運(yùn)動(dòng)通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路影響成長(zhǎng)期小鼠骨代謝

凌麗麗，李桂芳，王彪，趙學(xué)輝，劉會(huì)領(lǐng)，李建英，王新梅

(1.滄州市人民醫(yī)院新生兒科；2.滄州市公安局刑警支隊(duì)，河北 滄州 061000)

雄激素受體(androgen receptor，AR)介導(dǎo)基因能夠通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等非基因途徑對(duì)蛋白的合成過(guò)程進(jìn)行調(diào)控[1-2]，MAPK信號(hào)通路屬于Ser/Thr蛋白激酶家族重要因子，通過(guò)適當(dāng)運(yùn)動(dòng)能夠?qū)APK信號(hào)通路激活，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶基因表達(dá)，提高機(jī)體的抗氧化能力，達(dá)到預(yù)防疾病及延緩衰老的目的[3-4]。p38為MAPK家族的成員之一，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、骨代謝等過(guò)程中均能發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5-6]。雄激素具有抑制骨骼肌萎縮、促進(jìn)骨骼肌肥大和肌肉力量的作用，可增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力[7-8]；而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是預(yù)防骨質(zhì)疏松的有效方式，青少年中長(zhǎng)期參加體育鍛煉的人群具有更長(zhǎng)、更粗壯的骨骼，且骨骼的質(zhì)量、形狀與其所處力學(xué)環(huán)境密切相關(guān)，通過(guò)適當(dāng)運(yùn)動(dòng)建立良好的力學(xué)環(huán)境能夠改善骨代謝[9-10]。本研究擬探討運(yùn)動(dòng)如何通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路影響成長(zhǎng)期小鼠骨代謝，為后期臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

40只8周齡C57/BL6雄性小鼠購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：scxk桂20190002)，體質(zhì)量為20～22 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為運(yùn)動(dòng)組和對(duì)照組，每組各20只，各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對(duì)照組進(jìn)行普通飼養(yǎng)，不給予任何干預(yù)。運(yùn)動(dòng)組第1周運(yùn)動(dòng)6 d，前3 d運(yùn)動(dòng)30 min/d，后3 d運(yùn)動(dòng)45 min/d；第2周～8周運(yùn)動(dòng)5 d/周，運(yùn)動(dòng)45 min/d，設(shè)定跑速為0.8 km/h，坡度-9°。

1.2 方法

1.2.1 生物材料 血清：最后一次訓(xùn)練結(jié)束后的第3天使用斷頭法處死各組小鼠，將眼球摘除后取眼眶血移入1.5 mL離心管內(nèi)，以5 000 rpm的速率離心10 min，取上層血清，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保留待測(cè)。右側(cè)脛骨和股骨：將小鼠骨骼表面的肌肉剝離，取出脛骨和股骨，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)將骨組織樣本清洗干凈，分裝在離心管內(nèi)，置于4 ℃冰箱內(nèi)保留待測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中因樣本量較大，且各組小鼠試驗(yàn)前均為健康小鼠，因此該實(shí)驗(yàn)中僅對(duì)右側(cè)脛骨和股骨進(jìn)行觀察。腦：處死小鼠后開顱取腦，在4 ℃下使用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋后切片。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 使用ELISA對(duì)血清鈣(serum calcium，Ca)、血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP/ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，STR-ACP)、骨鈣素(osteocalcin，BGP)、血清磷(phosphorus，P)水平進(jìn)行檢測(cè)。儀器為L(zhǎng)FF-LC-1781全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼生物有限公司)，試劑從邁瑞生物科技有限公司購(gòu)買(貨號(hào)：2020041113)，具有5年以上臨床經(jīng)驗(yàn)的專家嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。具體如下：(1)離心取上層血清；(2)在微定量板上吸附組蛋白體；(3)加上清液使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合；(4)加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合；(5)加酶的底物，測(cè)光吸收強(qiáng)度。

