Toll 樣受體預(yù)活化的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人肺癌H460 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

鄧穎珊，杜晶春，徐霞，謝閨娥，林雪霏，賴斯華

廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院,廣東廣州510182

腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均離不開腫瘤微環(huán)境的作用。腫瘤微環(huán)境作為一個(gè)復(fù)雜的空間,其中包含基質(zhì)細(xì)胞、多種細(xì)胞外基質(zhì)成分和蛋白質(zhì),以及大量的信號(hào)分子、旁分泌和生長(zhǎng)因子等。在腫瘤微環(huán)境中,危險(xiǎn)相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)-Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)復(fù)合物能夠觸發(fā)多種復(fù)雜細(xì)胞相互作用,并可通過動(dòng)態(tài)改變細(xì)胞因子環(huán)境來控制相互作用的過程［1-2］。TLRs 作為多種模式受體(pattern recognition receptor,PRR),可通過識(shí)別廣泛存在于微生物病原體中的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)和DAMPs,從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑,觸發(fā)炎癥和抗病毒反應(yīng)以及樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)成熟,繼而消除入侵的病原體［3-4］。聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid)簡(jiǎn)稱為Poly(I ∶C),是人工合成的雙鏈RNA 類似物,作為TLR3 配體,其可活化除TLR 通路外的RIG-I ／ MDA5 和 PKR 通路等,從而誘導(dǎo)多種炎癥通路介導(dǎo)的信號(hào)途徑。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可通過結(jié)合存在于宿主細(xì)胞膜表面的TLR4 和髓樣分化蛋白-2(myeloid differential protein-2,MD-2)形成復(fù)合物,引發(fā) NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子的激活,繼而促進(jìn)促炎因子如TNF-α、IL-6 等的分泌,從而參與多種疾病的發(fā)展。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于其本身的歸巢性、天然免疫豁免特性以及可通過自分泌或旁分泌途徑分泌多種細(xì)胞因子等特性,近年來被應(yīng)用于抗腫瘤策略研究。MSCs 是一種來源于發(fā)育早期的中胚層干細(xì)胞,具有多向分化和自我更新能力。其最早于骨髓中被發(fā)現(xiàn),目前還可從脂肪、肌肉、滑膜、臍帶、胎盤、羊水等組織中獲得。MSCs 主要來源于骨髓,但由于骨髓來源的MSCs 的提取不僅可能對(duì)供體造成一定的損傷,而且骨髓中的MSCs 含量較低,因此,獲取該來源的MSCs 會(huì)在一定程度上受到限制［5］。而脂肪來源的MSCs 具有來源充足,提取方法簡(jiǎn)便,產(chǎn)量高,增殖快和不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)。

有研究表明,MSCs 對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的作用具有兩個(gè)截然不同的效果,即其既可表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)也可表現(xiàn)出抑制腫瘤生長(zhǎng)［6-7］。MSCs 對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)發(fā)揮的作用取決于其所處的微環(huán)境,因此,對(duì)MSCs所處的微環(huán)境進(jìn)一步研究,才能安全地將其應(yīng)用于臨床。我們前期研究發(fā)現(xiàn),在人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460模型中,MSCs 表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用,但經(jīng)IFNβ 處理后的MSCs 表現(xiàn)出抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,并證明經(jīng)IFN 刺激的MSCs 能表達(dá)腫瘤壞死相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,同時(shí)也發(fā)現(xiàn),來自凋亡腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基也能上調(diào)MSCs 中TRAIL 的表達(dá),繼而通過這種正反饋增強(qiáng)了由IFNs 引發(fā)的MSCs 的抗腫瘤作用［6］。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3-4,6］,我們推測(cè),凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放的DAMPs 在凋亡細(xì)胞促進(jìn)MSCs 表達(dá)TRAIL 這一過程中可能發(fā)揮了作用,因此,本研究選取Poly(I ∶C)、LPS 模擬凋亡細(xì)胞釋放的DAMPs,預(yù)活化人脂肪MSCs(human adipose-derived stem cells,hADMSCs),以人肺癌H460 細(xì)胞作為代表,研究預(yù)活化后的hADMSCs 對(duì)腫瘤細(xì)胞能否產(chǎn)生抑制其生長(zhǎng)的作用。

