鹿鞭醇提物對秀麗隱桿線蟲衰老的影響

遲東澤，何 源，劉芳芳，張 晶,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.長春科技學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，吉林長春 130600）

衰老是指隨著年齡增長，機(jī)體功能逐漸下降的過程，可導(dǎo)致多種慢性類疾病，如阿爾茨海默證、癌癥、糖尿病和心血管疾病[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為腎精不足、氣血虧虛是導(dǎo)致衰老的主要原因[2]，而傳統(tǒng)的補(bǔ)益類中藥具有補(bǔ)氣、補(bǔ)血、滋陰、壯陽等功效，靈芝水提物[3]、瑪咖醇提物[4]等均具有較強(qiáng)的抗衰老活性。

秀麗隱桿線蟲是首個(gè)具有完成基因組測序的動物，60%～80%與人類基因具有同源性似，其行為和生理指標(biāo)變化與人類較為相似，被廣泛應(yīng)用于生物活性化合物的抗衰老作用研究[5]。

中藥鹿鞭（Penis et Testis Cervi）又稱鹿腎、鹿沖，為鹿科動物梅花鹿（Cervus nipponTemmink）或馬鹿（CelaphusLinnaeus）干燥帶睪丸的陰莖[6]，為傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，其化學(xué)成分主要包括核苷類、氨基酸類、脂肪酸類、糖類、甾體類、無機(jī)元素、多胺類、磷脂類[7]。現(xiàn)代研究表明，鹿鞭中性激素可提高腎陽虛不育癥大鼠睪酮水平、對大鼠生精功能起到調(diào)節(jié)作用[8]。鹿鞭活性肽具有抑制硫代巴比妥酸反應(yīng)（TBARS）、增強(qiáng)還原能力、提高DPPH自由基清除率的功效[9]。鹿鞭乙醇提取物可延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，降低運(yùn)動后小鼠尿素氮（BUN）、血乳酸（BLA）和丙二醛（MDA）水平，提高小鼠抗疲勞能力[7]。然而，關(guān)于鹿鞭抗衰老活性研究未見報(bào)道，因此本文以秀麗隱桿線蟲衰老為模型，通過測定線蟲壽命、吐咽、生殖能力、運(yùn)動能力、熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激、體內(nèi)抗氧化酶活力等指標(biāo)，研究鹿鞭醇提物的抗衰老活性及可能機(jī)制，并比較了梅花鹿鞭和馬鹿鞭活性，以期為鹿鞭藥材的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿鞭、馬鹿鞭 分別購于吉林雙陽西豐鹿場和新疆本草堂有限公司，由張晶教授鑒定為新疆馬鹿鞭（CelaphusLinnaeus）和梅花鹿鞭（Cervus nipponTemmink），兩種鹿鞭粉碎后過100目篩，粉末存于-80 ℃，待用；野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis.elegans）N2型 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)人參工程創(chuàng)新研究中心提供；膽固醇、瓊脂粉、蛋白胨

國藥試劑有限公司；百草枯 美國Sigma公司；OP50菌種 北京三藥公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 分析純，天津福晨試劑公司；氯化鈉、硫酸鎂、氫氧化鈉、次氯酸 分析純，上海國藥試劑公司；活性氧ROS試劑盒、ELISA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

BS-250生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Thermo FisherST16R高速離心機(jī) 昊諾斯科技有限公司；PL303 電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司；RS-232C MK3酶標(biāo)儀 Thermo Labsystems公司；KQ5200DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Olympus-BX41奧林巴斯顯微鏡 奧林巴斯公司；IX71IX71倒置熒光顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿鞭醇提物的制備 精密稱取梅花鹿鞭和馬鹿鞭樣品粉末15.000 g，加入80%乙醇150 mL超聲提取（功率250 W，頻率33 kHz，溫度50 ℃）3次[7]，每次1 h，合并提取液，濃縮至干，得花鹿鞭醇提物（HC）馬鹿鞭醇提物（MC），待用。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 NGM培養(yǎng)基配制：準(zhǔn)確稱取NaCl 1.50 g、瓊脂粉8.50 g、胰蛋白胨1.25 g、5.0 mg/mL膽固醇乙醇溶液500 μL，水定容至500 mL，高壓滅菌15 min，室溫冷卻至55 ℃，加入500 μL 1 mol/L CaCl2、500 μL 1 mol/L MgSO4、12.5 mL 1 mol/L PBS緩沖液，混勻后倒入培養(yǎng)皿中。

