人甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗的穩(wěn)定性

段鵬，石瑋，周欣，許文婷，柳偉君，楊月蓮，王石磊

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司,上海200051

截至 2018 年 9 月,WHO 共報(bào)道了 1 567 例甲型H7N9 流感病毒感染確診病例,致死率高達(dá)40%,對(duì)人類的健康造成重大威脅［1-2］。甲型H7N9 流感病毒是一種源自鳥類的禽流感病毒毒株基因重配的新型病毒,人類對(duì)其無特異性免疫力。目前,盡管磷酸奧司他韋和扎那米韋對(duì)該病毒感染有確切療效,但兩種藥物均需在感染后48 h 內(nèi)及時(shí)使用方可達(dá)到理想的治療效果,也不排除病毒會(huì)出現(xiàn)廣泛耐藥變異的可能［2］。疫苗接種是預(yù)防流感流行和病毒感染的有效方法［3］。有研究表明,添加佐劑的甲型H7N9流感病毒疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)H7N9 病毒較強(qiáng)的免疫反應(yīng)［4］。

疫苗的穩(wěn)定性對(duì)疫苗免疫程序的設(shè)計(jì)至關(guān)重要［5］,可通過一系列物理化學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估疫苗中抗原含量的變化情況［6］。流感病毒囊膜外層主要有血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)兩種抗原物質(zhì)［7-8］。研究表明,HA 是流感病毒的關(guān)鍵抗原之一,在流感病毒感染宿主細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用［9］,是流感疫苗中有效的免疫物質(zhì)［10-12］,因此,HA 含量是衡量疫苗效力的主要指標(biāo)。傳統(tǒng)檢測方法是單向免疫擴(kuò)散法,該方法基于瓊脂糖凝膠技術(shù),采用菌株特異性多克隆抗體試劑,通過與參考抗原標(biāo)準(zhǔn)的指定HA 值進(jìn)行比較,定量疫苗樣品中流感病毒HA 的含量［13-15］,該方法仍是HA 的含量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)［16］。本研究對(duì)采用 WHO 頒布的重組病毒疫苗株 A ／ Shanghai ／ 2 ／2013(NIBRG-267),以氫氧化鋁作為佐劑。制備的6批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗進(jìn)行加速熱穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 疫苗原液 甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗原液由上海生物制品研究所有限責(zé)任公司采用H7N9 原始毒株 A ／ Shanghai ／ 2 ／ 2013(NIBRG-267)制備,并經(jīng)滅活、純化、脫糖、除菌過濾。

1.2 主要試劑 H7N9 病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原(2013001)和標(biāo)準(zhǔn)抗血清(AB2013002)由中國食品藥品檢定研究院提供；瓊脂糖購自美國Invitrogen 公司；去污劑及Zwittergent 3-14 Detergent 購自德國Merk 公司。

1.3 疫苗的配制 分別以 33 和 66 μg ／ mL HA 含量為配置點(diǎn),將甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗原液輔以氫氧化鋁佐劑(鋁終濃度為0.5 mg ／ mL)配制成兩種規(guī)格的甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗。規(guī)格為 15 μg ／(0.5 mL·瓶)共 3 批,批號(hào)分別為 SS201404007、SS201404008、SS201404009,檢測標(biāo)準(zhǔn)為 26.4 ～ 39.6 μg ／ mL；規(guī)格為 30 μg ／(0.5 mL·瓶)共 3 批,批號(hào)分別為 SS2-01404010、SS201404011、SS201404012,檢測標(biāo)準(zhǔn)為 52.8 ～79.2 μg ／ mL。將制備的 6 批疫苗成品根據(jù)《中國藥典》三部(2010 年)［17］規(guī)定方法進(jìn)行鑒別試驗(yàn)、外觀、裝量、pH、鋁含量、無菌、異常毒性及細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測。同時(shí)將各批樣品及H7N9 病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原分別加入至裝有標(biāo)準(zhǔn)抗血清的瓊脂糖凝膠板上,孔徑為 4 mm,于 20 ～ 25 ℃擴(kuò)散20 h；干燥、染色、脫色后測量各孔形成的沉淀環(huán)直徑,以標(biāo)準(zhǔn)抗原形成的沉淀環(huán)直徑對(duì)其相對(duì)應(yīng)的抗原濃度進(jìn)行直線回歸,得到直線回歸方程,代入成品的沉淀環(huán)直徑,即獲得HA 含量。

1.4 疫苗穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.4.1 (37 ± 2)℃加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗置(37 ± 2)℃存放,分別于第 0、7、14、21、28、35 天,按 1.3 項(xiàng)方法檢測HA 含量,并計(jì)算HA 含量相對(duì)百分比。同時(shí)按《中國藥典》三部(2010 年)［17］規(guī)定方法進(jìn)行全項(xiàng)檢測。

