兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60 抗原區(qū)的原核表達及其免疫保護效果

楊柳 ，林永潤 ，牟豪 ，許國洋 ，余遠迪 ，沈克飛 ，付利芝

1.重慶市畜牧科學院,重慶402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,重慶402460；3.西南大學榮昌校區(qū),重慶402460

兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染引起的一種急性、接觸性和高致死性傳染病,以發(fā)病兔全身實質(zhì)器官水腫、出血性變化和淤血為主要特征［1］。1989 年,世界動物衛(wèi)生組織(Office International des épizooties,OIE)將 RHD 列為B 類傳染病,該病對經(jīng)濟學和生態(tài)學可產(chǎn)生重要影響［2］。

目前廣泛使用的RHD 組織滅活疫苗是將含RHDV 的動物組織勻漿,經(jīng)甲醛滅活后制備而成,在防控RHD 中發(fā)揮了重要作用,但該疫苗的制備過程不符合動物福利要求,且病毒量難以控制,不易保存,存在滅活不徹底向環(huán)境散毒的風險［3］,因此,研發(fā)新型疫苗顯得尤為重要。RHDV 為單股正鏈RNA病毒,病毒粒子呈球形、無囊膜、20 面體對稱,不易進行體外大量培養(yǎng)。RHDV 衣殼蛋白VP60 是主要結(jié)構(gòu)蛋白,相對分子質(zhì)量約60 000,180 個VP60 單體組成病毒粒子核衣殼。VP60 蛋白是病毒的免疫保護性抗原,在誘導宿主免疫反應中發(fā)揮重要作用,是RHD疫苗研究的靶標抗原［4］。有研究采用 E.coli［5］、釀酒酵母［6］、昆蟲細胞［7］、豬痘病毒［8］及植物［9］等系統(tǒng)表達了VP60 蛋白,但由于其相對分子質(zhì)量較大,原核或真核系統(tǒng)表達時均存在表達不穩(wěn)定及表達量偏低的缺點,增加了亞單位疫苗生產(chǎn)成本。MARTINEZTORRECUADRADA 等［4］研究發(fā)現(xiàn),位于 VP60 蛋白N-末端第 31 ～ 250 位(L 區(qū))和 C-末端第 477 ～ 579位(H 區(qū))的氨基酸是VP60 蛋白的抗原區(qū)域；孟春春等［10］將這兩抗原區(qū)域和Th 細胞表位融合表達,并用融合蛋白免疫家兔,獲得的抗體可抵抗致死劑量RHDV 攻擊。為降低目標蛋白相對分子質(zhì)量、減少兩抗原區(qū)的相互干擾及保持抗原區(qū)的功能,本實驗選用柔性連接肽串聯(lián)兩抗原區(qū)段,經(jīng)原核表達及純化后,免疫家兔,以期獲得抗RHDV 的特異性抗體,有效抵抗RHDV 感染,為相應疫苗的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 病死兔來自重慶某兔場。

1.2 質(zhì)粒、菌株及毒株 載體pMD18-T 購自日本TaKaRa 公司；原核表達載體pET30a(+)及感受態(tài)E.coli DH5α 和感受態(tài)E.coli BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司；RHDV SZ ／ 2013 強毒株病毒液(用RHDV SZ／2013 強毒株感染家兔,取感染致死兔肝臟,制備成組織研磨液,采用人O 型紅細胞凝集試驗測定病毒血凝效價為1 ∶256)。

1.3 主要試劑 病毒RNA ／ DNA 提取試劑盒(Viral RNA ／ DNA Extraction Kit Ver 5.0)、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ和 T4 DNA 連接酶及 PCR Master Mix(2 ×)均購自日本TaKaRa 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT-PCR Kit)、質(zhì)粒小提試劑盒及膠回收試劑盒購自美國Omega 公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗RHDV 多克隆抗體由重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心實驗室保存；RHDV IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒(20170218)購自山東綠都生物科技有限公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Ni2+-NTA 金屬螯合蛋白質(zhì)純化柱購自北京諾和生物技術(shù)有限公司；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.4 實驗動物 家兔購自重慶龍翔肉兔養(yǎng)殖場,35日齡,體重約1.0 kg,試驗前觀察7 d,兔健康無病。經(jīng) RT-PCR 及抗體 IgG ELISA 檢測,確認 RHDV 抗原、抗體均為陰性。