1.2.3 線蟲的培養(yǎng)及同步化 線蟲培養(yǎng)：將線蟲接種于含OP50的NGM培養(yǎng)基，20 ℃恒溫培養(yǎng)。線蟲同步化：采用高氯酸鈉裂解法[10]，M9緩沖液將線蟲從NGM上沖下，置于EP管中靜置1 min，棄掉上清液，加入一定量的M9緩沖液，再加入等體積的裂解液（NaClO:NaOH=1:1），震蕩約3 min，5500 r/min離心30 s，棄掉上清液，加入1 mL M9緩沖液吹散，離心，重復(fù)3次后，沉淀即為線蟲卵，置于NGM培養(yǎng)皿上，20 ℃培養(yǎng)。將同步化后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到含有大腸桿菌OP50的培養(yǎng)基中，空白組滴加蒸餾水，各劑量組分別加入0.5 mg/mL（低劑量組）、1.0 mg/mL（中劑量組）、2.0 mg/mL（高劑量組）鹿鞭醇提物，20 ℃培養(yǎng)。

1.2.4 壽命測定 將L4期線蟲分別轉(zhuǎn)移各組NGM培養(yǎng)皿中20 ℃培養(yǎng)。每組3個(gè)平行，每個(gè)培養(yǎng)皿約33條線蟲。從線蟲孵化開始記為第0 d，每天轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿中，到生殖后期（通常為第5 d）后，每48 h線蟲移至新培養(yǎng)皿，每天觀察線蟲，記錄線蟲生存、死亡數(shù)量[11]。

1.2.5 吐咽能力測定 取L4期線蟲于各組培養(yǎng)皿，顯微鏡下觀察其1 min內(nèi)的吐咽次數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每日轉(zhuǎn)板[12]。

1.2.6 生殖能力測定 每個(gè)培養(yǎng)皿2條L4期線蟲，各劑量組分別5個(gè)平行。每天將線蟲移至新培養(yǎng)皿，至線蟲基本不再產(chǎn)卵，記錄產(chǎn)卵總數(shù)，計(jì)算各劑量每條線蟲產(chǎn)卵量的平均值[13]。

1.2.7 秀麗隱桿線蟲急性熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 采用L4期線蟲按“1.2.3”方法進(jìn)行分組給藥后，于20 ℃培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)溫度調(diào)至35 ℃，此時(shí)設(shè)為0 h。每組3個(gè)平行，每個(gè)培養(yǎng)皿約33條線蟲。每2 h挑出死亡線蟲后繼續(xù)培養(yǎng)，至全部死亡[14]。

1.2.7.2 氧化損傷實(shí)驗(yàn) 將同期化線蟲移至相應(yīng)培養(yǎng)皿中，20 ℃培養(yǎng)48 h（每日轉(zhuǎn)板）后，轉(zhuǎn)移至10 mmoL/L百草枯平板上，建立氧化損傷模型。每組3個(gè)平行，每個(gè)培養(yǎng)皿約33條線蟲。每天統(tǒng)計(jì)線蟲數(shù)量，計(jì)算其存活率（存活率（%）=存活條數(shù)/總條數(shù)×100）[15]。

1.2.8 運(yùn)動能力測定 在壽命實(shí)驗(yàn)的第4、8、12 d觀察并記錄線蟲的運(yùn)動情況。記錄標(biāo)準(zhǔn)：A型：線蟲自發(fā)運(yùn)動，不需要觸碰刺激；B型：線蟲必須受到觸碰刺激才運(yùn)動；C型：線蟲受到觸碰刺激后只擺動頭或尾[16]。

1.2.9 ROS水平測定 將L4期線蟲移至含10 mmoL/mL百草枯各培養(yǎng)皿中，20 ℃培養(yǎng)48 h（每日轉(zhuǎn)板），將其轉(zhuǎn)移至濃度為100 μmoL/L H2DCFDA緩沖液中，20 ℃孵育40 min，觀察熒光強(qiáng)度（λex=485 nm，λem=528 nm[17]。