1.4.2 (25 ± 2)℃加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗置(25 ± 2)℃存放,分別于保存 0、1、2、3、4 個(gè)月后,按 1.3 項(xiàng)方法檢測HA 含量,并計(jì)算HA 含量相對(duì)百分比。同時(shí)按《中國藥典》三部(2010 年)［17］規(guī)定方法進(jìn)行全項(xiàng)檢測。

1.4.3 (2 ～8)℃長期穩(wěn)定性試驗(yàn) 6 批甲型H7N9流感病毒全病毒滅活疫苗置2 ～8 ℃存放,分別于保存 0、3、6、9、12、15、18、21、24 個(gè)月后,按 1.3 項(xiàng)方法檢測HA 含量,并計(jì)算HA 含量相對(duì)百分比。同時(shí)于保存 0、6、12、18、24 個(gè)月取樣,按《中國藥典》三部(2010 年)［17］規(guī)定方法進(jìn)行全項(xiàng)檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,各溫度下不同批次成品疫苗HA 下降百分比差異的比較采用one way ANOVA 法,以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 疫苗的檢定 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗 HA 含量為 33.4 ～ 68.3 μg ／ mL,pH 均為7.4,鋁含量為 0.50 ～ 0.54 mg ／ mL,細(xì)菌內(nèi)毒素均低于20 EU ／ mL,見表1。鑒別試驗(yàn)、外觀檢查、裝量檢查、無菌檢查、異常毒性檢查均合格。

表1 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗的檢測Tab.1 Control tests on six batches of final products of inactivated whole virion H7N9 influenza A vaccine

2.2 疫苗穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.1 (37 ± 2)℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn) 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于(37 ± 2)℃放置35 d,HA 含量均有一定程度降低。SS201404007、SS201404008、SS201404009 批疫苗的 HA 含量分別下降了7.1、5.5、6.4 μg／mL,仍高于檢測下限 26.4 μg／mL；SS201404010、SS201404011、SS201404012 批疫苗的HA 含量分別下降了 8.1、7.4、8.7 μg ／mL,仍高于檢測下限52.8 μg ／ mL,見表2。隨著存放時(shí)間的延長,HA 含量呈略下降趨勢,存放35 d 后HA 含量下降幅度為10%～19%,規(guī)格為15 及30 μg(／0.5 mL·瓶)疫苗批間的HA 含量下降百分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F 分別為 2.225 0 和 0.590 5,P 分別為 0.142 5 和0.566 4),見圖1。疫苗的其他各項(xiàng)指標(biāo)均符合相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。表明疫苗于(37 ± 2)℃條件下至少可存放35 d。

2.2.2 (25 ± 2)℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn) SS201404007、SS201404008、SS201404009 批甲型 H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于(25 ± 2)℃存放4 個(gè)月,HA 含量分別為 32.6、31.8 和 32.3 μg ／ mL,均高于檢測下限 26.4 μg ／ mL；SS201404010、SS201404011、SS20-1404012 批存放 4 個(gè)月,HA 含量分別為 64.0、66.4和 64.0 μg ／ mL,也遠(yuǎn)高于檢測下限 52.8 μg ／ mL。見表3。隨著存放時(shí)間的延長,HA 含量呈略下降趨勢,其中SS201404007 和SS201404009 批疫苗存放1 個(gè)月時(shí)下降已較明顯,4 個(gè)月時(shí)下降約10%；SS201404008 和 SS201404012 批疫苗下降約4%；SS201404010 和SS201404011 批疫苗穩(wěn)定性較好,下降約 2%。規(guī)格為 15 及 30 μg ／(0.5 mL·瓶)疫苗批間的HA 含量下降百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F 分別為 2.378 0 和 0.898 4,P 分別為 0.135 0 和0.432 9),見圖2。疫苗的其他各項(xiàng)指標(biāo)均符合相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。表明6 批成品疫苗在(25 ± 2)℃條件下至少可存放4 個(gè)月。

2.2.3 (2 ～8)℃長期穩(wěn)定性試驗(yàn) 6 批甲型H7N9流感病毒全病毒滅活疫苗于2 ～8 ℃存放24 個(gè)月,規(guī)格為 15 和 30 μg ／(0.5 mL·瓶)疫苗的 HA 含量分別下降至 32.0 和 64.0 μg ／ mL,均在檢測標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi),見表4。隨著存放時(shí)間的延長,HA 含量呈略下降趨勢,其中SS201404007 和SS201404009 批疫苗下降幅度約15%,其他4 批疫苗下降幅度約5%,規(guī)格為 15 及 30 μg ／(0.5 mL·瓶)疫苗批間的 HA 含量下降百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F 分別為6.856 和3.843,P 均＜0.05),見圖3。疫苗的其他各項(xiàng)指標(biāo)均符合相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。表明該疫苗可在2 ～8 ℃環(huán)境中存放至少24 個(gè)月。

表 2 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于(37 ± 2)℃存放不同時(shí)間的HA 含量(μg ／ mL)Tab.2 HA content in six batches of inactivated whole virion H7N9 influenza A vaccine after storage at(37±2)℃for various days(μg／mL)