1 材料與方法

1.1 脂肪組織及細(xì)胞 脂肪組織為廣州丘山國(guó)際美容整形醫(yī)院整形外科抽脂手術(shù)遺棄組織,用于實(shí)驗(yàn)均知情同意,符合醫(yī)學(xué)倫理標(biāo)準(zhǔn)；人肺癌H460 細(xì)胞來自ATCC 細(xì)胞庫(kù)的貼壁細(xì)胞,人肺癌細(xì)胞H460-EGFP由本學(xué)院前期構(gòu)建,于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 低糖DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)基粉末、RMPI1640 培養(yǎng)基粉末、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液和0.25%胰酶-0.2% EDTA 均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；Recombinant Human FGF-basic 購(gòu)自美國(guó) Pepro Tech 公司；Ⅰ型膠原酶、Poly(I ∶C)、LPS 和兔抗GAPDH 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；兔抗TRAIL 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗購(gòu)自臺(tái)灣Arigo Biola-boratories Corp.公司；Cell Counting Kit 8 購(gòu)自日本東仁化學(xué)公司；間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)試劑盒和成脂誘導(dǎo)試劑盒購(gòu)自廣州賽萊拉科技股份有限公司；流式分析用抗體購(gòu)自美國(guó)BD 公司和天津三箭生物技術(shù)有限公司；ELISA 試劑盒購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；細(xì)胞成像儀和酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek 公司；流式分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman 公司。

1.3 hADMSCs 的收集、培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增 無菌條件下將脂肪抽吸后的液體74 × g 離心3 min,取上層懸浮的脂肪組織,用PBS 漂洗,再74 × g 離心 5 min,漂洗,取上層脂肪組織,重復(fù)操作2 次；加入2 倍體積的0.2%膠原酶,37 ℃搖床消化45 min ～1 h；消化后的糊狀消化液用100 目不銹鋼篩網(wǎng)過濾,收集濾液,260 × g 離心 5 min,棄上清,用 1 mL L-DMEM 重懸,再加入5 mL 紅細(xì)胞裂解液,室溫下靜置10 min；260 × g 離心 5 min,棄上清,PBS 反復(fù)漂洗后,用 LDMEM(含體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清,1%的青霉素-鏈霉素)重懸細(xì)胞,接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h 后首次半量換液,待細(xì)胞培養(yǎng)至75% ～90%融合時(shí),計(jì)數(shù),用 0.25%胰酶 1 ∶3 消化傳代,每 3 ～ 4 d 消化傳代1 次,連續(xù)傳3 代后,獲得形態(tài)均一的MSCs。用25 μg ／ mL 的 Poly(I ∶C)或 0.1 mg ／ mL 的 LPS 對(duì)hADMSCs 誘導(dǎo)12 h,觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制 取第6 代培養(yǎng)的hADMSCs,消化后鋪于 24 孔板內(nèi),10 000 個(gè) ／ 孔,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁良好,貼壁后的第1、3、5、7、9 天,用CCK8 試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù):每孔加入10 μL CCK8 試劑,反應(yīng) 30 min 后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度,每次測(cè)4 個(gè)孔,取平均值。

1.5 細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定 hADMSCs 長(zhǎng)至90%后,將細(xì)胞分為3 組:對(duì)照組(未經(jīng)刺激,僅更換培養(yǎng)基)、Poly(I ∶C)誘導(dǎo)組［加入 25 μg ／ mL Poly(I ∶C)刺激 12 h］和 LPS 誘導(dǎo)組(加入 0.1 mg ／ mL LPS 刺激12 h)。用0.25%胰酶消化細(xì)胞,166 × g 離心3 min,棄上清,PBS 漂洗2 次,均分至各個(gè)離心管中,加入相應(yīng)抗體,4 ℃下避光45 min；離心棄上清,每管加入 500 μL PBS 重懸,166 × g 離心 3 min 去除未標(biāo)記抗體,棄上清,每管加入200 μL PBS 重懸沉淀,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC。