1.3 抗氧化酶活力及MDA含量測定

將同期化L4期線蟲轉(zhuǎn)移至各培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后，用M9緩沖液沖將線蟲沖至離心管。生理鹽水洗滌并于液氮中反復(fù)凍融3次，離心取上清液用ELISA試劑盒測定SOD、CAT活力及MDA水平[18]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±SD表示，采用prism8軟件作圖，SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿鞭提取物對壽命的影響

2種鹿鞭醇提物對線蟲壽命影響（圖1、表1）結(jié)果顯示，HC的各劑量組（0.5、1、2 mg/mL）可顯著提高線蟲壽命且呈濃度依賴性，與空白組相比，平均壽命分別分別提高17.06%、20.08%、35.82%；中位壽命分別提高約2.29、3.23、4.39 d；最大壽命分別提高約2.98、4.55、5.58 d。與空白組相比，MC組中不同濃度醇提物平均壽命分別提高13.39%、17.33%、23.52%；中位壽命分別提高約0.9、2.85、3.3 d；最大壽命分別提高約2.93、3.96、5 d。HC和MC組在0.5、1.0 mg/mL水平，線蟲壽命值與空白組相比均具有顯著差異（P＜0.05），濃度為2.0 mg/mL水平具有極顯著差異（P＜0.01）。2種鹿鞭均可延長線蟲壽命，在同一劑量水平，HC對線蟲壽命的影響大于MC。

圖1 鹿鞭醇提物對線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of alcohol extract from penis cervi on the life span of C.elegans

2.2 吐咽能力測定

線蟲的吐咽頻泵頻率反應(yīng)了線蟲對藥物的攝入情況和活動能力，隨著線蟲年齡的增長而降低[19]。結(jié)果表明（圖2、表2），空白組1 min內(nèi)的平均吐咽頻率為128±5.09，HC各劑量組（0.5、1、2 mg/mL）平均吐咽頻率為131.93±4.62、143.33±6.18、156.06±8.73次/min；MC組中平均吐咽頻率分別為134.33±3.54、141.87±5.21、150.73±3.43 次/min。與空白組相比，2種鹿鞭醇提物在給藥濃度為1.0 mg/mL水平可顯著提高線蟲的吐咽能力（P＜0.05），2.0 mg/mL水平極顯著提高線蟲吐咽能力（P＜0.01）。與空白組相比，HC中高劑量組（1.0、2.0 mg/mL）對線蟲吐咽頻率分別提高11.71%、21.92%；MC中高劑量組對線蟲吐咽頻率分別提高10.83%、19.95%。在同一劑量水平，HC和MC對線蟲吐咽能力均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 生殖能力測定

如圖3所示，線蟲在產(chǎn)卵期的第1～3 d產(chǎn)卵能力較強(qiáng)，但隨著壽命的增加，生殖能力逐漸下降，直至第5 d，基本不再產(chǎn)卵。根據(jù)前5 d內(nèi)的總子代數(shù)統(tǒng)計(jì)，與空白組相比，HC和MC各劑量組總子代個(gè)數(shù)無顯著差異，表明鹿鞭在發(fā)揮抗衰老活性時(shí)，并未損害其生殖能力。

表1 鹿鞭提取物對線蟲壽命的影響Table 1 Effect of penis cervi extract on the lifespan of nematodes

圖2 鹿鞭醇提物對線蟲咽泵頻率的影響Fig.2 Effect of alcohol extract from penis cervi on longevity pump frequency of C.elegans

表2 鹿鞭醇提取物平均吐咽頻率（次/min）Table 2 Average frequency of vomiting and swallowing of penis cervi alcohol extract (time/min)

2.4 運(yùn)動能力測試

圖3 鹿鞭醇提取物對線蟲繁殖能力的影響Fig.3 Effect of alcohol extract from penis cervi on the reproduction of C.elegans