1.2.3 生物力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 使用微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(濟(jì)南方圓試驗(yàn)儀器有限公司；型號(hào)：WDW-50E/100E)對(duì)小鼠的右側(cè)股骨各生物力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，將股骨放置在兩個(gè)支撐點(diǎn)上，標(biāo)本寬度朝上且水平放置，將探頭下降，以2 mm/min的速度施壓，標(biāo)本斷裂后停止，依據(jù)壓力傳感器數(shù)據(jù)獲得相應(yīng)指標(biāo)數(shù)據(jù)，包括彈性載荷、最大載荷、破壞載荷、彈性撓度、最大撓度、破壞撓度、能量吸收和剛性系數(shù)。具體如下：(1)打開微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)主機(jī)電源、電腦，點(diǎn)擊桌面Smarttest軟件，打開專業(yè)測(cè)控軟件；(2)進(jìn)入拉力機(jī)操作界面，首先選擇所使用的試驗(yàn)方法，此時(shí)軟件右側(cè)將會(huì)顯示數(shù)據(jù)板欄目；(3)點(diǎn)擊新建按鈕，根據(jù)試樣的實(shí)際規(guī)格尺寸輸入到數(shù)據(jù)板里面，完成后關(guān)掉數(shù)據(jù)板；(4)調(diào)節(jié)衡量位置，將股骨放置在兩個(gè)支撐點(diǎn)上，標(biāo)本寬度朝上并水平放置；(5)清零試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確認(rèn)試樣無(wú)異常，點(diǎn)擊界面改到試驗(yàn)界面，以2 mm/min的速度施壓，標(biāo)本斷裂后停止；(6)各數(shù)據(jù)均實(shí)時(shí)顯示，可記錄或打印。

1.2.4 Western blot印跡檢測(cè) 對(duì)小鼠的血小板衍生生長(zhǎng)因子B(platelet derived growth factor，PDGFb)、c-fos蛋白、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1(extracellular regulated kinase protein，ERK-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP-2)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated mitogen-activated protein kinase，P-MAPK)蛋白表達(dá)水平及磷酸化p38(p-P38)、黑質(zhì)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)水平進(jìn)行檢測(cè)。(1)分離黑質(zhì)區(qū)(圖1)：小鼠快速斷頭處死，取出完整腦，將腦至于-80 ℃速凍5 min。取出速凍好的鼠腦，置于冰上，切取前囟(在剝離的鼠腦上，前囟和腹側(cè)的視交叉前緣處于同一垂直面上)后，3～4 mm的冠狀切面。在鼠腦切面上，黑質(zhì)腦區(qū)的顏色是與其它腦區(qū)顏色不同的，有比較清晰的界限，用鑷子或者其它工具挖取獲得。(2)使用Western blot印跡法對(duì)小鼠黑質(zhì)區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平進(jìn)行檢測(cè)。依據(jù)試劑盒(邁瑞生物科技有限公司購(gòu)買；貨號(hào)：2020061719)提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒(邁瑞生物科技有限公司購(gòu)買；貨號(hào)：2020082111)對(duì)裂解物的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，聚丙烯酰胺凝膠電泳，參照免疫印跡說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)膜等過(guò)程，p-P38、COX-2、caspase-3、PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK曝光顯影，重復(fù)3次。具體如下：(1)將蛋白電泳后的凝膠浸入電轉(zhuǎn)緩沖液中15 min。(2)將電轉(zhuǎn)膜(醋酸纖維素膜)先在甲醇中浸泡至完全濕潤(rùn)，然后再將膜浸入超純水中5 min，最后再將膜浸入電轉(zhuǎn)液中15 min。(3)濾紙先在電轉(zhuǎn)液中完全浸濕，然后將濾紙平鋪在電轉(zhuǎn)纖維上，在濾紙正上方平鋪凝膠，在凝膠正上方平鋪電轉(zhuǎn)膜，在電轉(zhuǎn)膜正上方平鋪濾紙，最后用玻棒趕氣泡。(4)100 V，電轉(zhuǎn)100 min。(5)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡于甲醇中5 min，最后將電轉(zhuǎn)膜浸泡于4 mL 10%的牛奶(2 g奶粉溶于20 mL超純水)中(5% BSA)，置于37 ℃搖床(75 rpm)封閉1.5 h(也可4 ℃封閉過(guò)夜)。(6)封閉1.5 h結(jié)束后，電轉(zhuǎn)膜用磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline+Tween-20，PBST)(1LPBS溶液+500 uL Tween-20)洗3次，每次10 min。(7)將電轉(zhuǎn)膜浸入一抗溶液中，置于37 ℃搖床，75 rpm，1.5 h(一抗溶液的制備：10 mL的10%脫脂牛奶或BSA溶于PBST中+5-10 uL一抗，即共稀釋了1 000～2 000倍，可根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)抗體稀釋倍數(shù))。(8)一抗溶液浸泡結(jié)束后，將電轉(zhuǎn)膜用PBST溶液洗3次，每次10 min。(9)將電轉(zhuǎn)膜浸入二抗溶液中，置于37 ℃搖床，75 rpm，1 h(二抗溶液的制備同一抗)。(10)二抗溶液浸泡結(jié)束后，將電轉(zhuǎn)膜用PBST溶液洗3次，每次10 min。然后，將膜浸泡于底物溶液中顯色，顯色結(jié)束后，用濾紙吸干膜上的水分，將膜置于凝膠成像儀中用白光拍照。滴加發(fā)光液凝膠成像儀采集圖像，計(jì)算蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值，以反映目的蛋白的表達(dá)。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組血清生化指標(biāo)水平比較

