二甲雙胍通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖和凋亡的研究

王冬梅，馮永剛，姚鴻萍

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 西安 710061)

胃癌在全世界的患病及致死率較高，主要與患者術(shù)后腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移及再?gòu)?fù)發(fā)有關(guān)，因此尋找安全有效的藥物是目前臨床防治胃癌及改善其預(yù)后的研究焦點(diǎn)[1-3]。胃癌干細(xì)胞作為胃癌細(xì)胞抗化療、誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的根源，因此抑制胃癌干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡才是治療胃癌的關(guān)鍵[4]。Jung等[5]研究表明，人類表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)過表達(dá)可激活與胃癌干細(xì)胞相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，說明胃癌干細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物行為學(xué)機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活密切相關(guān)。二甲雙胍是臨床上常用于治療糖尿病的一線藥物，具有防止肝臟糖異生、提高骨骼肌葡萄糖攝取率的作用[6-7]。研究[8-12]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在抗腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞活性上具有重要價(jià)值。然而，關(guān)于二甲雙胍通過作用Wnt/β-catenin信號(hào)通路來影響胃癌干細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞株分離培養(yǎng)并鑒定，并通過不同劑量二甲雙胍分別處理，探究胃癌干細(xì)胞的增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株MKN-45 由武漢普諾賽生命科技有限公司提供；二甲雙胍由美國(guó)Sigma-Aldrich公司提供；CCK-8試劑盒由日本Dojindo公司提供；RPMI-1640完全培養(yǎng)基、CD44+磁珠由北京諾為生物技術(shù)有限公司提供；兔抗CD44購(gòu)自美國(guó)abcam公司；RNA提取試劑盒由Invitrogen公司提供；SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒由寶生物工程有限公司提供；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β) 以β-actin引物交由Takara公司設(shè)計(jì)；BCA試劑盒由AmyJet Scientific公司提供；性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex-determining region Y-box protein 2，SOX2，兔抗)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor4，OCT4，兔抗)、同源域蛋白(nanog homeobox，nanog，兔抗)和磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH，兔抗)由Cell Signaling Technology公司提供；ImageJ2x軟件由National Institutes of Health公司提供；熒光顯微鏡由浙江湖州萊特科技有限公司提供(型號(hào)XSP-63X)；PCR引物及PrimeScript RT試劑盒由寶日醫(yī)生物技術(shù)公司提供；流式細(xì)胞儀由美國(guó)BD公司提供(型號(hào)FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 MKN-45細(xì)胞及其干細(xì)胞培養(yǎng) 將MKN-45細(xì)胞在含有10%胎牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MKN-45細(xì)胞胰酶消化，放于含無(wú)血清1640培養(yǎng)液(含有1%青霉素、20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100 μg/L表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、1%N-2添加劑、2%B-27添加劑)的96孔超低吸附培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下定期觀察懸浮球體細(xì)胞成型情況。并按照1∶3進(jìn)行傳代。