衰老可導(dǎo)致肌肉退化，隨著年齡的增長運(yùn)動能力逐漸下降[20]。實(shí)驗(yàn)觀察了鹿鞭醇提物對第4、8和12 d線蟲運(yùn)動能力的影響（圖4～圖5）。第4 d，線蟲處于生命過程的早期階段，空白組與鹿鞭醇提物組均有60%以上線蟲保持在運(yùn)動A狀態(tài)，各組間無差異。第8 d，2種鹿鞭各劑量組與第4 d相比，運(yùn)動A狀態(tài)線蟲顯著減少，而運(yùn)動B和運(yùn)動C線蟲顯著增加（P＜0.05）。與空白組相比，HC各劑量組（0.5、1、2 mg/mL）線蟲運(yùn)動A狀態(tài)顯著提高了8.34%、14.03%、29%；HC與MC組相比，分別提高了1.7%、2.8%、8.3%。第12 d，空白組中有25%線蟲為運(yùn)動C狀態(tài)，而HC高劑量組（2.0 mg/mL）中有71.67%的線蟲保持在運(yùn)動A或B，顯著高于對照組；2.0 mg/mL HC組較MC組高7.01%。因此，2種鹿鞭均可顯著改善線蟲的運(yùn)動能力，在同一劑量水平，HC對線蟲運(yùn)動狀態(tài)影響優(yōu)于MC。

2.5 熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

圖4 花鹿鞭（HC）醇提取物對線蟲運(yùn)動能力的評估Fig.4 Evaluation of penis cervi alcohol extract on motility of C.elegans

高溫可導(dǎo)致生物體內(nèi)ROS水平增加，破壞自由基穩(wěn)定，引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而引起衰老[21]。35 ℃條件下，鹿鞭醇提物對線蟲抵抗熱應(yīng)激能力影響（圖6、表3）結(jié)果顯示，不同劑量HC組（0.5、1、2 mg/mL）中線蟲的平均生存時(shí)間分別較對照組提高了11.97%、26.54%、44.78%，MC組的平均存活時(shí)間分別提高12.56%、15.76、25.71%。2種鹿鞭醇提物均顯著提高線蟲的平均生存時(shí)間。2.0 mg/mL水平，HC組平均生存時(shí)間為12.22±0.28 h，顯著高于MC組10.61±0.17 h（P＜0.05）。因此，鹿鞭醇提物可提高對線蟲對熱應(yīng)激的保護(hù)作用，延長線蟲的平均生存時(shí)間，在2.0 mg/mL水平，HC對線蟲熱應(yīng)激抵御力大于MC。

圖5 馬鹿鞭（MC）醇提取物對線蟲運(yùn)動能力的評估Fig.5 Evaluation of penis cervi alcohol extract on motility of C.elegans

圖6 鹿鞭醇提物對線蟲熱應(yīng)激的影響Fig.6 Effect of alcohol extract from penis cervi on heat stress of C.elegans

表3 鹿鞭提取物對線蟲熱應(yīng)激的影響Table 3 Effect of penis cervi extract on heat stress of C.elegans

2.6 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

在百草枯致氧化損傷模型中，HC和MC低、中劑量組（0.5、1.0 mg/mL）可顯著提高線蟲的平均生存時(shí)間（P＜0.05）；高劑量組極顯著提高線蟲平均生存時(shí)間，分別提高41.04%和31.45%（P＜0.01）（圖7和表4）?？梢?，2種鹿鞭醇提物可增加線蟲對百草枯的抵御能力，顯著延長壽命，2.0 mg/mL水平，HC對百草枯抵御能力優(yōu)于MC。

2.7 鹿鞭醇提物線蟲體內(nèi)ROS的影響

活性氧的異常積累可導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響線蟲壽命。通過2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光染色法測定線蟲體內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示，鹿鞭醇提物呈濃度依賴性抑制線蟲體內(nèi)ROS的形成（圖8）。2種鹿鞭在低中劑量組無顯著差異，在2.0 mg/mL水平，HC的ROS清除率為28.67%，明顯高于MC組（23.34%）。

2.8 鹿鞭醇提物對線蟲抗氧化酶活力和MDA含量的影響

圖7 鹿鞭提取物對線蟲氧化應(yīng)激的影響Fig.7 Effects of extracts from penis cervi on oxidative stress of C.elegans

