SLE患兒外周血自噬基因的表達(dá)與疾病發(fā)生及活動(dòng)水平的關(guān)系

劉志明，郜苗苗，邵麗麗，朱翠敏，劉秀芬

(滄州市中心醫(yī)院兒科，河北 滄州 061000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)是常見的自身免疫性疾病之一，臨床表現(xiàn)為皮膚、關(guān)節(jié)、腎臟、心血管等多組織器官受累，重癥者若不及時(shí)有效治療，可危及生命[1]。既往研究[2-3]表明，過度自噬可導(dǎo)致細(xì)胞的長(zhǎng)期存活，造成自體成分被作為抗原遞呈，并在自身免疫性疾病的發(fā)生與進(jìn)展中扮演重要角色。SLE患者及小鼠模型中均存在明顯的自噬異常[4]，而自噬活動(dòng)改變的機(jī)制目前尚未完全明了，自噬基因Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62等在SLE中表達(dá)水平及其意義亦不完全清楚[5]。本研究擬通過檢測(cè)SLE患兒外周血單核細(xì)胞(peripheral blood monocytes，PBMC)中Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62 表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量的變化，探討其在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用，以期尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年8月滄州市中心醫(yī)院確診的50例SLE患兒為研究對(duì)象，根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)性指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]分為SLE-1組(初診、未經(jīng)治療且SLEDAI≥10分)和SLE-2組(經(jīng)治療且SLEDAI<10分)，每組各25例；另選15名健康兒童為正常對(duì)照組(NC組)。本研究本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家長(zhǎng)知情同意。三組兒童性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 自身抗體水平檢測(cè) 真空管采集患者靜脈血，離心取上清液。間接免疫熒光法檢測(cè)血清抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)，試劑購(gòu)于美國(guó)Inova公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)抗ds-DNA抗體，試劑購(gòu)于愛爾蘭TrinityBiotech Plc公司；免疫印跡法檢測(cè)抗可提取性核抗原抗體，包括抗RNP抗體、抗Sm抗體、抗SS-A抗體、抗SS-B抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體，試劑購(gòu)于德國(guó)歐蒙公司。操作及結(jié)果判定按試劑說明書進(jìn)行。

1.2.2 血液相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用血細(xì)胞分析儀及全自動(dòng)生化分析儀(國(guó)羅氏診斷有限公司)檢測(cè)血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、肌酐(Sre)、血沉(ESR)等；免疫比濁法檢測(cè)補(bǔ)體C3、C4水平，試劑盒購(gòu)自北京中生公司；采用羅氏 Cobas c701型全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑檢測(cè)免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平。

1.2.3 Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62表達(dá)水平檢測(cè) 采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，步驟如下：(1)密度梯度離心法提取PBMC。采集晨起空腹外周靜脈血5 mL，以Hanks液(TIANDZ公司)等體積稀釋，室溫吹打混勻，備用。取2 mL圓底試管，先加入淋巴細(xì)胞分離液于底部，再沿管壁加入稀釋血液，保持分層不混勻。20 ℃，2 000 rpm離心20 min，此時(shí)圓底試管中分為4層，白色細(xì)胞層即為PBMC，吸取細(xì)胞并懸浮于Hanks液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)總RNA的提取與鑒定。采用Trizol型RNA試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司)提取，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行；Alpha1506型分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司)檢驗(yàn)RNA純度：變性凝膠電泳后，溴化乙錠染色，觀察28S及18S rRNA條帶的清晰度及強(qiáng)度比值，強(qiáng)度比值≈2∶1代表RNA完整性良好。(3)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。配置常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄體系(Catalog公司RT0411-01)，逆轉(zhuǎn)錄獲取模板cDNA，條件為55 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 s；配置PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增(引物序列見表2)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本檢測(cè)3次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平。

1.2.4 Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62蛋白表達(dá)量測(cè)定 采用 Western blotting 法，步驟如下：(1)蛋白提取與定量。全蛋白提取試劑盒(美國(guó)Gene Copoeia公司)提取PBMC的總蛋白，BCA法定量后，buffer緩沖液配制成1 μg/μL的蛋白溶液。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳與電轉(zhuǎn)印。配置電泳體系，以每孔10 μg蛋白用量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件：60 V預(yù)電泳30 min除去凝膠雜質(zhì)，調(diào)整至90 V電泳 70 min，電泳后蛋白按分子量大小分開，形成條帶，將電泳后的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜。(3)封閉與孵育。5%脫脂牛奶封閉90 min，PBST清洗3次，5 min/次。一抗孵育，兔抗人BECN1單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)、兔抗人ATG5單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)、兔抗人ATG7 單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)、兔抗人P62單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)的濃度分別為1∶2 000、1∶2 500、1∶1 800、1∶2 000，4 ℃ 過夜，PBST清洗3次，5 min/次；二抗(上海碧云天公司)37 ℃孵育90 min，濃度1∶2 500。(4)顯影與定量。ECL熒光顯色，暗室顯影，采用影像分析軟件Image J分析目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，目的蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。見表2。