1.2.2 胃癌干細(xì)胞分選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MKN-45細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度1×107/mL，離心重懸，向其中加入20 μL CD44磁珠，4 ℃ 孵育15 min，沖洗離心取上清液，重懸后，將磁珠分選分離柱放置于磁珠分選器中，對(duì)從磁珠分選分離柱中流出的細(xì)胞(CD44-)進(jìn)行收集，每次待柱內(nèi)液體流盡時(shí)，予以緩沖液沖洗，收集總的流出液，將柱子卸下，與離心管相接，之后予以泵壓，分選洗液細(xì)胞即為CD44+細(xì)胞[13]。胃癌干細(xì)胞分選分選成功標(biāo)準(zhǔn)[13]：通過分選前、后MKN-45細(xì)胞中CD44+含量變化情況來判斷胃癌干細(xì)胞分選成功與否，具體方法如下：(1)免疫熒光法鑒定CD44+表達(dá)情況：取分選前及分選后MKN-45腫瘤細(xì)胞球，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，種于6孔培養(yǎng)板(細(xì)胞濃度1×108/L)，培養(yǎng)于10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中，12 h后將細(xì)胞取出，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗，丙酮室溫放置10 min，PBS洗滌，用10%山羊血清于室溫封閉0.5 h，棄血清，向其中加入CD44抗體(稀釋1∶200)，4 ℃過夜孵育，滴加熒光標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫避光孵育1 h，于熒光顯微鏡下拍照，圖片中綠色熒光顯示為含有CD44+的細(xì)胞。(2)為進(jìn)一步對(duì)MKN-45腫瘤細(xì)胞球中CD44+含量進(jìn)行定量分析，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前及分選后CD44+胃癌干細(xì)胞比例：取分選前及分選后MKN-45細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，離心棄去上清液，PBS洗滌，加入CD44+抗體，冰上孵育1 h，離心棄去上清液，PBS洗滌，離心后，流用含有1%BSA的PBS重懸，于400目濾網(wǎng)中將細(xì)胞懸液過濾，置入流式管中，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選前、后CD44+細(xì)胞所占比例，來判斷CD44+細(xì)胞分選成功與否。

1.2.3 胃癌干細(xì)胞的鑒定 通過檢測(cè)胃癌干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2、OCT4、Nanog表達(dá)情況進(jìn)一步對(duì)1.2.2分選的MKN-45細(xì)胞干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。免疫印跡法鑒定腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物(SOX2、OCT4、Nanog)的表達(dá)：提取懸浮MKN-45腫瘤細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2、OCT4、Nanog的總蛋白。通過BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將提取的蛋白與上樣緩沖液混合，95 ℃煮10 min、離心，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。室溫下5%脫脂乳在TBST中封閉1 h，滴加一抗(1∶1 000稀釋)SOX2、OCT4、Nanog和GAPDH 4 ℃孵育過夜，室溫下磷酸鹽緩沖液洗滌，加入相應(yīng)的二抗37 ℃孵育l h，洗滌，化學(xué)發(fā)光試劑顯影，蛋白印記圖像用ImageJ2x軟件分析，蛋白水平通過灰度值/GAPDH條帶灰度值進(jìn)行表示。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)各組MKN-45干細(xì)胞增殖活力 取第3代MKN-45干細(xì)胞，予以PBS清洗，進(jìn)行胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后，以每孔1×105/L細(xì)胞濃度接種于96孔板中，在培養(yǎng)箱孵育24 h，換液，分別向其中加入3中濃度的二甲雙胍(0、1、5、10 mmol/L)溶液，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，取出培養(yǎng)板，根據(jù)CCK8試劑盒說明書，加入10 μL CCK8繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在490 nm處讀取吸光度值(OD)，制作增殖曲線圖。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MKN-45干細(xì)胞凋亡情況 取第3代MKN-45干細(xì)胞，予以PBS清洗，進(jìn)行胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。以細(xì)胞濃度為1×1010/L接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)1 d，換液，分別加入3中濃度的二甲雙胍(0、1、5、10 mmol/L)溶液，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，取出培養(yǎng)瓶，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，離心分離去上清，收集細(xì)胞于離心管中，PBS洗滌，加1 mL預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定，24 h后離心分離去上清，加1 mL預(yù)冷PBS，使細(xì)胞懸浮混勻；并加0.5 mL碘化丙啶予以染色，37 ℃避光孵育30 min，通過流式細(xì)胞儀于488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定MKN-45干細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)MKN-45干細(xì)胞wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)情況 收集1.2.4中不同濃度二甲雙胍處理的(24、48、72 h)MKN-45干細(xì)胞，通過RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。按照PrimeScript RT試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μL。β-catenin、GSK-3β以β-actin作為內(nèi)參，引物序列見表1。參照SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增預(yù)變性、變性、退火、延伸反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55～60 ℃ 40 s，72 ℃ 1min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。予以2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胃癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

