李大鵬,高玉榮
(巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院,安徽合肥 238000)
益生菌是一類(lèi)有益于機(jī)體的活性微生物,攝入一定量的活性益生菌有助于調(diào)節(jié)宿主腸道的微生態(tài)平衡,從而有益于宿主健康[1]。植物乳桿菌是目前被廣泛關(guān)注的益生菌,普遍存在于果蔬的表面,具有很強(qiáng)的發(fā)酵產(chǎn)酸能力[2]。同時(shí)研究表明植物乳桿菌具有較強(qiáng)的耐受人體胃腸道內(nèi)不良環(huán)境的能力,容易定植在人體腸道中生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生乳酸等成分,競(jìng)爭(zhēng)性抑制腸道內(nèi)有害微生物,從而有助于防治腸道疾病[3]。益生菌經(jīng)培養(yǎng)后制備的液體菌劑,存在運(yùn)輸成本高、菌體失活速度快等缺點(diǎn),制備易于保存的益生菌粉末狀制劑已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。
真空冷凍干燥,也稱(chēng)升華干燥,是將原材料冷凍后在真空下使冰升華而使物料干燥的方法[5]。通過(guò)在微生物菌懸液中添加保護(hù)劑,可減少真空冷凍干燥過(guò)程中對(duì)菌體的傷害[6]。研究表明,采用真空冷凍干燥進(jìn)行菌體的保藏,具有細(xì)胞存活率高,保藏時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn),已成為菌體干粉制備最常用的方法之一[7]。由于凍干過(guò)程中使用的保護(hù)劑的類(lèi)型及其作用原理不同,對(duì)于菌體的凍干過(guò)程,保護(hù)劑的選擇及其復(fù)配是研究的重點(diǎn)內(nèi)容[8]。蔣文鑫等[9]研究了不同分子質(zhì)量糖(醇)類(lèi)及蛋白類(lèi)保護(hù)劑對(duì)短雙歧桿菌凍干存活率的影響,結(jié)果表明山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質(zhì)量比3:3:2時(shí)保護(hù)效果最好,短雙歧桿菌的凍干存活率可達(dá)80%。牛春華等[10]研究了嗜酸乳桿菌凍干保護(hù)劑,結(jié)果表明可溶性淀粉18%,低聚木糖12%,谷氨酸鈉7%,菊糖15%時(shí),嗜酸乳桿菌細(xì)胞存活率最高可達(dá)87.4%。王桃等[11]研究?jī)?yōu)化長(zhǎng)雙歧桿菌DD98的凍干保護(hù)劑配方,在脫脂奶粉10%,海藻糖20%,Vc-Na 2%,純化水68%的條件下凍干菌粉的存活率提高到90%。
目前,嗜酸乳桿菌等益生菌的凍干存活率普遍不高,為了提高益生菌的凍干存活率,提高益生菌的保藏效果,本文以前期從傳統(tǒng)臘腸中篩選的具有體外降膽固醇和降甘油三酯功能的益生菌植物乳桿菌G1-28為研究對(duì)象,對(duì)菌體離心條件、凍干保護(hù)劑的選擇及其復(fù)配及其凍干菌劑的保藏條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,為益生菌植物乳桿菌G1-28高活性凍干發(fā)酵劑的制備奠定基礎(chǔ)。
植物乳桿菌G1-28 從傳統(tǒng)臘腸中篩選的具有體外降膽固醇和降甘油三酯功能的乳酸菌,巢湖學(xué)院食品工程實(shí)驗(yàn)室保藏[12];脫脂乳蒙牛牌 市售;甘油、海藻糖、山梨醇 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
TG16Ws臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;SHP-160智能生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇州市智拓凈化設(shè)備科技有限公司;LGJ-30F真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。
1.2.1 植物乳桿菌菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 將-20 ℃保藏的植物乳桿菌G1-28的甘油管融化,取1 mL接種到裝有50 mL MRS液體培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)14~16 h,無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3次,用無(wú)菌水將菌懸液調(diào)至適宜濃度備用[13]。
1.2.2 植物乳桿菌菌懸液離心條件的選擇 將植物乳桿菌G1-28菌體100 mL培養(yǎng)液移入無(wú)菌離心管中,分別在3000、4000、5000、6000 r/min下離心10和20 min;棄去上清液,收獲菌體,生理鹽水洗滌后用于活細(xì)胞計(jì)數(shù)[14]。
1.2.3 植物乳桿菌凍干保護(hù)劑的確定 將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)和離心收集制備的植物乳桿菌G1-28的菌泥,測(cè)定細(xì)胞的活菌數(shù)N0,按照保護(hù)劑:菌泥為(w/v)2:1進(jìn)行配比,利用渦旋混合器充分混勻后分裝,在-40 ℃下預(yù)凍6 h,在真空度0.09 MPa,冷阱溫度-51 ℃的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥22~24 h[11]。凍干后將凍干瓶-20 ℃存放48 h,30 ℃水浴中解凍。
