5-碘代殺結(jié)核菌素對小鼠神經(jīng)管的影響及其作用機制

張曉敏，李美寧，王文卓，李丹丹，牛玉虎，牛勃 ，2

1.山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室,山西太原030001；2.首都兒科研究所兒童發(fā)育營養(yǎng)組學北京市重點實驗室,北京100020

神經(jīng)管畸形(neural tube defect,NTD)是一種先天性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形,繼發(fā)于第3 和第4 周妊娠期間神經(jīng)管的閉合失敗。NTD 每年影響全球約30萬新生兒,嚴重威脅新生兒的生命健康［1］。有研究表明,NTD 是由遺傳因素和環(huán)境因素共同導致的,在環(huán)境致畸因素中葉酸缺乏與神經(jīng)管畸形的發(fā)生密切相關(guān)［2-4］。體內(nèi)葉酸在二氫葉酸還原酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸,四氫葉酸作為一碳單位的載體,參與嘌呤和嘧啶核苷酸的合成,并為甲硫氨酸循環(huán)提供甲基,葉酸缺乏不僅會影響核酸的生成,也會干擾體內(nèi)的甲基化反應,從而影響細胞的增殖、分化、凋亡等,最終誘導NTD 的發(fā)生［5-6］。全球各地報告顯示,近20 年,補充葉酸可有效降低NTD 的發(fā)生率,但其潛在的分子機制尚未明確［7-10］。

腺苷激酶(adenosine kinase,ADK)是嘌呤補救合成途徑的關(guān)鍵酶,可催化腺苷轉(zhuǎn)化為AMP,該途徑是葉酸代謝合成核酸的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是腺苷在體內(nèi)代謝的最主要途徑。本研究采用ADK 的抑制劑5-碘代殺結(jié)核菌素(5-iodotubercidin,ITU)模擬葉酸代謝障礙,建立小鼠NTD 模型,探討神經(jīng)上皮細胞的增殖、凋亡及N6-甲基腺苷(N6-methylodenosine,m6A)甲基化在NTD 發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ITU 購自美國APExBIO 公司；腺苷、AMP、S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)ELISA 檢測試劑盒購自上海通蔚生物科技有限公司；YF?594TUNELAssayApoptosisDetectionKit 及YF?594 Click-iT EdU Stain Kit 購自蘇州宇恒生物科技有限公司；鼠抗FTO 單克隆抗體、m6A RNA Methylation Quantification Kit 及兔抗METTL3 單克隆抗體購自英國 Abcam 公司；兔抗 YTHDF2、β-actin、β-tublin 單克隆抗體、兔抗caspase-3、PCNA 多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物 SPF 級 C57BL ／6J 小鼠,7 ～ 8 周齡,體重19 ～22 g,購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心,動物合格證號為:SCXK(晉)2015-0001。小鼠飼養(yǎng)于溫度22 ℃,濕度40% ～60%的SPF 級實驗動物房。

1.3 動物模型的建立 C57BL ／ 6J 小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后,于晚上6 點按1 ∶1 的比例將雌雄小鼠合籠,第2 天早上8 點分籠,檢查雌鼠陰栓并稱重,有陰栓者確定為孕(embryo,E)0.5 d,于E7.5 d 將孕鼠隨機分為 ITU 組(分別經(jīng)腹腔注射 2、3、4、5、6、7 mg ／kg的ITU)及對照組(經(jīng)腹腔注射等體積含2%DMSO 的生理鹽水)。E11.5 d 時,頸椎脫臼處死孕鼠,取小鼠胚胎,置體式顯微鏡下觀察、拍照,測量小鼠頂臀長,胚胎稱重,并記錄胚胎總數(shù)、吸收胎數(shù)及畸胎數(shù)。