1.5 引物設計及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的RHDV JX ／ 97 株衣殼蛋白基因(DQ205345.1)序列,應用GeneTool 軟件,設計VP60 引物及菌落PCR 檢測引物。VP60-F:5′-TGTGAATTCATGGAGGGCAAAACCCGCAC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點),VP60-R:5′-GCAAGCTTTCAGACATAAGAAAAGCCATGG -3′(下劃線部分為HindⅢ酶切位點),擴增產(chǎn)物大小為 1 740 bp；菌落 PCR-F:5′-CAACGAATTCGACCCTGGTGTAGT-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點),菌落 PCR-R:5′-CGCGAAGCTTTTAAACATAGCTAAAGC-3′(下劃線部分為HindⅢ酶切位點),擴增產(chǎn)物大小為1 014 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6 目的基因的擴增 取病死兔肝臟,稱重,加入10 倍體積的0.9%氯化鈉溶液,勻漿,反復凍融,13 800 × g 離心 10 min,取上清 200 μL,用病毒RNA ／ DNA 提取試劑盒提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板,VP60-F／R 為引物,進行PCR 擴增。PCR 反應體系為:2 × Taq PCR Master Mixes 25.0 μL,cDNA 4.0 μL,Primer-F ／R(10 μmol／L)各 1.0 μL,ddH2O 19.0 μL,共 50.0 μL。PCR 反應條件為:94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min,55 ℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共30 個循環(huán)；72℃再延伸10 min。同時設無模板的PCR 反應體系作為陰性對照。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 目的基因的生物信息學分析 回收目的基因,連接至載體pMD18-T,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α,經(jīng)藍白斑篩選,取陽性克隆,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序DNA 進行BLAST 比對；采用軟件MEGA 4 進行系統(tǒng)進化樹分析；利用ORF Finder在線分析軟件(https:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／orffinder／)分析測序DNA 編碼蛋白,并參考文獻［4］明確VP60氨基酸序列的兩抗原區(qū)段。

1.8 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 用柔性連接肽(Gly4Ser)3 串聯(lián)2 個抗原區(qū)段,按E.coli 密碼子偏好性優(yōu)化設計編碼串聯(lián)氨基酸的DNA,在序列上下游末端分別加入HindⅢ及EcoRⅠ酶切位點,DNA 序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將原核表達載體pET30a(+)及合成DNA 片段均經(jīng)HindⅢ及EcoRⅠ進行雙酶切,產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。膠回收目的基因片段及載體片段,以T4 DNA 連接酶于16 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物及空載體pET30a(+)分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21(DE3)；挑取單克隆,以菌落PCR-F／R 為引物進行菌液PCR 鑒定,鑒定正確的陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序正確的重組表達質(zhì)粒命名為pET30a(+)-LH。

1.9 重組蛋白的表達 將陽性單克隆及空載體轉(zhuǎn)化菌分別接種至LB 液體培養(yǎng)中,于37 ℃培養(yǎng)至菌液A600= 0.4 時,加入 IPTG 至終濃度 1 mmol ／ L,37 ℃誘導培養(yǎng),分別于 0、1、2、3、4、5 h 收獲誘導菌液和空載體誘導菌各1.0 mL,13 800 × g 離心2 min,收集菌體,經(jīng)12% SDS-PAGE 分析。收集最適誘導時間的陽性克隆菌體,超聲破碎,分別收集上清和沉淀,進行12% SDS-PAGE 分析。