1.6 hADMSCs 的體外誘導(dǎo)分化

1.6.1 成骨誘導(dǎo)分化 將傳代擴(kuò)增后的第4 代hADMSCs 按 2 × 105個(gè) ／mL 的密度接種于 6 孔板中,每孔加入2.5 mL 培養(yǎng)基,置于37 ℃,5% CO2,95%濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)60%后,吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,PBS 漂洗3 次,棄去PBS,將細(xì)胞分為4 組:對(duì)照組(加入L-DMEM)、普通誘導(dǎo)組(加入2.5 mL 成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基)、Poly(I ∶C)誘導(dǎo)組［加入 25 μg ／ mL Poly(I ∶C)和成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基］和 LPS 誘導(dǎo)組(加入 0.1 mg ／ mL LPS 和成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基),每3 d 更換1 次成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基和L-DMEM 培養(yǎng)基,至誘導(dǎo)培養(yǎng)3 周時(shí),進(jìn)行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色。

1.6.2 成脂誘導(dǎo)分化 細(xì)胞分組及處理同1.6.1 項(xiàng),僅將成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基,至誘導(dǎo)培養(yǎng)第19 天進(jìn)行油紅O 染色。

1.7 Pol(yI ∶C)或LPS誘導(dǎo)后的hADMSCs分泌IFNβ含量的測(cè)定 經(jīng) 5 和 25 μg ／ mL Poly(I ∶C)、0.1和0.5 mg ／ mL LPS 刺激 hADMSCs 12 h 后,收集培養(yǎng)基上清,以未經(jīng)刺激的細(xì)胞作為對(duì)照,按照ELISA試劑盒說明檢測(cè)上清液中的IFNβ 濃度。

1.8 Poly(I ∶C)預(yù)處理的 hADMSCsTRAIL 表達(dá)的檢測(cè) 采用 Western blot 法。分別用 5、25、50 μg ／ mL Poly(I ∶C)預(yù)處理 hADMSCs 12 h,以未經(jīng) Poly(I ∶C)處理的細(xì)胞作為對(duì)照,用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞后,細(xì)胞裂解緩沖液裂解,離心除去不溶物,BCA法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)12% SDS-PAGE 分離每組中相同量的蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,用0.1%Tween-20、含 5%脫脂奶粉的 TBS(TBS ／ T)溶液于室溫下封閉 1 h；加入兔抗 TRAIL 抗體(1 ∶1 000 稀釋)或兔抗 GAPDH 抗體(1 ∶7 500 稀釋),4 ℃孵育過夜；再加入過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗(1 ∶10 000 稀釋),室溫下孵育1 h；用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)試劑盒檢測(cè)。

1.9 Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的 hADMSCs 與 H460 細(xì)胞共培養(yǎng)后靶細(xì)胞活性的檢測(cè)

1.9.1 CCK8 法 將傳代擴(kuò)增后的第5 代hADMSCs消化計(jì)數(shù)后,按每孔10 000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中,共接種3 塊板,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí),分別用0、5、10、25、50 μg ／ mL 的 Poly(I ∶C)提前刺激 12 h,每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)孔,再按照 2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2 的比例分別將H460 細(xì)胞加入板中共培養(yǎng)48 h。用CCK8 試劑盒測(cè)定細(xì)胞數(shù)量∶吸棄舊培養(yǎng)液,每孔加入100 μL新培養(yǎng)液,再加入10 μL 試劑,反應(yīng)30 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 和630 nm 處的吸光度,計(jì)算增量。每次測(cè)3 個(gè)孔,取平均值。

1.9.2 顯微鏡觀察 將傳代擴(kuò)增后的第5 代hADMSCs按 1 × 105個(gè) ／ mL 的密度接種于 6 孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%,加入Poly(I ∶C)提前刺激hADMSCs 12 h,以未經(jīng)Poly(I ∶C)刺激的細(xì)胞作為對(duì)照,按照2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2 比例,將消化計(jì)數(shù)后的 H460-EGFP 加入6 孔板中共培養(yǎng)48 h,細(xì)胞成像儀觀察共培養(yǎng)情況。利用Image-pro plus 統(tǒng)計(jì)H460-EGFP 在共培養(yǎng)體系中的數(shù)量(對(duì)照組計(jì)為1)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Prism 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以表示,組間比較采用方差分析,以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hADMSCs 的形態(tài) 原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后,光學(xué)顯微鏡鏡下可見呈紡錘形、梭形的貼壁細(xì)胞散在分布。繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間,細(xì)胞形態(tài)逐漸均一,呈纖維樣或魚群樣排列,見圖1A。待細(xì)胞融合至80% ～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,第3 代hADMSCs 細(xì)胞均一穩(wěn)定,第15 代之前細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,均呈纖維樣。經(jīng) Poly(I ∶C)和 LPS 誘導(dǎo)后,hADMSCs 形態(tài)未見明顯變化,見圖1B 和1C。