1.4 組織病理學檢測 將對照組及NTD 組(最佳劑量ITU)胚胎用10%多聚甲醛固定,脫水、石蠟包埋,進行連續(xù)切片。切片脫蠟、水化后進行HE 染色。將切片置于顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 孕鼠血清中腺苷、AMP、SAH、SAM 含量的檢測NTD 組小鼠注射 0、2、4、8、12、24 h 后,經(jīng)眼球采血,845 × g 離心 5 min 分離血清,采用相應 ELISA 試劑盒檢測腺苷、AMP、SAH、SAM 含量。

1.6 胚胎腦組織中m6A 及相關(guān)蛋白含量的檢測E11.5 d 取出胚胎后,提取對照組及NTD 組小鼠胚胎腦組織總RNA,測定濃度,采用m6A RNA Methylation Quantification Kit 檢測孕鼠胚胎腦組織中的m6A含量。提取兩組小鼠胚胎腦組織總蛋白,BCA 法測定濃度。經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h；用TBST 洗滌3次,5 min ／ 次,加入兔抗 METTL3、YTHDF2 單克隆抗體及鼠抗 FTO 單克隆抗體(均 1 ∶1 000 稀釋),4 ℃孵育過夜；用 TBST 洗滌 3 次,5 min ／ 次,加入 HRP標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG(1 ∶5 000 稀釋),室溫孵育 1 h；用 TBST 洗滌 3 次,5 min ／次；ECL 法顯色。

1.7 小鼠胚胎腦組織中神經(jīng)上皮細胞增殖情況的檢測 對照組及NTD 組孕鼠經(jīng)腹腔注射5 mg ／ kg的EdU,13 h 后脫頸處死孕鼠,取胚胎,用4%多聚甲醛固定,腦組織進行連續(xù)切片。采用YF?594 Click-iT EdU Stain Kit 檢測孕鼠腦組織神經(jīng)上皮細胞Edu 陽性細胞數(shù)量,熒光顯微鏡下觀察、拍照,并計算百分比。同時檢測兩組小鼠胚胎腦組織中增殖相關(guān)蛋白PCNA 的表達量,方法同1.6 項,其中一抗為兔抗PCNA 多克隆抗體,稀釋度為1 ∶8 000。

1.8 小鼠胚胎腦組織中神經(jīng)上皮細胞凋亡情況的檢測 采用1.4 項方法制備組織切片,通過YF?594 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit 檢測孕鼠腦組織神經(jīng)上皮細胞TUNEL 陽性細胞,熒光顯微鏡下觀察、拍照,并計算百分比。同時檢測兩組小鼠胚胎腦組織中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 的表達量,方法同1.6 項,其中一抗為兔抗caspase-3 多克隆抗體,稀釋度為 1 ∶1 000。

1.9 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)± 標準差(± s)表示,組間比較采用t 檢驗,以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠胚胎的鏡下觀察 對照組胚胎生長發(fā)育良好,未出現(xiàn)NTD；ITU 組隨著ITU 劑量的增加,NTD 的發(fā)生率逐漸增加,且吸收胎和發(fā)育遲緩胚胎的比率也逐漸增加,當ITU 劑量為5 mg ／ kg 時,NTD 的發(fā)生率最高,達32.2%。畸形主要表現(xiàn)為后腦畸形,部分胚胎表現(xiàn)為露腦畸形,其他畸形包括顱面部畸形、無眼畸形及發(fā)育遲緩。見圖1 和表1。因此選取5 mg ／ kg 劑量作為最佳造模劑量。對照組(n = 41)及NTD 組(n = 38)胚胎的頂臀長分別為(6.52 ± 0.31)和(5.31 ± 1.42)mm,體重分別為(22.53 ± 2.56)和(16.78 ± 5.67)mg。與對照組比較,NTD 組胚胎的頂臀長和體重均明顯下降(t 分別為 8.317 和 10.13,P ＜ 0.05)。

圖1 ITU 致胚胎發(fā)育異常的主要類型Fig.1 Abnormal embryonic development caused by ITU

表1 各組小鼠胚胎發(fā)育情況Tab.1 Embryonic development of mice in ITU group with different doses