1.10 重組蛋白的純化及鑒定 將最佳誘導時間的重組誘導菌及空載體誘導菌的超聲破碎沉淀用緩沖液(8 mol ／ L 尿素,2 mmol ／ L EDTA,2 mmol ／ L 巰基乙醇,20 mmol／L Tris-HCl,pH 8.0)溶解過夜；13 800× g 離心10 min,收集上清。參考文獻［11］,采用Ni2+-NTA金屬螯合蛋白層析柱進行純化,再參考文獻［12］方法對純化蛋白進行復性處理,采用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定復性蛋白濃度。純化產(chǎn)物經(jīng)12% SDSPAGE 分離蛋白后,轉(zhuǎn)移至 NC 膜上,用 1%BSA 于 4 ℃封閉過夜；PBST 洗滌3 次,加入兔抗RDHV 多克隆抗體(1 ∶500 稀釋),室溫孵育 2 h；PBST 洗滌 3 次,加入 HRP 標記的羊抗兔 IgG(1 ∶5 000 稀釋),于室溫孵育2 h；PBST 洗滌3 次,DAB 顯色試劑盒顯色。

1.11 重組蛋白免疫保護效果的檢測 將重組蛋白與弗氏佐劑按1 ∶1 的體積比混合,充分乳化后,經(jīng)兔背部皮下注射,1.0 mg ／ 只,共免疫 3 次,每次間隔2 周。同時設對照組(注射弗氏佐劑與0.9%氯化鈉溶液的乳化產(chǎn)物,其他同試驗組)。分別于免疫前、首次免疫后14、28、42 d 經(jīng)耳靜脈采血,分離血清,采用RHDV IgG 抗體ELISA 試劑盒檢測血清中RHDV抗體水平。末次免疫2 周后,經(jīng)家兔腿部肌肉注射RHDV SZ ／ 2013 強毒株病毒液,2 mL ／ 只。攻毒后每天觀察家兔癥狀,死亡兔及時剖解觀察；10 d 后對全部家兔進行剖解觀察。記錄肝、肺和腎等臟器的病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的鑒定 RHDV VP60 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,于約1 700 bp 處可見單一目的基因條帶,大小與預期相符,見圖1。

2.2 目的基因的生物信息學分析 目的基因序列與RHDV 山東分離株VP60 基因的核苷酸相似性最高,達95.86%,將該毒株命名為RHDV Chongqing ／2016。目的基因編碼579 個氨基酸,明確了VP60 兩抗原區(qū)段為氨基酸序列的N-末端L 區(qū)和C-末端H區(qū),見圖2。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示,該病毒屬于RHDV,在進化樹上處于獨立分枝,見圖3。

圖 1 RHDV VP60 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of RHDV VP60 gene

2.3 重組表達質(zhì)粒的鑒定 重組菌菌液PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,于約1 000 bp 處可見單一目的基因條帶,大小與預期相符,空載體轉(zhuǎn)化菌未見該目的條帶,見圖4。測序結(jié)果表明,目的基因序列與優(yōu)化合成的DNA 序列一致。表明重組表達質(zhì)粒pET30a(+)-LH 構(gòu)建正確。

2.4 表達產(chǎn)物的鑒定 表達產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量約50 000,大小與預期相符；隨誘導時間的延長,蛋白表達量逐漸增加,于4 h 時達最高,因此確定最適誘導時間為4 h。見圖5。超聲破碎上清未見明顯目的蛋白條帶,沉淀可見相對分子質(zhì)量約50 000 的目的蛋白條帶,大小與預期相符,見圖6。表明重組蛋白主要以包涵體形式表達。

2.5 純化產(chǎn)物的鑒定 純化產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約50 000,大小與預期相符,空載體誘導菌未見該目的蛋白條帶,見圖7。純化產(chǎn)物可與兔抗RHDV 多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,于相對分子質(zhì)量約50 000 處可見特異性結(jié)合條帶,大小與預期相符,純度達88.3%；空載體誘導蛋白未見該結(jié)合條帶。見圖8。