表 3 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于(25 ± 2)℃存放不同時(shí)間的HA 含量(μg ／ mL)Tab.3 HAcontentinsixbatchesofinactivatedwholevirionH7N9influenzaAvaccineafterstorageat(25±2)℃forvariousmonths(μg ／ mL)

表4 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于2 ～8 ℃存放不同時(shí)間的HA 含量(μg ／ mL)Tab.4 HA content in six batches of inactivated whole virion H7N9 influenza A vaccine after storage at 2 ～ 8 ℃ for various months(μg／mL)

圖1 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于(37 ±2)℃存放不同時(shí)間HA 含量相對(duì)百分比Fig.1 Relative percentage of HA content in six batches of inactivated whole virion H7N9 influenza A vaccine after storage at(37 ± 2)℃ for various days

圖2 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于(25 ±2)℃存放不同時(shí)間HA 含量相對(duì)百分比Fig.2 Relative percentage of HA content in six batches of inactivated whole virion H7N9 influenza A vaccine after storage at(25 ± 2)℃ for various months

圖 3 6 批甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗于2 ～8 ℃存放不同時(shí)間HA 含量相對(duì)百分比Fig.3 Relative percentage of HA content in six batches of inactivated whole virion H7N9 influenza A vaccine after storage at 2 ～ 8 ℃ for various months

3 討 論

疫苗接種是控制流感疫情和保障公眾健康的有效方法。自20 世紀(jì)40 年代流感疫苗上市后,不僅使接種人群得到了有效保護(hù),且限制了大流感的暴發(fā)［18］。目前上市的流感疫苗主要包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗、重組表達(dá)疫苗等。

徐康維等［19］用甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗和裂解疫苗免疫小鼠,結(jié)果顯示,裂解疫苗需要免疫2 次才能達(dá)到與全病毒滅活疫苗相同的效果。賈重來等［20］對(duì)含鋁佐劑和無鋁佐劑的甲型H7N9 流感病毒裂解疫苗穩(wěn)定性進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,含佐劑的裂解疫苗穩(wěn)定性要優(yōu)于無佐劑裂解疫苗。2015 年1 月,瑞士諾華公司采用雞胚生產(chǎn)的甲型H7N9 流感病毒滅活疫苗完成的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,未添加佐劑的滅活疫苗免疫2 次后的血清保護(hù)率僅為2%,而添加佐劑AS03 實(shí)驗(yàn)組的血清保護(hù)率為84%。因此,含佐劑的全病毒滅活疫苗在免疫原性和穩(wěn)定性方面更有優(yōu)勢,但全病毒滅活疫苗在接種過程中副反應(yīng)的發(fā)生率也較高,因此不適用于6 歲以下的兒童［21］,這也限制了全病毒滅活疫苗的適用人群。

疫苗的長期穩(wěn)定性試驗(yàn)是判定疫苗有效期的可靠依據(jù),加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)是預(yù)測疫苗在超出推薦儲(chǔ)存條件后質(zhì)量能否保持的一個(gè)重要特性［18］,可為疫苗在異常貯存溫度時(shí)的有效期提供依據(jù)［19］,并可確定試驗(yàn)疫苗在特定條件下隨時(shí)間變化的規(guī)律,為研究試驗(yàn)疫苗在包裝、運(yùn)輸及貯存的特定環(huán)境下的穩(wěn)定性提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。作為流感病毒的主要抗原之一的 HA,其含量至少達(dá) 12 μg ／ 0.5 mL 才能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體,HA 含量的穩(wěn)定性對(duì)疫苗的質(zhì)量至關(guān)重要［22］。

本研究對(duì)2 種規(guī)格共6 批次甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中,(37 ± 2)℃存放35 d 后,2 種規(guī)格6 批疫苗HA 含量下降幅度為10% ～19%,HA 含量檢測值均高于檢測下限值；于(25 ± 2)℃存放4 個(gè)月后,規(guī)格為 15 μg ／(0.5 mL·瓶)的 3 批疫苗 HA 含量分別為 32.6、31.8 和 32.3 μg ／ mL,均高于檢測下限26.4 μg ／mL,30 μg ／(0.5 mL·瓶)的 3 批疫苗 HA 含量分別為 64.0、66.4 和 64.0 μg ／ mL,也遠(yuǎn)高于檢測下限 52.8 μg ／mL；于 2 ～ 8 ℃存放 24 個(gè)月,規(guī)格為15 μg ／(0.5 mL·瓶)的 HA 含量保持在 32 μg ／ mL以上,其結(jié)果高于檢測下限26.4 μg ／ mL,規(guī)格為30 μg ／(0.5 mL·瓶)的 HA 含量維持在 63 μg ／ mL以上,也高于檢測下限52.8 μg ／ mL,表明疫苗在2 ～8 ℃條件下至少可存放24 個(gè)月。綜上所述,本研究中甲型H7N9 流感病毒全病毒滅活疫苗具有良好的穩(wěn)定性。