麻疹疫苗株Schwarz 反向遺傳系統(tǒng)的建立

陳宗香，張勇俠，高雅麗，康莊，羅心梅，叢聰，李立，劉蘭軍

成都生物制品研究所有限責(zé)任公司,四川成都610023

2019 年,菲律賓、中國(guó)香港、美國(guó)多州等多地暴發(fā)麻疹疫情；美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心網(wǎng)站顯示,未接種疫苗兒童的比例已翻倍,超10 萬嬰幼兒未接種任何疫苗［1］。由于麻疹具有極強(qiáng)的感染性,因此,接種麻疹疫苗是控制麻疹傳播最有效的方法。

麻疹病毒(measlesvirus,MV)屬副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus),基因組全長(zhǎng)為15 894 個(gè)核苷酸［2］。世界上廣泛使用麻疹減毒疫苗株的母本株是Edmonston 野毒株,如AIKC、Zagreb、Schwarz 及 Moraten 疫苗株［3］。Edmonston野毒株經(jīng)傳代適應(yīng),獲得麻疹減毒株Edmonston A及B。這兩種減毒株分別在雞胚細(xì)胞上繼續(xù)傳代及低溫傳代適應(yīng)獲得更為減毒的Schwarz 及Moraten疫苗株。研究表明,麻腮風(fēng)水痘四聯(lián)疫苗中,英國(guó)GSK 公司麻疹疫苗株Schwarz(MVSW)及美國(guó)默沙東公司的麻疹疫苗株Moraten 序列的核苷酸和蛋白質(zhì)序列完全一致［4］。目前,Schwarz ／ Moraten 疫苗株是世界范圍內(nèi)使用最廣泛的麻疹疫苗株［5］。

本研究利用反向遺傳系統(tǒng),將MVSW株全長(zhǎng)cDNA連接至載體pT7-MCS2,構(gòu)建MV 全長(zhǎng)質(zhì)粒pT7MVSW,將其與3 個(gè)輔助質(zhì)粒及表達(dá)T7RNA 聚合酶的質(zhì)粒(pT7-T7RNAP 及pCDIBP-T7RNAP)共電轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,拯救獲得rMVSW。旨在為進(jìn)一步開發(fā)以rMVSW為載體的新疫苗的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、疫苗株及質(zhì)粒 P141 代Vero 細(xì)胞、原代雞胚細(xì)胞(chick embryo cells,CEC)、麻疹滬191 疫苗株(MVS191)、質(zhì)粒 pT7-T7RNAP 及 pCDIBP-T7RNAP均由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司制備和保存；載體pT7-IRES His-CDNA 購(gòu)自日本TaKaRa 公司。

1.2 主要試劑 高純度病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自瑞士 Roche 公司；Phusion 高保真 DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB 公司；隨機(jī)引物及SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；pGEM-T 載體連接試劑盒及膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；瓊脂糖及DNA marker 購(gòu)自日本TaKaRa 公司；MEM 培養(yǎng)液及胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；電轉(zhuǎn)緩沖液購(gòu)自美國(guó)BTX 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)昆明小鼠30 只,雌性,體重15 ～20 g,3 ～4 周齡,由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(川)2016-126。

1.4 全長(zhǎng)質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 載體pT7-IRES His-C DNA 的改造 以pT7-IRES His-C DNA 載體為模板,pT7mk-IRES-NotⅠ［5′-AGCGGCCGCTGATGCGGTATTTTCTCCTTAC-3′(下劃線部分為NotⅠ酶切位點(diǎn))］及pT7-IRES-NheⅠ［5′-TAGCTAGCAAGCTTGGCGTAATCATG-3′(下 劃線部分為NheⅠ酶切位點(diǎn))］為引物,PCR 擴(kuò)增獲得載體骨架,膠回收PCR 片段。由蘇州金唯智生物科技有限公司合成限制性內(nèi)切酶多克隆位點(diǎn)NheⅠ-AscⅠ-SacⅡ-KasⅠ-BamHⅠ-SpeⅠ-KpnⅠ-NcoⅠ-NotⅠ核苷酸序列MCS2,MCS2 通過NheⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)與載體PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物連接,改造后的載體命名為pT7-MCS2。