2.7 重組蛋白的免疫保護效果 試驗組家兔首次免疫14 d 即產(chǎn)生了抗RHDV 特異性抗體,隨時間延長呈逐漸升高的趨勢,且較穩(wěn)定；對照組各時間點抗RHDV 特異性抗體均較低。見圖9。試驗組家兔攻毒后10 d 無死亡,整個試驗期間采食正常,無病癥出現(xiàn),保護率達100%；剖檢可見家兔肝、肺和腎等臟器均正常,未見出血癥狀。對照組家兔于攻毒后72 h 內(nèi)全部死亡,癥狀為食欲減退、精神不振,死亡前咬兔籠、尖叫、掙扎,鼻腔中有泡沫狀出血、眼結(jié)膜充血；剖檢可見家兔肝腫大、黃褐色、質(zhì)脆,表面散在灰白色針尖至粟粒大壞死灶,兩腎有不同程度淤血、變性,心腔內(nèi)有積留黑紅色血液和血塊。

圖2 VP60 ORF 及其編碼相應氨基酸Fig.2 VP60 ORF and encoded amino acid sequence

圖 3 RHDV Chongqing ／ 2016 毒株VP60 基因的核苷酸進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of nucleotide of RHDV Chongqing ／ 2016 based on VP60 gene

圖4 重組菌的菌液PCR 鑒定Fig.4 Identification of recombinant bacteria by PCR

圖5 重組蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of expressed recombinant protein

圖6 重組蛋白表達形式的分析Fig.6 Analysis of form of expressed recombinant protein

圖7 純化蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE profile of purified protein

圖8 純化蛋白的Western blot 分析Fig.8 Western blotting of purified protein

圖9 不同免疫時間家兔血清中的RHDV 抗體水平Fig.9 RHDV antibody level in sera of rabbits at different time points after immunization

3 討 論

RHD 是危害兔養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的一種重要傳染性疫?。?3-14］,該病分布廣泛、危害嚴重,給兔養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失。目前,采用傳統(tǒng)的組織滅活疫苗免疫防控RHD 存在諸多不足。通過分子生物學手段,從病毒核酸分子入手,研發(fā)預防RHDV 感染的新型疫苗已成為當前研究的熱點［15-16］。RHDV僅有單一血清型,疫苗可為不同病毒株感染提供交叉保護［17］,該病毒衣殼VP60 蛋白在誘導宿主免疫反應中發(fā)揮重要作用,具有相對保守的氨基酸序列［18］。因此,VP60 蛋白為新型RHD 疫苗的研制提供了可能。

根據(jù)RHDV 衣殼蛋白VP60 的抗原結(jié)構(gòu)特點,本研究以 RHDV SZ ／ 2016 株 VP60 的兩個主要抗原區(qū)段為研究目標,選用柔性連接肽(Gly4Ser)3 將其串聯(lián)起來,構(gòu)建了表達衣殼蛋白VP60 兩抗原區(qū)域的重組表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG 誘導4 h,目標蛋白獲得高效表達。隨后采用Ni2+-NTA 柱進行了蛋白初步純化,純度達88.3%,純化效果較好。柔性連接肽的使用,保持了兩功能域之間的距離,使連接的功能域之間不互相干擾,從而更好地發(fā)揮各自作用［19］。

Western blot 分析結(jié)果表明,表達產(chǎn)物對感染RHDV 家兔的陽性血清有較好的反應原性。動物試驗結(jié)果表明,純化的重組蛋白免疫家兔后,可產(chǎn)生針對RHDV VP60 蛋白的特異性抗體,且對RHDV攻擊產(chǎn)生了良好的免疫保護效果,保護率為100%。與RHDV 的衣殼蛋白VP60 比較,該構(gòu)建方式獲得的重組蛋白氨基酸序列較短,相對分子質(zhì)量明顯降低；另外,本研究還基于E.coli 密碼子偏好性將編碼串聯(lián)蛋白的DNA 序列進行優(yōu)化處理,整條核苷酸序列經(jīng)修飾后減少了稀有密碼子,不僅有利于保護性抗原穩(wěn)定高效地表達,還便于串聯(lián)蛋白的后續(xù)純化與制備。但本實驗原核表達的串聯(lián)蛋白是以包涵體的形式存在,如何有效大量獲得可溶性串聯(lián)蛋白質(zhì)還需進一步深入研究。本研究為預防RHD 的基因工程亞單位疫苗的研發(fā)提供了實驗依據(jù)。