家族中MGF-505 蛋白是很重要的結構蛋白。王曉麗等［10］研究表明,MGF-505 家族成員 pA528R 能通過抑制Poly(I:C)誘導的IRF3 和NF-ΚB 活性來抑制IFN 的表達。CORREIA 等［11］研究表明,MGF-530 ／ 5 05 的多個基因缺失后,可導致Ⅰ型IFN 在感染巨噬細胞中的誘導水平增加,且缺失后的毒株對Ⅰ型IFN 敏感,表明這些基因具有抑制IFN 應答和抗病毒狀態(tài)的功能。研究表明,大部分基因缺失疫苗針對親本毒株的攻擊具有同源保護作用,部分也具有一定的異源保護作用［10,12-13］。因此,ASFV 基因缺失疫苗免疫保護效果較理想,是短期內最有望研制成功的疫苗［10,14-16］。

敲除MGF-505-3R 所獲得的基因缺失毒株能夠誘導機體產生抵抗親本強毒株的保護作用,因此,以ASFV MGF-505-3R 基因為靶標開發(fā)基因缺失減毒活疫苗具有較大的可行性及實用價值［2,17-19］。本研究根據(jù)SY-18 株病毒基因組成功克隆了在ASFV 中穩(wěn)定存在的MGF-505-3R 基因,構建了重組原核表達質粒并成功表達了重組蛋白,對研制非洲豬瘟抗體檢測試劑盒具有重要意義。但表達的重組蛋白表達量不高,后續(xù)將對試驗方法進行改進,以提高重組蛋白的表達量及純度,為我國非洲豬瘟免疫血清學診斷試劑的制備及預防控制奠定基礎。