2.2 組織病理學檢測 對照組胚胎神經(jīng)管發(fā)育良好,管腔規(guī)則,神經(jīng)管閉合完全,神經(jīng)上皮細胞排列規(guī)則、緊密；NTD 組胚胎神經(jīng)管管壁厚薄不一,管腔不規(guī)則,神經(jīng)管未完全閉合,頂板處僅被一層間質(zhì)和羊膜所包裹,神經(jīng)上皮細胞排列紊亂、疏松。見圖2。

圖2 小鼠胚胎在E11.5 d 后腦HE 染色結(jié)果Fig.2 HE staining of brain tissue of mouse embryos on E11.5 d

2.3 孕鼠血清中腺苷、AMP、SAH、SAM 的含量 孕鼠血清中腺苷、SAM、SAH 在注射2 h 后開始升高,8 h達高峰(t 值分別為 12.15、9.389 和 11.75,P ＜ 0.01),8 h 后逐漸恢復至正常水平；AMP 的濃度在注射后2 h開始降低,8 h 濃度達最低(t = 6.326,P ＜0.05),8 h后逐漸恢復正常水平。見圖3。

2.4 小鼠胚胎腦組織中m6A 及其相關(guān)蛋白的含量對照組及NTD 組小鼠胚胎腦組織總RNA 中m6A含量分別為0.35 和0.23 ng,占總RNA 的比例分別為0.175%和0.115%。NTD 組m6A 在總RNA 中所占比例明顯低于對照組(t = 6.002,P ＜0.05)。對照組及NTD 組小鼠胚胎腦組織中METTL3 蛋白相對表達水平分別為0.98 和0.60,FTO 蛋白相對表達水平分別為0.78 和0.75,YTHDF2 蛋白相對表達水平分別為0.79 和0.82。與對照組比較,NTD 組的METTL3 蛋白表達水平明顯下降(t=10.68,P ＜0.05),FTO 和YTHDF2 蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(t 分別為 1.373 和 1.871,P ＞ 0.05,)。見圖 4。

2.5 小鼠胚胎腦組織中神經(jīng)上皮細胞的增殖情況對照組和NTD 組孕鼠腦組織神經(jīng)上皮細胞Edu 陽性細胞百分比分別為79%和59%,NTD 胚胎中處于增殖期的細胞明顯減少(t = 5.20,P ＜0.05),見圖5。對照組和NTD 組小鼠胚胎腦組織中的增殖相關(guān)蛋白PCNA 相對表達量分別為1.72 和1.05,后者明顯降低(t = 8.567,P ＜ 0.05),見圖 6,表明 NTD 胚胎腦組織中細胞增殖減慢。

圖3 小鼠血清中腺苷及相關(guān)代謝物的水平Fig.3 Levels of adenosine and related metabolites in sera of mice

圖4 小鼠胚胎腦組織中METTL3(A)、YTHDF2(B)、FTO(C)蛋白的表達情況Fig.4 Expressions METTL3(A),YTHDF2(B)and FTO(C)proteins in mouse embryonic brain tissue

圖5 ITU 對神經(jīng)上皮細胞增殖的影響(× 100)Fig.5 ITU effect on proliferation of neuroepithelial cells(×100)

圖6 小鼠胚胎腦組織中PCNA 的表達情況Fig.6 Expression level of PCNA in mouse embryonic brain tissue

2.6 小鼠胚胎腦組織中神經(jīng)上皮細胞的凋亡情況對照組和NTD 組TUNEL 陽性細胞百分比分別為3.3%和13.3%,NTD 胚胎中凋亡細胞明顯增多(t =5.295,P ＜0.05),見圖7。對照組和NTD 組小鼠胚胎腦組織中的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 的相對表達水平分別為0.64 和1.33,后者明顯增加(t=12.47,P ＜0.05),見圖8。表明NTD 胚胎腦組織中細胞凋亡增加。