1.4.2 全長(zhǎng)質(zhì)?？寺〉臉?gòu)建 參照麻疹毒株MVSW的基因組序列(GenBank:FJ211590.1),將MVSW全長(zhǎng) cDNA 序列 15 384 bp 分為 F1 ～ F7 共 7 個(gè)片段(由蘇州金唯智生物科技有限公司分段合成)。參考文獻(xiàn)［4］在F1 片段序列的5′端插入T7 啟動(dòng)子及錘頭核酸酶序列(hammerhead ribozyme,HamRz)。參考文獻(xiàn)［5］在F7 片段序列的3′端插入T7 終止子及丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRz),MVSW全長(zhǎng)cDNA 分段構(gòu)建示意圖見圖1。將基因片段F1 ～F7 分別克隆至載體pT7-MCS2 上,獲得pT7-MCS2-F1 ～pT7-MCS2-F7 共7 個(gè)重組質(zhì)粒。7 個(gè)重組質(zhì)粒依據(jù)酶切位點(diǎn)按順序拼接MVSW全長(zhǎng)cDNA。

構(gòu)建流程:將pT7-MCS2-F1 質(zhì)粒中F1 片段通過酶切位點(diǎn)AscⅠ-SacⅡ克隆至pT7-MCS2-F2 質(zhì)粒,獲得質(zhì)粒 pT7MVSW-F12；將 pT7-MCS2-F4 質(zhì)粒中 F4 片段通過酶切位點(diǎn)BamHⅠ-SpeⅠ克隆至pT7-MCS2-F3 質(zhì)粒,獲得質(zhì)粒 pT7MVSW-F34；將 pT7-MCS2-F5質(zhì)粒中F5 片段通過酶切位點(diǎn)SpeⅠ-KpnⅠ克隆至pT7-MCS2-F6,獲得質(zhì)粒pT7MVSW-F56；將pT7-MCS2-F7 質(zhì)粒中F7 片段通過酶切位點(diǎn)NcoⅠ-NotⅠ克隆至pT7-MCS2-F56 質(zhì)粒,獲得質(zhì)粒pT7MVSW-F567；將該質(zhì)粒中F567 片段通過酶切位點(diǎn)SpeⅠ-NotⅠ克隆至pT7MVSW-F34 質(zhì)粒,獲得質(zhì)粒pT7MVSW-F34567；將該質(zhì)粒中F34567 片段通過酶切位點(diǎn)KasⅠ-NotⅠ克隆至pT7MVSW-F12 質(zhì)粒,構(gòu)建質(zhì)粒pT7MVSW,用BamⅠ、NdeⅠ及SpeⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

圖1 MVSW 全長(zhǎng)分段構(gòu)建示意圖Fig.1 Fractional construction of full-length cDNA of MVSW

1.4.3 輔助質(zhì)粒的構(gòu)建 MVSW核蛋白 N 基因(SWN)經(jīng) NcoⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ3 個(gè)酶切位點(diǎn)分為2 段(1 ～ 67 及 68 ～ 1 578 bp),與 pT7-IRES His-C DNA 載體連接,構(gòu)建輔助質(zhì)粒pT7-SWN。MVSW磷蛋白 P 基因(SWP)經(jīng) NcoⅠ／ XbaⅠ雙酶切,克隆至pT7-IRES His-C DNA 載體,構(gòu)建輔助質(zhì)粒pT7-SWP。MVSW大蛋白 L 基因(SWL)經(jīng) NcoⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ3個(gè)酶切位點(diǎn)分為 2 段(1 ～ 300 及 301 ～ 6 251 bp),與pT7-IRES His-C DNA 載體連接,構(gòu)建輔助質(zhì)粒pT7-SWL。NcoⅠ／NotⅠ酶切鑒定輔助質(zhì)粒pT7-SWN、pT7-SWP 及 pT7-SWL。

