腸道病毒71 型全病毒滅活疫苗(C4 亞型)的交叉中和特性

劉佩，卞蓮蓮，霍雅倩，陳磊，劉思遠(yuǎn)，毛群穎，吳星，高帆，梁爭(zhēng)論

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京102629；2.北京民海生物科技有限公司,北京102629

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一種常見(jiàn)于5 歲以下嬰幼兒的傳染性疾?。?］,少數(shù)患兒可并發(fā)病毒性腦炎、腦干腦炎、肺水腫和急性弛緩性麻痹等重癥,甚至導(dǎo)致死亡［2］。腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是導(dǎo)致重癥HFMD 的主要病原體,90%以上的HFMD 死亡病例由EV71 所致［3］。EV71 僅有1 個(gè)血清型,按VP1 核苷酸序列差異可分為A、B 和C 3 個(gè)基因型,其中B 和C 基因型可進(jìn)一步分為 B0［4］、B1 ～ B5 和 C1 ～ C5［5］共 11 個(gè)基因亞型。EV71 在全球均有流行,研究顯示,自2005年后,亞太地區(qū)主要流行株為不同的B 和C 亞型,我國(guó)大陸主要流行株為C4 亞型［6］。目前,臨床尚無(wú)針對(duì)EV71 感染的特異性治療藥物,注射疫苗成為控制EV71 引起HFMD 的主要手段。

目前研發(fā)的EV71 疫苗均由單一基因亞型疫苗株制備(如 B3,B4 和 C4 亞型)［7-10］。2015 — 2016 年,中國(guó)大陸地區(qū)3 家企業(yè)研發(fā)的EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)相繼獲批上市［10］,至今已批簽發(fā)約4 640 萬(wàn)人份。我國(guó)EV71 疫苗對(duì)全球范圍流行的其他基因型或亞型的交叉中和能力是該疫苗走向國(guó)際市場(chǎng)的基礎(chǔ),成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)［11］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,C4 亞型疫苗對(duì) B4、B5、C2、C4 和 C5 株具有良好的交叉中和能力［6,12］。為進(jìn)一步了解該疫苗的交叉保護(hù)特性,本研究采用 B0 ～ B4、C1、C2、C4 和C5 株病毒檢測(cè)免疫EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)嬰幼兒臨床血清樣本的中和效價(jià),以期為EV71 疫苗應(yīng)用于其他EV71 流行國(guó)家和地區(qū)的疫情防控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣本 選擇2018 年江蘇省5 歲以下嬰幼兒免疫 EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)后,C4 亞型中和抗體為陽(yáng)性(免疫前為陰性)的血清樣本,共46 份。

1.2 細(xì)胞及病毒 人橫紋肌肉瘤(rhabdomyoma,RD)細(xì)胞及 C4 亞型 EV71 毒株(EV71 標(biāo)準(zhǔn)病毒株［13］)由中國(guó)食品藥品檢定研究院保存；B0 ～B4、C1、C2和C5 亞型EV71 毒株由英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)提供。毒株信息見(jiàn)表1。

表1 EV71 毒株相關(guān)信息Tab.1 Information of EV71 strains

1.3 主要試劑 MEM 培養(yǎng)基(貨號(hào):05900)購(gòu)自日本日水制藥株式會(huì)社；胎牛血清(貨號(hào):10099-141C)及胰蛋白酶(貨號(hào):25200-072)均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；青-鏈霉素(貨號(hào):CPS101.02)及L-谷氨酰胺(貨號(hào):25030-081)購(gòu)自澳大利亞Cellmax 公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將 RD 細(xì)胞懸液按 1 ∶3 ～ 1 ∶6 的傳代比例進(jìn)行傳代培養(yǎng),用10%完全培養(yǎng)基于37 ℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至致密單層時(shí),用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 EV71 中和抗體的檢測(cè) 采用微量細(xì)胞病變法。將血清樣本按1 ∶8 稀釋,56 ℃滅活30 min；以稀釋后的待測(cè)血清作為起始濃度,在96 孔板中進(jìn)行2 倍系列稀釋至 1 ∶16 384；將 B0 ～ B4、C1、C2、C4 和 C5 亞型EV71 加入 96 孔板,100 TCID50／ 孔,37 ℃中和 2 h；加入 RD 細(xì)胞懸液,(1 ～ 1.5)× 105個(gè) ／(mL·孔),輕拍混勻,35 ℃培養(yǎng)7 d。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),以抑制50%細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為血清中和效價(jià),血清中和效價(jià)≥8 判為陽(yáng)性,＜8 判為陰性(按4 計(jì)數(shù),參與計(jì)算),計(jì)算幾何平均滴度(geometric mean titers,GMTs)及其增長(zhǎng)倍數(shù)(fold increases in geometric mean titers,GMFIs),并評(píng)價(jià) B0 ～ B4、C1、C2、C5 亞型與 C4亞型檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性(R2)。