圖7 ITU 對神經(jīng)上皮細胞凋亡的影響(× 100)Fig.7 Effect of ITU on apoptosis of neuroepithelial cells(×100)

圖8 小鼠胚胎腦組織中caspase-3 的表達情況Fig.8 Expression of caspase-3 in mouse embryonic brain tissue

3 討 論

有研究表明,葉酸缺乏與NTD 明顯相關(guān)［11-12］,但作用機制尚未明確。本研究通過ADK 的抑制劑ITU 建立了NTD 小鼠模型,探討由ITU 引起核酸合成障礙及腺苷含量增高對神經(jīng)管發(fā)育的影響。

ADK 是催化腺苷轉(zhuǎn)化為AMP 的關(guān)鍵酶,該途徑也是腺苷在體內(nèi)代謝的最主要途徑,ITU 抑制腺苷激酶會導致腺苷在體內(nèi)大量積聚,AMP 水平下降。本研究結(jié)果表明,ITU 抑制ADK 可引起小鼠血漿中AMP 含量下降,進而影響核酸合成。胚胎發(fā)育過程中對核酸和蛋白的需求最旺盛,該過程中核酸合成障礙將嚴重影響細胞的增殖及分化［13-15］,從而導致神經(jīng)管發(fā)育的異常。

腺苷作為甲硫氨酸循環(huán)中SAH 的分解產(chǎn)物,其升高會抑制SAH 的分解,從而引起SAH 積聚,進而抑制SAM 轉(zhuǎn)甲基化反應,引起體內(nèi)的低甲基化［16-18］。m6A 是mRNA 的一種甲基化修飾形式,m6A 修飾是動態(tài)可逆的過程,其發(fā)揮生物學功能需要甲基化酶(writer)、去甲基化酶(eraser)及 m6A 識別蛋白(reader)的參與［19-21］。其中METTL3 是甲基轉(zhuǎn)移酶之一,含有一個SAM 結(jié)合區(qū)域［22-24］,且能夠識別特定潛在的m6A 修飾位點,并將SAM 的甲基轉(zhuǎn)移至該位點上。FTO 是m6A 的一種去甲基化酶,FTO 廣泛存在于成人和胚胎組織中,在大腦中表達較高［25-27］。YTHDF2 是m6A 結(jié)合蛋白,可促進mRNA 的降解。上述m6A 相關(guān)蛋白相互作用,共同影響m6A 水平。本研究結(jié)果表明,NTD 組m6A 甲基化明顯減低(P <0.01),METTL3 的表達水平也明顯降低(P < 0.01),FTO 和YTHDF2 蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。有研究表明,m6A 對胚胎發(fā)育過程具有重要的作用,在哺乳動物中,m6A 可維持胚胎干細胞(ES)細胞分化,維持晝夜節(jié)律和劑量補償?shù)淖饔茫?8-29］,METTL3 基因敲除的小鼠植入前胚胎干細胞和“幼稚”胚胎干細胞在mRNA 中無m6A 發(fā)生,無法充分終止其“幼稚”狀態(tài),在胚胎植入后受到異常和限制性的譜系啟動,導致早期胚胎死亡［30-31］。因此ITU 通過引起體內(nèi)的低甲基化,可能引起m6A 水平下降,從而影響細胞的分化、凋亡等,導致NTD 的發(fā)生。本實驗結(jié)果表明,NTD 胚胎腦組織中細胞增殖明顯減慢(P<0.05),細胞凋亡明顯增加(P<0.05)。

綜上所述,ITU 可導致小鼠NTD,其作用機制可能為:腺苷激酶受抑制,導致小鼠血漿中AMP 含量下降及腺苷含量增加,進而影響核酸的合成,干擾RNA 甲基化,引起m6A 含量下降,導致細胞增殖和凋亡失衡,從而導致小鼠NTD。