1.2.3.1 脫脂乳對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑細(xì)胞存活率的影響 將脫脂乳配成2%、4%、6%、8%、10%和12%的濃度作為保護(hù)劑,以不加脫脂乳的蒸餾水為空白對(duì)照,凍干后保藏解凍,測(cè)定植物乳桿菌G1-28活菌數(shù)N1,計(jì)算存活率。
1.2.3.2 海藻糖對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑活菌數(shù)的影響 將海藻糖配成1%、2%、3%、4%和5%的濃度作為保護(hù)劑,以不加海藻糖的蒸餾水為空白對(duì)照,凍干后保藏解凍,測(cè)定植物乳桿菌G1-28活菌數(shù)N1,計(jì)算存活率。
1.2.3.3 山梨醇對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑活菌數(shù)的影響 將山梨醇配成1%、2%、3%、4%和5%的濃度,以不加山梨醇的蒸餾水為空白對(duì)照,凍干后保藏解凍,測(cè)定植物乳桿菌G1-28活菌數(shù)N1,計(jì)算存活率。
1.2.3.4 甘油對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑活菌數(shù)的影響
將甘油配成1%、2%、3%、4%和5%的濃度,以不加甘油的蒸餾水為空白對(duì)照,凍干后保藏解凍,測(cè)定活菌數(shù)N1,計(jì)算存活率。
1.2.4 凍干保護(hù)劑的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以細(xì)胞存活率為指標(biāo)設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1。
表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Level of orthogonal experimental factors
1.2.5 植物乳桿菌凍干發(fā)酵劑保存性測(cè)定 將真空冷凍干燥后的植物乳桿菌G1-28發(fā)酵劑裝入經(jīng)滅菌處理的鋁箔聚酯復(fù)合袋內(nèi),分別采用真空和常壓包裝,在-20、-4 ℃和室溫下分別保藏2個(gè)月和4個(gè)月,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)[14]。
所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,每次兩個(gè)平行樣。采用SAS8.1軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。
離心是發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié),因此實(shí)驗(yàn)研究了離心轉(zhuǎn)數(shù)及時(shí)間對(duì)收獲的活細(xì)胞濃度的影響見(jiàn)表2。
表2 離心條件對(duì)活細(xì)胞濃度的影響Table 2 Effects of centrifugal conditions on the concentration of living cells
由表2可以看出,當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為3000和4000 r/min時(shí),由于離心轉(zhuǎn)速較低,有些小細(xì)胞不易被收集,但當(dāng)離心轉(zhuǎn)速達(dá)到6000 r/min時(shí),過(guò)高的離心轉(zhuǎn)速容易導(dǎo)致細(xì)胞的死亡,使平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的活細(xì)胞數(shù)較低,因此,較適宜的離心收集條件為5000 r/min,20 min,此時(shí),收獲的活細(xì)胞數(shù)是離心前的96.26%。
2.2.1 植物乳桿菌凍干保護(hù)劑的單因素實(shí)驗(yàn) 微生物細(xì)胞在冷凍的過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)大量水分結(jié)冰后會(huì)形成較大的冰晶,從而對(duì)微生物的細(xì)胞膜造成較大的損傷,導(dǎo)致冷凍后菌體細(xì)胞的死亡率很高。采用海藻糖、脫脂乳、山梨醇以及甘油等作為單一冷凍保護(hù)劑可降低細(xì)胞的死亡率[15],因此實(shí)驗(yàn)研究了脫脂乳、海藻糖、山梨醇及甘油單獨(dú)使用對(duì)凍干后乳酸菌存活率的影響。