2 結(jié) 果

2.1 血清樣本各基因亞型EV71 中和抗體的水平各血清樣本不同基因亞型EV71 抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%；中和抗體GMTs 范圍為288.9 ～871.3,GMFIs為72.2 ～217.8,不同亞型間GMTs 和GMFIs 的倍數(shù)差均在3倍以內(nèi)。見(jiàn)表2。

表2 不同基因亞型EV71 抗體的檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Determination results of antibodies in EV71 vaccine of various subgenotypes

2.2 各亞型EV71 與C4 亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株中和抗體檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性 B0 ～ B4、C1、C2 和 C5 亞型 EV71與C4 亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株中和抗體結(jié)果均呈良好相關(guān)性,R2分別為 0.652 8、0.618 4、0.639 1、0.719 5、0.689 1、0.669 3、0.726 4 和 0.697 4,見(jiàn)圖 1。

圖1 不同亞型EV71 毒株與C4 亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株中和抗體水平的相關(guān)性Fig.1 Relationship of neutralizing antibody levels against EV71 strains of various subgenotypes to that of standard straim of subgenotype C4

3 討 論

EV71 為RNA 病毒,其3D 聚合酶屬于低保真度的RNA 依賴性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP),缺乏校對(duì)修復(fù)相關(guān)活性［14］,因此其基因組突變率較高,EV71 與其他腸道病毒(enterovirus,EV)基因組的突變和重組易導(dǎo)致新的流行株出現(xiàn)。A 基因型(BrCr 株)于1970 年在美國(guó)加利福尼亞州首次成功分離；B0 基因型出現(xiàn)于60 年代,并與 A 基因型一起流行［4］。1997 年前,歐美HFMD 主要呈 B1、B2、C1 和 C2 亞型的小范圍流行；1997 年后,亞太地區(qū)發(fā)生多起HFMD 暴發(fā),呈B3 ～ B5 及 C3 ～ C5 等多種基因型 EV71 流行態(tài)勢(shì)［15-25］,中國(guó)流行株為C4 亞型毒株。2008 年起,C4基因亞型EV71 引起的HFMD 在國(guó)內(nèi)開(kāi)始流行［26］。

2015 年12 月,中國(guó)研發(fā)的EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)獲批上市,對(duì) C4 亞型 EV71 所致 HFMD保護(hù)率達(dá) 90%以上［27-29］。JIANG 等［30］通過(guò)檢測(cè)陰性設(shè)計(jì)法評(píng)估2017 年1 月1 日 — 2018 年 12 月 31日EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)在廣西12 歲以下兒童重癥HFMD 病例中的有效性,結(jié)果表明,接種1 針和2 針疫苗的兒童校正疫苗有效性分別為81.4%和88.3%。WANG 等［31］采用同樣方法對(duì)北京2 184例5 歲以下HFMD 病例開(kāi)展研究,結(jié)果顯示,對(duì)于重癥病例,2 針免疫后疫苗有效性為100%；對(duì)于輕癥病例,1 針和2 針校正疫苗有效性分別為 69.8%和83.7%。上述結(jié)果表明,EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)具有良好的保護(hù)效果。EV71 疫苗對(duì)不同亞型毒株的交叉保護(hù)能力是影響疫苗免疫效果的關(guān)鍵要素,2016 年中國(guó)食品藥品檢定研究院頒布的《EV71 疫苗質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)技術(shù)要點(diǎn)》［32］和2020 年WHO 頒布的《WHO 滅活疫苗EV71 疫苗規(guī)程》均明確指出,非臨床和臨床評(píng)價(jià)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注疫苗對(duì)不同毒株的交叉保護(hù)能力［33］。

不同亞型毒株制備的EV71 全病毒滅活疫苗具有不同的交叉中和能力。CHOU 等［34］對(duì)B4 亞型疫苗Ⅰ期臨床血清與 B1、B4、B5、C2、C4a 和 C4b 株進(jìn)行交叉中和研究,結(jié)果顯示,免疫血清對(duì)B1、B5 和C4a 具有較強(qiáng)的中和作用,對(duì)C4b 中和能力較弱,對(duì)C2 無(wú)交叉中和作用,提示該疫苗對(duì)C2 株可能不易發(fā)生交叉中和。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)免疫血清對(duì) B0 ～ B4、C1、C2、C4 和C5 9 個(gè)亞型毒株均具有較好的中和活性,且B0 ～B4、C1、C2 和C5 毒株中和效價(jià)檢測(cè)結(jié)果與C4 具有良好的相關(guān)性。

綜上所述,我國(guó)生產(chǎn)的EV71 全病毒滅活疫苗(C4 亞型)對(duì)其他國(guó)家或地區(qū)流行的B 和C 基因亞型的EV71 毒株均具有良好的交叉中和能力,本實(shí)驗(yàn)為我國(guó)生產(chǎn)的EV71 疫苗在其他國(guó)家或地區(qū)的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。