胃癌細(xì)胞系MKN-45在無(wú)血清培養(yǎng)基7 d后形成各自的懸浮球體細(xì)胞(圖1A)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，培養(yǎng)到15 d時(shí)腫瘤球體細(xì)胞排列致密，中心密度高，呈現(xiàn)腫瘤細(xì)胞富集(圖1B)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與胃癌干細(xì)胞分選前相比，分選后MKN-45腫瘤細(xì)胞球中CD44+(綠色熒光顯示含有CD44+的細(xì)胞)數(shù)量增加(圖1C、圖1D)。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD44+定量顯示，與胃癌干細(xì)胞分選前相比，分選后CD44明顯富集，CD44+比例在MKN-45細(xì)胞中由5.70%富集至89.32%(圖1E、圖1F)，提示CD44+細(xì)胞分選成功；免疫印跡結(jié)果顯示，懸浮MKN-45腫瘤細(xì)胞球中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2、OCT4、Nanog蛋白高于貼壁細(xì)胞 (P<0.05)(圖1G、圖1H)，提示懸浮球體細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。

表1 引物序列

2.2 不同濃度二甲雙胍對(duì)MKN-45干細(xì)胞增殖活力的影響

與未處理的MKN-45干細(xì)胞相比，經(jīng)不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理的MKN-45干細(xì)胞在48 h及72 h增殖能力下降 (P<0.05)，且呈時(shí)間與劑量依賴性。見圖2。

2.3 不同濃度二甲雙胍對(duì)MKN-45干細(xì)胞凋亡情況的影響

與未處理的MKN-45干細(xì)胞相比，經(jīng)不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理的MKN-45干細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)(48～72 h)及濃度增加，細(xì)胞凋亡率也隨之增加(P<0.05)，且呈時(shí)間與劑量依賴性。見圖3。

2.4 不同濃度二甲雙胍對(duì)MKN-45干細(xì)胞β-catenin、GSK-3β基因表達(dá)影響

與未處理的MKN-45干細(xì)胞相比，隨著二甲雙胍處理濃度增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MKN-45干細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，GSK-3β mRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)，且呈時(shí)間與劑量依賴性。見圖4。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織中數(shù)量極少，具有較強(qiáng)的自我更新、多向分化及無(wú)限增值的能力殖。近些年來，越來越多的研究報(bào)道了在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞[14]。已有研究[15-16]證實(shí)，胃癌干細(xì)胞在化療藥物的耐藥方面顯著強(qiáng)于普通胃癌細(xì)胞。因此，靶向胃癌干細(xì)胞已成為現(xiàn)階段臨床治療胃癌新的方向。

本研究中胃癌細(xì)胞株MKN-45在超低粘附板中培養(yǎng)，在無(wú)血清培養(yǎng)基7 d后形成各自的球體細(xì)胞，培養(yǎng)15 d時(shí)腫瘤球體細(xì)胞排列致密，中心密度高，呈現(xiàn)腫瘤細(xì)胞富集。研究[17-18]顯示，CD44+、SOX2、OCT4、Nanog是腫瘤干細(xì)胞中常見生物標(biāo)記物，本研究通過檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物來鑒定胃癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及分選情況，免疫熒光顯示，與分選前相比，胃癌干細(xì)胞分選后，CD44+表達(dá)增加，且流式細(xì)胞術(shù)也顯示，分選后CD44+明顯富集，CD44+比例在MKN-45細(xì)胞中由5.70%富集至89.32%，同時(shí)懸浮MKN-45腫瘤細(xì)胞球中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2、OCT4、Nanog蛋白高于貼壁細(xì)胞。進(jìn)一步證實(shí)本研究胃癌干細(xì)胞分選成功，可成為靶細(xì)胞應(yīng)用于二甲雙胍抗胃癌作用機(jī)制的研究[19]。