2.2.1.1 脫脂乳對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑細(xì)胞存活率的影響 脫脂乳的成分主要是蛋白質(zhì)和乳糖,將其溶解在水中是一種膠體溶液,脫脂乳中的蛋白質(zhì)顆粒的直徑較小,在1~2 nm之間,將乳酸菌添加到脫脂乳溶液中,乳酸菌菌體細(xì)胞處于蛋白質(zhì)分子的包圍之中,在冷凍過(guò)程中可阻止細(xì)胞內(nèi)形成大得冰晶,能對(duì)乳酸菌菌體細(xì)胞起到很好的保護(hù)作用,有助于保持乳酸菌菌體的活性[16]。Khem等[17]的研究也表明脫脂乳也能在干燥過(guò)程中降低升溫的速度,減少細(xì)胞的壓力,從而起到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。由圖1可以看出,當(dāng)脫脂乳濃度小于6%時(shí),隨著脫脂乳濃度的增加,細(xì)胞存活率明顯增大,當(dāng)脫脂乳濃度大于6%時(shí),隨著脫脂乳濃度的增加,細(xì)胞存活率略有下降但基本平穩(wěn)。脫脂乳濃度過(guò)高,容易使細(xì)胞脫水,影響了細(xì)胞的形態(tài),從而影響了菌體的存活率,因此通過(guò)單因素確定的脫脂乳適宜濃度為6%。
圖1 脫脂乳濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of skim milk concentration on cell survival ratio
2.2.1.2 海藻糖對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑活菌數(shù)的影響 在植物乳桿菌細(xì)胞冷凍的過(guò)程中,細(xì)胞中的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生脫水變性,海藻糖作為一種雙糖,在蛋白質(zhì)冷凍的過(guò)程中能填充到因蛋白質(zhì)失水而形成的空缺中,從而有效的抑制微生物中的蛋白質(zhì)在冷凍過(guò)程中發(fā)生的變性[18]。由圖2可以看出,海藻糖添加量在0~2%范圍內(nèi),隨著海藻糖濃度的增加,植物乳桿菌細(xì)胞存活率逐漸提高;但當(dāng)海藻糖濃度大于2%時(shí),隨著海藻糖濃度的增加,植物乳桿菌細(xì)胞存活率的呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)。Ambros等[19]研究也表明了在真空干燥狀態(tài)下,海藻糖具有保護(hù)益生菌穩(wěn)定性的作用。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定海藻糖適宜濃度為2%。
圖2 海藻糖濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of trehalose concentration on cell survival ratio
2.2.1.3 山梨醇對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑活菌數(shù)的影響 由圖3可以看出,山梨醇濃度在0~2%的范圍內(nèi),隨著山梨醇濃度的增加,植物乳桿菌細(xì)胞存活率逐漸提高,當(dāng)山梨醇濃度為2%時(shí),植物乳桿菌凍干后的存活率最高為60.50%。實(shí)驗(yàn)表明2%的山梨醇對(duì)植物乳桿菌起到了較好的保護(hù)作用。山梨醇具有良好的保濕性能,在溶液中會(huì)與水分子發(fā)生結(jié)合,容易滲透到微生物細(xì)胞內(nèi),在冷凍條件下可增加溶液的粘性,從而抑制水的結(jié)晶,能保護(hù)細(xì)胞的活性,和甘油一起使用具有增效作用[18]。因此,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定山梨醇適宜濃度為2%。
2.2.1.4 甘油對(duì)植物乳桿菌凍干菌劑活菌數(shù)的影響
由圖4可以看出,甘油濃度為0~3%時(shí),隨著甘油濃度的增加,植物乳桿菌細(xì)胞存活率逐漸提高,但當(dāng)甘油濃度為3%時(shí),植物乳桿菌細(xì)胞存活率最高,達(dá)到65.20%。甘油作為一種小分子物質(zhì),能以自由擴(kuò)散的方式透過(guò)微生物的細(xì)胞膜。甘油易溶于水,并易與水分子發(fā)生結(jié)合作用。在添加了甘油的菌懸液中,微生物在凍干的過(guò)程中能通過(guò)水合作用增加溶液的粘性,減弱水的結(jié)晶過(guò)程,對(duì)活細(xì)胞有保護(hù)作用[20]。因此,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定甘油適宜濃度為3%。
圖3 山梨醇濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of sorbitol concentration on cell survival ratio
圖4 甘油濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effect of glycerol concentration on cell survival ratio
2.2.2 凍干保護(hù)劑的正交試驗(yàn)
2.2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 由單因素實(shí)驗(yàn)可以看出,脫脂乳、海藻糖、山梨醇和甘油作為凍干保護(hù)劑能明顯提高植物乳桿菌凍干菌種細(xì)胞的的存活率,但保護(hù)劑單獨(dú)使用時(shí),植物乳桿菌凍干后細(xì)胞最大的存活率只能達(dá)到65.20%,為了進(jìn)一步提高植物乳桿菌凍干菌種的存活率,實(shí)驗(yàn)以單因素實(shí)驗(yàn)確定的脫脂乳6%,海藻糖2%,山梨醇2%,甘油3%為中心點(diǎn),采用四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),研究脫脂乳、海藻糖、山梨醇和甘油四種保護(hù)劑聯(lián)合使用時(shí),保護(hù)劑的最佳配比,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