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組小鼠的Ca、AKP、ALP、STR-ACP、BGP水平均高于對(duì)照組，血清P水平低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 血清生化指標(biāo)水平比較

2.2 兩組右側(cè)股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較

微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組小鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 右側(cè)股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較

2.3 兩組PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白表達(dá)水平比較

Western blot印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組小鼠的PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白表達(dá)水平比較

2.4 兩組黑質(zhì)區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平比較

Western blot印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組小鼠的黑質(zhì)區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 黑質(zhì)區(qū)p-P38、COX-2、caspase-3水平比較

3 討論

Goodyear等[11]在1996年就運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞ERK1/2、p38、JNK信號(hào)分子的激活作用進(jìn)行了探究，近年來(lái)，骨骼肌中的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)問(wèn)題逐步成為研究的熱點(diǎn)，肌肉收縮與運(yùn)動(dòng)對(duì)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注[12-13]。謝學(xué)海等[14]發(fā)現(xiàn)，人體和正常大鼠耐力運(yùn)動(dòng)后，48 h骨骼肌p38蛋白活性與含量受影響。同時(shí)，陳彤丹等[15]也指出，在相同的相對(duì)強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)下，接受過(guò)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的患者骨骼肌p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有更強(qiáng)烈的反應(yīng)。

生長(zhǎng)發(fā)育期內(nèi)的骨量增加所達(dá)到的峰值大小，對(duì)于人群老年時(shí)期發(fā)生骨質(zhì)疏松有著重要作用。p38MAPK是含有360個(gè)氨基酸的絡(luò)氨酸磷酸化蛋白激酶，臨床中能夠激活p38的刺激較多，熱休克、蛋白質(zhì)合成抑制劑、高滲透壓環(huán)境等應(yīng)激刺激及脂多糖等均能激活p38通路[16]。此外，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與維生素D的缺乏密切相關(guān)，維生素D水平低下，膳食中鈣質(zhì)攝取量較低，長(zhǎng)時(shí)間會(huì)造成骨量丟失[17]。維生素D是免疫調(diào)節(jié)中的重要成分，其在免疫系統(tǒng)多種成分中可作為自分泌及旁分泌信號(hào)系統(tǒng)，免疫調(diào)節(jié)中需要消耗大量的維生素D[18]。

本研究顯示，運(yùn)動(dòng)組的各血清生化指標(biāo)、右側(cè)股骨生物力學(xué)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)觀察組小鼠的MAPK信號(hào)通路相關(guān)因子(PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK)、BMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量及p-P38、COX-2、caspase-3水平均優(yōu)于對(duì)照組。這可能是由于運(yùn)動(dòng)激活了p38分子，并刺激了其下游信號(hào)分子MAPKAPK2，將核底物直接磷酸化，增強(qiáng)了底物的活性。調(diào)控骨代謝的重要手段之一為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，其不僅能夠增加骨量，還能夠促進(jìn)骨形成代謝，適宜的運(yùn)動(dòng)刺激能夠有效促進(jìn)骨形成[18-19]。本研究中運(yùn)動(dòng)組大鼠通過(guò)運(yùn)動(dòng)改善了骨代謝，減少了對(duì)維生素D的消耗，原因可能為維生素D與鈣離子結(jié)合形成鈣維生素D復(fù)合物，對(duì)甲狀旁腺及細(xì)胞因子進(jìn)行了調(diào)控，減少了骨吸收量，降低了皮質(zhì)骨多孔的發(fā)生率，刺激骨鈣素、骨橋蛋白等骨基質(zhì)蛋白及骨生長(zhǎng)因子的生成，促進(jìn)骨微細(xì)損傷的修復(fù)和骨礦化，調(diào)節(jié)了骨重建，進(jìn)而改善了骨代謝[20]。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)能夠激活成長(zhǎng)期小鼠的p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，改善骨代謝，增加骨密度。