圖 1 第 6 代 hADMSCs 的形態(tài)(× 40)Fig.1 Morphology of hADMSCs of passage 6(× 40)

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 第6 代細(xì)胞接種后,1 d 后貼壁,3 d 內(nèi)緩慢生長(zhǎng),3 ～7 d 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第7 ～9 天細(xì)胞達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期,見圖2。

圖2 第6 代hADMSCs 的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of hADMSCs of passage 6

2.3 細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,MSCs 特異性標(biāo)志物 CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 的陽(yáng)性率分別為(99.48 ± 0.73)%、(98.29 ±0.64)%、(98.12 ± 1.24)%、(97.74 ± 1.87)%和(98.97 ± 1.39)%,造血干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD34、CD45 的陰性率分別為(99.42 ± 0.43)%和(99.72 ±0.44)%,見圖 3。Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的 MSCs 特異性標(biāo)志物 CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 的陽(yáng)性率分別為(99.84±0.07)%、(98.27±1.22)%、(96.90±1.94)%、(97.18 ± 1.45)%和(96.87 ± 2.12)%,造血干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD34、CD45 的陰性率分別為(99.03 ± 0.82)%和(99.21 ± 0.76)%；LPS 誘導(dǎo)的 MSCs 特異性標(biāo)志物 CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 的陽(yáng)性率分別為(99.90 ± 0.10)%、(98.49 ±1.20)%、(97.68 ± 1.37)%、(95.52 ± 1.11)%和(8.25 ± 0.93)%,造血干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD34、CD45 的陰性率分別為(99.47 ± 0.55)%和(99.48 ±0.29)%。與對(duì)照組細(xì)胞表面標(biāo)志相比,經(jīng)Poly(I ∶C)和LPS 刺激的hADMSCs 表面典型標(biāo)志也未受到Poly(I ∶C)和LPS 的影響。見圖 4 和圖 5。

2.4 hADMSCs 的分化能力 成骨誘導(dǎo)3 周后,茜素紅染色后鏡下可觀察到深褐色鈣沉積,見圖6B；成脂誘導(dǎo)第19 天,油紅O 染色后鏡下可見脂滴形成,見圖6F。經(jīng)LPS 和Poly(I ∶C)刺激的hADMSCs 成骨誘導(dǎo)后形成的深褐色鈣結(jié)節(jié)明顯比未經(jīng)刺激的hADMSCs 多,表明 LPS 和 Poly(I ∶C)對(duì) hADMSCs 成骨分化能力起促進(jìn)作用,且LPS 對(duì)hADMSCs 的成骨分化誘導(dǎo)促進(jìn)作用強(qiáng)于Poly(I ∶C),見圖6C 和6D。LPS 和Poly(I ∶C)刺激并不影響 hADMSCs 的體外成脂分化,形成的脂滴無明顯差異,見圖6G 和6H。

圖3 流式細(xì)胞儀分析hADMSCs 表面標(biāo)志Fig.3 Flow cytometry of surface markers of hADMSCs

圖4 Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的hADMSCs 的細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定Fig.4 Identification of surface markers of hADMSCs pre-activated with Poly(I ∶C)

圖5 LPS 誘導(dǎo)的hADMSCs 的細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定Fig.5 Identification of surface markers of hADMSCs pre-activated with LPS