由表3可以看出,各因素對(duì)植物乳桿菌G1-28凍干菌體存活率影響的主次順序依次是甘油>海藻糖>山梨醇>脫脂乳。最佳培養(yǎng)基配方為A3B2C3D3,此配方不在正交試驗(yàn)的9組配方中,因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
2.2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)所獲得的最優(yōu)凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行植物乳桿菌的凍干實(shí)驗(yàn),即以脫脂乳7%,海藻糖2%,山梨醇3%,甘油4%為保護(hù)劑的條件下進(jìn)行菌懸液的凍干實(shí)驗(yàn),平均細(xì)胞存活率為93.20%±0.4%。正交試驗(yàn)結(jié)果證明了保護(hù)劑聯(lián)合使用可提高菌體的存活率,這主要是由于不同的保護(hù)劑能通過(guò)不同的機(jī)理和方式對(duì)菌體起到保護(hù)作用。與本文研究結(jié)果相似,文獻(xiàn)[16,21,22-23]也證明了復(fù)合保護(hù)劑的保護(hù)效果顯著高于單一保護(hù)劑。Chen等[24]采用響應(yīng)面優(yōu)化方法優(yōu)化了Bifidobacterium bifidumBB01凍干過(guò)程中的保護(hù)劑配方,在甘氨酸為5.5%,碳酸氫鈉為0.8%,低聚木糖為7%,精氨酸為4.5%,脫脂牛奶為25%的復(fù)合保護(hù)劑中,細(xì)胞可存活率可提高至90.37%。Lee等[25]研究表明Lactobacillus plantarumJH287在真空冷凍過(guò)程中的最佳最佳保護(hù)介質(zhì)為10%山梨醇和10%脫脂牛奶,在此條件下存活率可達(dá)86.37%。Chen等[24]和Lee等[25]確定的復(fù)合保護(hù)劑獲得的細(xì)胞存活率略低于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,與本文結(jié)果相同的是復(fù)合保護(hù)劑配方中脫脂牛乳都是主要的組分。這些研究結(jié)果表明乳酸菌凍干過(guò)程中復(fù)合保護(hù)劑可達(dá)到理想的保護(hù)效果,凍干后細(xì)胞的存活率可提高到85%以上。
表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experimental
2.2.3 凍干發(fā)酵劑保存性能測(cè)定 將真空冷凍干燥后的植物乳桿菌G1-28發(fā)酵劑,裝入經(jīng)滅菌處理的鋁箔聚酯復(fù)合袋內(nèi),分別采用真空和常壓包裝,在-20、-4 ℃和室溫下分別保藏2個(gè)月和4個(gè)月,進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),測(cè)定植物乳桿菌細(xì)胞存活率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
由表4可以看出,在相同的保藏溫度下,在真空保藏后,發(fā)酵劑中的植物乳桿菌細(xì)胞的存活率高于常壓保藏,在真空保藏條件下,-20 ℃的低溫保藏后發(fā)酵劑中植物乳桿菌細(xì)胞的存活率高于室溫和-4 ℃條件下保藏。因此確定制備的凍干發(fā)酵劑在的適宜保藏條件為真空條件下-20 ℃保藏。王桃等[11]的研究也表明了較低的保藏溫度更有力于凍干菌體活力的保持。
論文以具有體外降膽固醇降甘油三酯功能植物乳桿菌G1-28為菌種,對(duì)其凍干發(fā)酵劑的制備過(guò)程中的離心、保護(hù)劑配方及保藏效果進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明植物乳桿菌G1-28菌懸液的離心收集條件為5000 r/min,20 min,在此條件下活細(xì)胞收集率為96.26%。植物乳桿菌G1-28最佳凍干保護(hù)劑為脫脂乳7%,海藻糖2%,山梨醇3%,甘油4%,在此條件下細(xì)胞存活率最大為93.20%。凍干菌粉保藏條件為在抽真空條件下-20 ℃保藏,保藏4個(gè)月,細(xì)胞存活率為97.1%。研究結(jié)果表明,復(fù)合保護(hù)劑可以通過(guò)多種保護(hù)機(jī)制來(lái)減少冷凍干燥對(duì)菌體細(xì)胞的損傷,其冷凍干燥后細(xì)胞的存活率明顯高于單一保護(hù)劑。制備的植物乳桿菌G1-28菌粉可作為泡菜、蘋(píng)果發(fā)酵飲料等的發(fā)酵劑,也可以作為益生菌菌粉直接食用,產(chǎn)品具有使用、運(yùn)輸、貯藏方便,不易污染雜菌等優(yōu)點(diǎn)。下一步將進(jìn)行擴(kuò)大規(guī)模實(shí)驗(yàn),為菌劑的生產(chǎn)及應(yīng)用提供更直接的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
表4 發(fā)酵劑保存性測(cè)定Table 4 Determination of retention of starter