1.5 病毒拯救 將 5 × 105個(gè) ／mL 的 P141 代 Vero 細(xì)胞用電轉(zhuǎn)緩沖液充分混勻懸浮,加入12 μg pT7-MVSW、8 μg pT7-SWN、4 μg pT7-SWP、1 μg pT7-SWL、2 μg pT7-T7RNAP 及 4 μg pCDIBP-T7RNAP 混勻?；旌衔镛D(zhuǎn)入直徑為2 mm 的BioRad 電轉(zhuǎn)杯,電轉(zhuǎn)波型為指數(shù)波,電壓140 V、電容950 μF 電擊1 次。電轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞移入T25 瓶中,補(bǔ)加5 mL MEM 培養(yǎng)基(含10%FBS),37 ℃,5%CO2培養(yǎng) 24 h 后換液,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)約80% ～90%,將感染細(xì)胞及上清混合物于-20 ～-30 ℃內(nèi)反復(fù)凍融3 次,收獲拯救病毒rMVSW。rMVSW接種單層P141 代 Vero 細(xì)胞,33 ℃培養(yǎng) 3 ～ 4 d 收獲 P2 代病毒,分別在Vero 及CEC 細(xì)胞上傳代培養(yǎng)(CEC 細(xì)胞代次從 P1 代起計(jì)),Vero 細(xì)胞培養(yǎng) 3 ～ 5 d 至CPE 達(dá)80%以上,CEC 細(xì)胞培養(yǎng) 5 ～ 7 d 至 CPE 達(dá) 80%以上。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶4 ℃放置約24 h 后,-70 ℃保存。

1.6 SWN 和 SNPR 基因 RT-PCR 擴(kuò)增 按 Roche高純度病毒RNA 取試劑盒說明書提取Vero 及CEC細(xì)胞培養(yǎng)的P2 代病毒rMVSW的基因組RNA,利用隨機(jī)引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板,用引物 MA2-S(5′-AGTAGGAGTGGAACTTGAAAACTCC-3′)和 MA2-R(5′-CAGTTTCAACATCAGAAGCCCTG-3′)擴(kuò)增 rMVSW部分 SWN 和 SNP 基因,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行T 克隆,挑選2 個(gè)陽(yáng)性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.7 病毒滴度的檢測(cè) 采用終點(diǎn)稀釋法檢測(cè)病毒滴度,Reed-Muench 法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染劑量(CCID50)。rMVSW在 P142 ～ 150 代 Vero 細(xì)胞上傳代培養(yǎng),取 P1 ～ 10 代病毒,于-20 ～ -30 ℃凍融 1 次,收集病毒液,用MEM 培養(yǎng)基(含2% FBS)進(jìn)行10倍系列稀釋,共8 個(gè)稀釋度,接種至96 孔板培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞中,100 μL ／ 孔,每個(gè)稀釋度接種 8 個(gè)孔,37 ℃,5% CO2培養(yǎng) 7 d 后判定。

1.8 病毒生長(zhǎng)曲線的繪制 將Vero 細(xì)胞中傳至P4代的rMVSW病毒液用MEM 培養(yǎng)基(含2% FBS)適當(dāng)稀釋,按MOI 為0.03 感染T225 瓶中Vero 細(xì)胞,采用吸附方式進(jìn)行接種,33 ℃吸附0.5 h；補(bǔ)加MEM 培養(yǎng)基(含2% FBS)至終體積為40 mL,33 ℃培養(yǎng)。于感染后 24、48、72、96、120、144 及 168 h 分別取培養(yǎng)液上清0.5 mL。采用終點(diǎn)稀釋法檢測(cè)病毒滴度。以時(shí)間為橫坐標(biāo),滴度為縱坐標(biāo),繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

1.9 免疫原性的檢測(cè)

1.9.1 小鼠免疫 將昆明小鼠隨機(jī)分為3 組,疫苗株 MVS19(1滴度 6.0 lgCCID50／ mL)組、rMVSW(滴度6.25 lgCCID50／ mL)組及 MEM 培養(yǎng)基(空白對(duì)照)組,每組10 只。小鼠經(jīng)腹腔免疫,1 mL ／ 只,免疫2次,間隔21 d。末次免疫14 d 后心臟穿刺采血,分離血清,56 ℃滅活30 min,檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)。