圖6 hADMSCs 分化能力的顯微鏡觀察Fig.6 Microscopy of differentiation ability of hADMSCs

2.5 Poly(I ∶C)或LPS誘導(dǎo)后的hADMSCs分泌IFNβ的含量 ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照組、5 μg ／mL Poly(I ∶C)誘導(dǎo)組、25 μg／mL Poly(I ∶C)誘導(dǎo)組、0.1 mg／mL LPS 誘導(dǎo)組和 0.5 mg ／ mL LPS 誘導(dǎo)組 hADMSCs 分泌的 IFNβ 濃度分別為(175.91 ± 15.84)、(442.65 ±36.42)、(515.40 ± 71.66)、(163.21 ± 31.68)和(294.46 ± 73.35)pg ／ mL。經(jīng) Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的hADMSCs 分泌的IFNβ 濃度明顯高于對(duì)照組(F =18.87,P 分別為 0.002 8 和 0.000 4)。LPS 濃度為0.1 mg ／mL 時(shí),IFNβ 表達(dá)量不高,濃度達(dá) 0.5 mg ／ mL時(shí),才分泌一定量的IFNβ(F = 18.87,P = 0.047 8)。由于低濃度的LPS 誘導(dǎo)hADMSCs IFNβ 表達(dá)量不高,且高劑量的LPS 會(huì)對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出一定程度的損傷,因此,選擇Poly(I ∶C)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.6 Poly(I ∶C)預(yù)處理的 hADMSCs TRAIL 的表達(dá)Western blot 分析顯示,Poly(I ∶C)預(yù)處理促進(jìn)了hADMSCs 表達(dá) TRAIL,見圖 7。

圖 7 Western blot 分析 TRAIL 在 Poly(I ∶C)預(yù)處理的hADMSCs 中的表達(dá)Fig.7 Western blotting of TRAIL expression in hADMSCs pre-activated with Poly(I ∶C)

2.7 Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的 hADMSCs 與 H460 細(xì)胞共培養(yǎng)后靶細(xì)胞的活性 CCK8 法檢測(cè)結(jié)果顯示,hADMSCs在適宜濃度的Poly(I ∶C)誘導(dǎo)下,能夠降低靶細(xì)胞的活性,經(jīng) 5 和 25 μg ／ mL Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的靶細(xì)胞活性相對(duì)最低,且當(dāng) hADMSCs ∶H460 比例為 1 ∶2 時(shí),Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的 hADMSCs 對(duì) H460 細(xì)胞的抑制效果最佳(F = 5.924,P 分別為0.037 2 和0.049 8),見圖8。鏡下更直觀地觀察到經(jīng)5 和25 μg ／ mL Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的 hADMSCs 對(duì) H460-EGFP 細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性,能夠顯著抑制H460-EGFP 的生長(zhǎng)(F =12.5,P 均 ＜ 0.000 1),見圖 9 和圖 10。

圖8 Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的hADMSCs 與H460 細(xì)胞以不同比例共培養(yǎng)Fig.8 Co-culture of hADMSCs pre-activated with Poly(I ∶C)with H460 cells at various ratios

圖 9 Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的 hADMSCs 與 H460-EGFP 按 1 ∶2比例共培養(yǎng)后的顯微鏡觀察(× 40)Fig.9 Microscopy of hADMSCs pre-activated with Poly(I ∶C)co-cultured with H460-EGFP at a ratios of 1 ∶2(× 40)

圖 10 Poly(I ∶C)誘導(dǎo)的 hADMSCs 與 H460-EGFP 按 1 ∶2比例共培養(yǎng)后占對(duì)照組百分比Fig.10 Proportion of target cells to those in control group afte co-culture of Poly(I ∶C)pre-treated hADMSCs and H460-EGFP at a ratio of 1 ∶2

3 討 論

MSCs 的來源多種多樣,可從骨髓、脂肪、嗅黏膜、滑膜、角膜基質(zhì)等組織以及臍帶血、胎盤、羊水等分離出MSCs［8-10］。目前臨床使用最多的仍是骨髓來源的MSCs,但骨髓MSCs 取材不易,取材時(shí)不僅會(huì)對(duì)供者造成創(chuàng)傷,還易由于受供體年齡老化的影響,對(duì)MSCs 的數(shù)目以及后續(xù)的增殖分化造成一定的影響,這使得骨髓MSCs 在臨床應(yīng)用方面受到一定的限制。而hADMSCs 不存在上述限制,其來源廣泛,易于取材,對(duì)供者的損傷少,還可通過收集抽脂手術(shù)中要遺棄的脂肪組織懸液來提取,易大量獲取,又避免了倫理問題。本研究中制備的hADMSCs 表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC,且陽(yáng)性率 ≥ 95%,不表達(dá)CD34、CD45,該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［11-14］。提取的hADMSCs 能夠在體外穩(wěn)定擴(kuò)增,傳代15 代之內(nèi)未見明顯變化,還具有體外多向誘導(dǎo)分化的能力。