表4 鹿鞭提取物對線蟲氧化應(yīng)激的影響Table 4 Effects of different solvent extracts penis cervi on the oxidative stress of C.elegans

圖8 鹿鞭提取物對線蟲體內(nèi)ROS的影響Fig.8 Effect of extracts from penis cervi on ROS in C.elegans

3 結(jié)論與討論

本研究顯示，經(jīng)HC和MC各劑量處理后，線蟲壽命值顯著提高且呈濃度依賴性；運(yùn)動能力測試表明，花鹿鞭和馬鹿鞭醇提物可顯著改善衰老線蟲的運(yùn)動狀態(tài)，延長熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激狀態(tài)下線蟲平均生存率。因此，2種鹿鞭均可在線蟲體內(nèi)發(fā)揮抗衰老活性。

氧自由基理論認(rèn)為，衰老可能是由于機(jī)體正常代謝或受外界環(huán)境脅迫時(shí)，產(chǎn)生過量活性氧自由基（ROS），導(dǎo)致ROS與抗氧化酶失衡，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷DAN、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和衰老[23]。經(jīng)鹿鞭醇提物處理后，線蟲可顯著改善因百草枯脅迫引起的ROS異常累積，提高SOD、CAT抗氧化酶活力、降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量。文獻(xiàn)報(bào)道鹿茸醇取物[24]可顯著提高線蟲對胡桃醌脅迫的抵御力，提高其抗氧化能力，延長線蟲壽命。淫羊藿醇提取物[25]降低衰老小鼠體內(nèi)ROS水平，提高抗氧化酶活性，其抗衰老機(jī)制主要源于抗氧化活性。余甘子提取物[26]可顯著提高線蟲體內(nèi)SOD活力，形成氧化保護(hù)，提高線蟲壽命。因此，鹿鞭醇提物可能是通過提高抗氧化能力，清除活性氧自由基，提高抗氧化酶活性來實(shí)現(xiàn)抗衰老活性。這也與鹿鞭醇提物[7]具有提高抗氧化酶活性，降低MDA水平，改善小鼠疲勞狀態(tài)結(jié)果相一致。

2種鹿鞭醇提物可顯著提高線蟲的壽命值，但對其產(chǎn)卵能力無顯著差異，表明鹿鞭在發(fā)揮抗衰老作用的同時(shí)，對線蟲生殖能力無損害，這與橙提取物[27]延長線蟲壽命且不損傷生殖能力的結(jié)果相一致。飲食限制途經(jīng)是指保證線蟲正常營養(yǎng)狀態(tài)下，減少多余熱量的攝入，通過延遲發(fā)育，延緩線蟲壽命。吐咽能力為飲食限制途經(jīng)的常用指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道海參[28]提取物延長線蟲壽命且顯著提高其吐咽能力。在本文中，鹿鞭醇提物均未抑制線蟲吐咽能力，且在中、高劑量組（1.0、2.0 mg/mL）具有顯著促進(jìn)作用。表明線蟲在不斷的在攝取含OP50的藥物來實(shí)現(xiàn)藥理活性，而不是由于飲食限制途經(jīng)。這也與枸杞提取物[29]提高線蟲吐咽能力的結(jié)果一致。

2種鹿鞭醇提物均可通過提高抗氧化能力，清除線蟲體內(nèi)ROS累積，增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)激抵抗力，以實(shí)現(xiàn)抗衰老活性的目的，其中2.0 mg/mL HC組線蟲在壽命、氧化應(yīng)激、運(yùn)動實(shí)驗(yàn)測試中均優(yōu)于MC，表明在一定劑量水平下，花鹿鞭醇提物抗衰老活性大于馬鹿鞭醇提物。本研究可為鹿鞭藥材的開發(fā)利用提供參考，但未對衰老基因相關(guān)調(diào)控機(jī)制深入研究，有待繼續(xù)探討。

圖9 鹿鞭提取物對線蟲SOD、CAT活力及MDA含量的影響Fig.9 Effect of extract from penis cervi on SOD, CAT activity and MDA content of C.elegans