表2 Beclin-1、ATG-5、ATG-7、p62及內(nèi)參基因GAPDH引物序列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 三組兒童血液相關(guān)指標(biāo)比較

SLE-1及SLE-2組C3、C4、PLT、Hb水平低于NC組(P<0.05)，且SLE-1組低于SLE-2組(P<0.05)；IgG、IgM、IgA、Sre、TG、ESR高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)；抗ANA抗體、抗ds-DNA抗體陽(yáng)性率高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)。見表3。

表3 三組兒童血液相關(guān)指標(biāo)比較

2.2 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62 mRNA表達(dá)水平比較

SLE-1組及SLE-2組Beclin-1、ATG-7及p62 mRNA表達(dá)水平高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)。見表4。

表4 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62蛋白表達(dá)水平對(duì)比

SLE-1組及SLE-2組Beclin-1、ATG-7及p62蛋白表達(dá)量高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 三組兒童Beclin-1、ATG-5、ATG-7及p62蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)的異常、B細(xì)胞過度激活產(chǎn)生自身抗體、免疫復(fù)合物的沉積是SLE主要的病理特點(diǎn)。本研究中，SLE組C3、C4水平低于NC組(P<0.05)，且SLE-1組低于SLE-2組(P<0.05)；IgG、IgA水平高于NC組(P<0.05)，且SLE-1組高于SLE-2組(P<0.05)，與既往研究[7]報(bào)道一致，提示抗體形成及補(bǔ)體參與了SLE的發(fā)生與發(fā)展。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性細(xì)胞降解途徑，在從酵母細(xì)胞到哺乳動(dòng)物不同生物間高度保守。自噬在細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)的成熟中扮演重要角色。過度自噬可導(dǎo)致細(xì)胞的長(zhǎng)期存活，引起內(nèi)含DNA/RNA聚合體的凋亡小體通過與TLR-7等結(jié)合激活免疫，將自體成分作為抗原遞呈，是SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的重要病理機(jī)制之一[2]。ATG-5是自噬執(zhí)行的重要分子，主要參與自噬小體成熟[8-9]。Beclin-1與酵母細(xì)胞ATG-6同源，是啟動(dòng)自噬的重要基因[10]和測(cè)定自噬水平的常用標(biāo)志物之一[11]。ATG-7位于自噬囊泡擴(kuò)張中LC3和Atg12兩個(gè)泛素樣系統(tǒng)的中心。p62與酵母細(xì)胞ATG-8同源，在蛋白聚集、泛素化底物的運(yùn)送及降解清除中發(fā)揮重要作用[9]。近年來，自噬影響SLE等自身免疫性疾病的機(jī)制是臨床研究的熱點(diǎn)之一[12-13]。

本研究結(jié)果顯示，SLE患兒PBMC中Beclin-1、ATG-7及p62基因及蛋白表達(dá)水平均高于健康兒童(P<0.05)，與既往研究[8,11]結(jié)論一致，說明SLE患兒存在自噬活躍度增加，自噬失衡；SLE-1組患兒Beclin-1、ATG-7及p62基因表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量高于SLE-2組(P<0.05)，提示Beclin-1、ATG-7及p62mRNA的表達(dá)不僅與SLE的發(fā)生有關(guān)，還與其活動(dòng)水平存在關(guān)聯(lián)，據(jù)此推斷，藥物治療可能是通過改變自噬水平而實(shí)現(xiàn)的；不同活動(dòng)度的SLE患兒ATG-5基因mRNA及其蛋白表達(dá)水平與健康童無(wú)明顯差異(P>0.05)。既往研究[8]發(fā)現(xiàn)，ATG-5基因rs6937876等至少5個(gè)單核普酸多態(tài)性(Single nucleic acid polymorphism，SNP)與SLE的易感性有關(guān)，對(duì)發(fā)展成SLE具有重要影響，但ATG-5基因與SLE發(fā)病及病情的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。本研究尚未對(duì)目的基因進(jìn)行細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以明確其在SLE自噬功能改變中的機(jī)制。而自噬合成的增加及分解受阻均可導(dǎo)致自噬動(dòng)態(tài)平衡打破、細(xì)胞自噬功能障礙，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SLE自噬水平增強(qiáng)，Beclin-1、ATG-7、P62 水平及蛋白量在治療后降低，自噬可能參與了SLE的發(fā)生與發(fā)展，可能是治療的新靶點(diǎn)。