二甲雙胍是一種用于治療2型糖尿病的臨床藥物，有研究[20]認(rèn)為，該藥對(duì)預(yù)防癌癥的發(fā)生及降低癌癥死亡風(fēng)險(xiǎn)具有促進(jìn)作用，已有多項(xiàng)研究表明，二甲雙胍可通過調(diào)控相關(guān)基因起到抑制腫瘤增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。Teufelsbauer等[20]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過間接介導(dǎo)人脂肪基質(zhì)細(xì)胞的支持活性在乳腺癌中發(fā)揮抗癌活性。Gulati等[9]研究認(rèn)為，塞來昔布聯(lián)用二甲雙胍可通過抑制局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、n-鈣粘蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性來抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究CCK-8結(jié)果顯示，與未處理的MKN-45干細(xì)胞相比，經(jīng)過不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理的MKN-45干細(xì)胞在48 h及72 h增殖能力下降，且呈時(shí)間與劑量依賴性，表明二甲雙胍具有抗胃癌干細(xì)胞的增殖的活性，且與其劑量及作用時(shí)間成正比。同時(shí)本研究又對(duì)胃癌干細(xì)胞的凋亡機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，與未處理的MKN-45干細(xì)胞相比，經(jīng)過二甲雙胍處理時(shí)間的延長(zhǎng)(48～72 h)及濃度增加，MKN-45干細(xì)胞凋亡率也隨之顯著增加，且呈時(shí)間與劑量依賴性，說明二甲雙胍濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，其誘導(dǎo)胃癌干細(xì)胞的凋亡就越顯著。分析原因可能與二甲雙胍腫瘤抑制機(jī)制有關(guān)：(1)通過活化調(diào)控胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因1軸、腺苷活化蛋白激酶、阻滯腫瘤細(xì)胞周期以及調(diào)節(jié)能量代謝平衡等，進(jìn)而起到直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[21]；(2)通過調(diào)節(jié)腸道菌群、激活免疫機(jī)制，并與各類抗腫瘤藥物協(xié)同發(fā)揮間接抑制腫瘤的作用[21]；(3)二甲雙胍可能激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子如β-catenin，來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖遷移，并激活下游相關(guān)增殖凋亡基因(cyclilnD1、c-myc)表達(dá)，來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡[22]。

多項(xiàng)研究[23-24]已表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與胃癌細(xì)胞及其干細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)作用機(jī)制，通過采用合適的治療手段來抑制胃癌干細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，已成為現(xiàn)階段靶向治療胃癌的重要研究方向。Fan等[25]研究報(bào)道，通過上調(diào)胃癌干細(xì)胞中miR-501-5p表達(dá)，可使Wnt/β-catenin信號(hào)通路被過度激活，進(jìn)而介導(dǎo)胃癌干細(xì)胞樣表型。Akrami等[26]研究報(bào)道，布洛芬可通過改變Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游相關(guān)基因的表達(dá)等來抑制Wnt信號(hào)通路，起到抗胃癌干細(xì)胞增殖的作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin因子分布于細(xì)胞膜，起到維持同型細(xì)胞間黏連的作用，其表達(dá)的上調(diào)可激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，而GSK-3β作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可與軸蛋白、結(jié)腸腺瘤息肉易感基因等形成復(fù)合體，促進(jìn)β-catenin的磷酸化，致使β-catenin被水解[27]。然而現(xiàn)階段關(guān)于二甲雙胍通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來影響胃癌干細(xì)胞增殖凋亡機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與未處理的MKN-45干細(xì)胞相比，隨著二甲雙胍處理濃度增加及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MKN-45干細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢(shì)，GSK-3βmRNA表達(dá)呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，提示二甲雙胍對(duì)胃癌干細(xì)胞的增殖抑制及凋亡促進(jìn)與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，隨著二甲雙胍濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，可促進(jìn)胃癌干細(xì)胞增殖活性的增強(qiáng)及凋亡率降低，其作用原因可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究存不足之處在于，由于實(shí)驗(yàn)條件有限，未直接驗(yàn)證Wnt/β-catenin信號(hào)通對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖凋亡機(jī)制的影響，僅對(duì)二甲雙胍影響胃癌干細(xì)胞增殖凋亡機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)系可能性進(jìn)行初步探討，后續(xù)可就此問題進(jìn)一步深入研究。