1.9.2 血清中和效價(jià)的測(cè)定 采用微量CPE抑制法。將疫苗株MVS191及病毒rMVSW稀釋至2×103CCID50／mL,待測(cè)血清進(jìn)行 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶40、1 ∶80、1 ∶160、1 ∶320 稀釋,接種 96 孔板,50 μL ／ 孔,每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔；待測(cè)血清分別與等劑量MVS191及rMVSW混合,37 ℃,5% CO2中和 1 h；每孔加入 100 μL Vero細(xì)胞(1 × 105個(gè) ／ mL),37 ℃,5% CO2培養(yǎng) 7 d；觀察CPE 情況。抑制50% CPE 的最高稀釋度為抗體中和效價(jià),以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 載體pT7-MCS2 的鑒定 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,載體pT7-MCS2 的BamHⅠ及NcoⅠ單酶切產(chǎn)物均可見3 000 bp 的單一條帶；SacⅡ／ SspⅠ雙酶切產(chǎn)物可見600 及2 400 bp 的條帶,大小均與預(yù)期相符,見圖2。

圖2 載體PT7-MCS2 的酶切鑒定Fig.2 Restriction map of vector pT7-MCS2

2.2 全長(zhǎng)質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒的酶切鑒定 BamHⅠ將全長(zhǎng)質(zhì)粒pT7MVSW酶切為3 個(gè)片段,大小分別為2 769、4 040 及 11 853 bp；NdeⅠ將全長(zhǎng)質(zhì)粒酶切成4 個(gè)片段,大小為 936、1 898、2 681 及 13 147 bp；SpeⅠ將全長(zhǎng)質(zhì)粒酶切成2 個(gè)片段,大小為5 802 及13 028 bp。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,各酶切條帶大小均與預(yù)期一致。見圖3。輔助質(zhì)粒pT7-SWN、pT7-SWP 及pT7-SWL 的雙酶切產(chǎn)物所得目的基因片段條帶數(shù)目及大小均與預(yù)期一致,見圖4。表明全長(zhǎng)質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒均構(gòu)建正確。

2.3 病毒rMVsw 病變特征 顯微鏡觀察顯示,病毒rMVSW與疫苗株MVS191在Vero 和CEC 細(xì)胞上均出現(xiàn)以腫脹為主的病變,部分相鄰細(xì)胞融合形成典型的合胞體型病變,且病變特征類似,見圖5。

圖3 全長(zhǎng)質(zhì)粒pT7MVSW 的酶切鑒定Fig.3 Restriction map of full-length plasmid pT7MVSW

圖 4 輔助質(zhì)粒 pT7-SWN、pT7-SWP 及 pT7-SWL 的雙酶切(NcoⅠ／ NotⅠ)鑒定Fig.4 Restriction map of helper plasmids pT7-SWN,pT7-SWP and pT7-SWL(NcoⅠ／ NotⅠ)

圖5 rMVSW感染Vero 及CEC 細(xì)胞的顯微鏡觀察(×100)Fig.5 Microscopy of Vero and CEC cells infected with rMVSW(× 100)

2.4 RT-PCR 產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,引物MA2-S 和MA2-R 擴(kuò)增產(chǎn)物可見1 230 bp的條帶,大小與預(yù)期一致,空白對(duì)照無條帶,見圖6。Vero 及CEC 中2 代病毒rMVSW擴(kuò)增片段序列測(cè)序結(jié)果與MVSW的理論序列一致,引物對(duì)MA2-S 和MA2-R 擴(kuò)增產(chǎn)物與 MVSW序列 1 120 ～ 2 350 bp 一致。

2.5 病毒滴度 P1代rMVSW的滴度低于4.5lgCCID50／mL,傳代后病毒滴度升高,P2 ～10 代病毒滴度穩(wěn)定在5.5 ～6.5 lgCCID50／ mL 之間,見圖 7。