已知MSC 能表達(dá)TLR,而TLR 作為固有免疫病原模式識(shí)別受體,可從不同的識(shí)別途徑使多種免疫細(xì)胞活化,進(jìn)而啟動(dòng)非特異性免疫應(yīng)答和引起適應(yīng)性免疫應(yīng)答［15］。Poly(I ∶C)和 LPS 分別作為 TLR3、TLR4 的重要激動(dòng)劑通過與TLR3、TLR4 結(jié)合發(fā)揮作用,能夠啟動(dòng)機(jī)體的固有免疫。本研究用Poly(I ∶C)和LPS 對(duì)hADMSCs 刺激后進(jìn)行成骨、成脂分化誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)它們對(duì)MSCs 成骨分化具有一定的促進(jìn)作用,但對(duì)于成脂分化卻未見明顯作用,這與部分文獻(xiàn)的報(bào)道相符合［16］。而經(jīng) Poly(I ∶C)或 LPS 刺激后的 MSCs在流式表面標(biāo)志鑒定中也無明顯改變。

在病理?xiàng)l件下,損傷的組織或凋亡的細(xì)胞會(huì)釋放包括細(xì)胞內(nèi)分子,如高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1)和熱休克蛋白(heat-shock proteins,HSP),自身 DNA 和 RNA 等 DAMPs,而這些內(nèi)源性的DAMPs 很可能激活TLRs,從而引起TLR通路的活化,進(jìn)而引發(fā)抗腫瘤效應(yīng)［1］。本實(shí)驗(yàn)選取TLR3、TLR4 的配體 Poly(I ∶C)、LPS 模擬凋亡細(xì)胞釋放的DAMPs 中的自身RNA、HSP 等信號(hào)分子,驗(yàn)證DAMPs 是否介導(dǎo)了凋亡細(xì)胞上調(diào)MSCs 中TRAIL的表達(dá)這一過程。本實(shí)驗(yàn)證明,經(jīng)適宜濃度的Poly(I ∶C)、LPS 預(yù)活化的 MSCs 促進(jìn)了 IFN 的表達(dá),而IFN 能夠作用于hADMSCs,并促使其表達(dá)TRAIL。但由于LPS 僅在高劑量時(shí)表現(xiàn)出促進(jìn)作用,而高劑量的LPS 會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷［17］,因此,僅用 Poly(I ∶C)進(jìn)行后續(xù)Western blot 和共培養(yǎng)試驗(yàn)。Western blot 分析表明,經(jīng)Poly(I ∶C)預(yù)活化后的MSCs 顯著表達(dá)TRAIL,而TRAIL 能快速、大量誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,降低腫瘤細(xì)胞增殖。表明凋亡細(xì)胞中釋放的DAMPS很可能作為內(nèi)源性配體與TLR 相結(jié)合,并激活相關(guān)信號(hào)通路,從而促進(jìn)MSCs 表達(dá)TRAIL 分子,繼而由TRAIL 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此,Poly(I ∶C)作為一個(gè)IFNs 誘導(dǎo)劑,可激活MSCs 的TLR 分子通路,促進(jìn)其表達(dá)IFNs,繼而通過旁分泌形式進(jìn)一步誘導(dǎo)MSCs 表達(dá)TRAIL,來特異性激活MSCs 的抗腫瘤作用［6］。通過局部的DAMPs 或外部TLR 配體激活MSCs 的TLR 通路可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞死亡,且TLR 通路的活化而導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞因子(IL-6,IL-8)和趨化因子(CCL2,CXCL10)基因表達(dá)上調(diào)可能介導(dǎo)了MSCs 發(fā)揮其免疫細(xì)胞趨化性,使其對(duì)其附近的細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而在體內(nèi)差異性募集和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)［18］。

綜上所述,本研究成功分離、培養(yǎng)了hADMSCs,并證明在體外經(jīng)低濃度的Poly(I ∶C)或高濃度的LPS預(yù)刺激后的hADMSCs 能夠表達(dá)IFN,Poly(I ∶C)預(yù)活化的MSCs 能夠表達(dá)TRAIL 進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,為進(jìn)一步探索DAMPs 細(xì)胞外修飾的MSCs應(yīng)用于抗腫瘤策略奠定了基礎(chǔ)。