圖6 重組病毒的RT-PCR 鑒定Fig.6 Identification of rMVSW by RT-PCR

圖 7 P1 ～ P10 代病毒 rMVSW 滴度Fig.7 Titers of rMVSW virus of passages 1 ～10

2.6 病毒生長(zhǎng)曲線 接種24 h 內(nèi),P4 代病毒rMVSW滴度較低,隨后病毒呈增殖狀態(tài),滴度持續(xù)上升,144 h 達(dá)最高值 7.5 lgCCID50／ mL,之后病毒滴度逐漸降低,見圖8。

圖8 P4 代rMVSW 的生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curve rMVSW of four passages

2.7 抗體中和效價(jià) 結(jié)果顯示,rMVSW組及疫苗株MVS191組免疫血清對(duì)病毒MVS191和rMVSW的中和抗體效價(jià)均大于320,MVS191組免疫血清可中和病毒rMVSW,見表1。表明病毒rMVSW與疫苗株MVS191的免疫原性相當(dāng)。

表1 rMVSW 株及疫苗株MVS191 免疫血清中和抗體滴度Tab.1 Neutralizing antibody titers of rMVsw and vaccine strain MVS191

3 討 論

人用疫苗必須保證產(chǎn)品的安全性及免疫原性,用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)必須避免潛在的病原體污染,而原代細(xì)胞基質(zhì)很難避免這種污染［6］。Vero 細(xì)胞作為可用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系,已被批準(zhǔn)用于多種病毒疫苗的生產(chǎn)［7］,如口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗、輪狀病毒減毒活疫苗及將黃病毒YFV17D 膜蛋白替換為乙型腦炎病毒SA14-14-2 株prM ／ E 蛋白的嵌合疫苗 Imojev［8-10］。

MVSW反向遺傳系統(tǒng)在Vero 細(xì)胞上電轉(zhuǎn)拯救麻疹病毒rMVSW株,首先利用Vero 細(xì)胞的RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子,驅(qū)動(dòng)pCDIBP-T7RNAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄,表達(dá)T7RNA 聚合酶；表達(dá)的T7 RNA 聚合酶進(jìn)一步與pT7-TRNAP 載體上T7 啟動(dòng)子結(jié)合驅(qū)動(dòng)T7RNA 聚合酶表達(dá),利用兩種表達(dá)T7RNA 聚合酶的質(zhì)粒放大T7 RNA 聚合酶的表達(dá),使細(xì)胞內(nèi)的T7 RNA 聚合酶快速累積,利于全長(zhǎng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄及3個(gè)輔助質(zhì)粒的表達(dá),提高病毒拯救效率。

國(guó)產(chǎn)麻疹-流行性腮腺炎-風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗(measles,mumps,and rubella vaccine,MMR)中麻疹疫苗以減毒活疫苗株MVS191為毒種,國(guó)外MMR 疫苗中麻疹疫苗以減毒活疫苗株Schwarz ／ Moraten 為毒種。研究表明,國(guó)產(chǎn)MMR 組與GSK MMR 組接種12 月齡兒童麻疹抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均大于95%［11］。本實(shí)驗(yàn)將拯救病毒rMVSW及疫苗株MVS191分別免疫小鼠,可誘導(dǎo)抗病毒MVS191和rMVSW的中和抗體,且誘導(dǎo)抗體對(duì)于MVS191及rMVSW均有交叉中和能力,表明拯救病毒rMVSW與MVS191株相比免疫原性相當(dāng)。

本研究中,MVSW在Vero 細(xì)胞里完成病毒拯救及增殖,病變符合麻疹病毒的典型特征,成功建立了病毒rMVSW的反向遺傳系統(tǒng)。該反向遺傳系統(tǒng)中拯救、培養(yǎng)病毒用基質(zhì)Vero 細(xì)胞符合疫苗生產(chǎn)法規(guī),在病毒基因水平及Vero 細(xì)胞穩(wěn)定傳代上證實(shí)了拯救病毒rMVSW株具有良好的遺傳穩(wěn)定性,其免疫原性與國(guó)產(chǎn)毒株MVS191相當(dāng),具有作為疫苗生產(chǎn)用毒種的潛力。