HPLC-ICP-MS結(jié)合微波酸提取分析測(cè)定干制食用菌中砷的形態(tài)

熊善波，何 鮚, ，張 闊，汪佳林，何瀚庭，蘭 航

（1.成都市食品藥品檢驗(yàn)院，四川成都 610500；2.成都經(jīng)開(kāi)區(qū)農(nóng)村農(nóng)業(yè)局，四川成都 610500）

砷（As）是自然界中一種常見(jiàn)的污染物，在自然界中主要以無(wú)機(jī)砷和有機(jī)砷的形態(tài)存在。砷化合物的毒性依賴(lài)于其化學(xué)形態(tài)和濃度，并通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)富集，有機(jī)砷通常被認(rèn)為是低毒性或者無(wú)毒性的，無(wú)機(jī)砷是致癌、致畸的主要來(lái)源[1-2]。基于砷形態(tài)毒性的差異，僅測(cè)定食品中的總砷含量已不能滿足評(píng)價(jià)砷毒性的需求，因此采用高靈敏度的形態(tài)分析測(cè)定方法測(cè)定食品中的砷含量對(duì)食品安全具有積極的意義[3]。

野生食用菌為一類(lèi)珍稀名貴的食材，因其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富。富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素、多種礦物質(zhì)元素及不飽和脂肪酸等生理活性成分，能夠增強(qiáng)免疫功能、 降血壓和抗腫瘤，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)。野生食用菌重金屬含量與土壤、水分、大氣等生長(zhǎng)環(huán)境因子具有密切聯(lián)系。多數(shù)對(duì)重金屬 As、Hg、Cd、Pb有很強(qiáng)的富集能力，總砷含量超標(biāo)問(wèn)題凸顯，而無(wú)機(jī)砷含量則相對(duì)較低[4]。因此，建立準(zhǔn)確測(cè)定食用菌中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定方法和研究砷元素的化學(xué)形態(tài)對(duì)其質(zhì)量安全評(píng)價(jià)具有重要意義。

適宜的提取方法是形態(tài)分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，樣品基質(zhì)不同最優(yōu)的提取方法不同，現(xiàn)有的研究多采用加熱震蕩酸提取[5-6]、超聲輔助酸提取、微波酸提取[7-8]等方式對(duì)食品樣品中不同形態(tài)的砷化合物進(jìn)行提取。目前砷形態(tài)分析主要有HPLC-ICP-MS、LC-AFS等方法[9-10]。LC-AFS雖然使用成本較低，但是由于對(duì)流動(dòng)相要求較高，同時(shí)存在長(zhǎng)期穩(wěn)定欠缺和儀器靈敏度較低，不適合低含量的樣品分析。而前者具有檢出限低，精密度高，和分離效果好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[11]。本文研究采用不同的前處理方法，結(jié)合高效、低干擾、高靈敏度、檢出限低、線性范圍廣的檢測(cè)手段，建立微波酸提取并結(jié)合高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)干制食用菌中砷形態(tài)的快速分析方法，以期為全面客觀評(píng)價(jià)食用菌中砷元素的危害提供了方法依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑牛肝菌、松茸、黑松露、青杠菌、黑虎掌菌、姬菇、蔥菌、羊肚菌、姬菇、松毛菇、珍珠菌 來(lái)自四川川野食品有限公司；亞砷酸根（As（Ⅲ），1.011±0.016 μmol/g）、砷酸根（As（V）），0.233±0.005 μmol/g）、一甲基砷 （MMA，0.335±0.011 μmol/g）、二甲基砷（DMA，0.706±0.024 μmol/g）、砷甜菜堿（AsB，0.518±0.015 μmol/g）、砷膽堿（AsC，0.374±0.015 μmol/g）中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；碳酸銨、硝酸 優(yōu)級(jí)純，賽默飛世爾科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 均為去離子水。

iCAP RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、U3000型HPLC高效液相色譜儀、Dionex IonPacTMAS7色譜柱（4×250 mm） 賽默飛世爾科技有限公司；超純水儀 德國(guó)默克密理博公司；分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；微波消解儀 安東帕有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用器皿均25%的硝酸溶液浸泡過(guò)夜，去離子水沖凈晾干備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 亞砷酸根As（Ⅲ）、砷酸根As（V）、一甲基砷 MMA、二甲基砷 DMA、砷甜菜堿AsB、砷膽堿 AsC標(biāo)準(zhǔn)溶液：將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶配制成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液（以As計(jì)），避光保存于4 ℃冰箱中。標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度：分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水逐級(jí)稀釋成濃度為0.00、 2.50、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理方法的選擇 將樣品直接用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩后備用。樣品中總砷的測(cè)定方法按GB 5009.11-2014(第一篇 第一法 電感耦合等離子體質(zhì)譜法)進(jìn)行測(cè)定[5]，將分離的各個(gè)形態(tài)砷的總和相加即得到樣品中形態(tài)砷總和。

1.2.2.1 微波萃取-酸提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于微波消解罐中，加入25 mL，4%的硝酸溶液，靜置30 min后在110 ℃、功率為1000 W的條件下微波消解15 min。冷卻后將提取液轉(zhuǎn)移到離心管，用少量超純水轉(zhuǎn)移消解罐的殘?jiān)?000 r/min離心15 min。加入5 mL正已烷，振搖1 min后，8000 r/min離心15 min。吸取下層清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾及C18小柱凈化后進(jìn)樣。按同一操作方法作空白試驗(yàn)。

1.2.2.2 加熱震蕩酸提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL塑料離心管中，加入25 mL ，4%的硝酸溶液，放置過(guò)夜。于90 ℃下恒溫箱中提取2.5 h，期間振搖數(shù)次，將提取液轉(zhuǎn)移到離心管[12-13]。

1.2.2.3 超聲輔助-酸提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL塑料離心管中，加入25 mL，4%的硝酸溶液，放置過(guò)夜。60 ℃下超聲水浴提取2.5 h，期間振搖數(shù)次，將提取液轉(zhuǎn)移到離心管[14]。

1.2.3 樣品微波萃取-酸提取條件的優(yōu)化 按照1.2.2.1中條件對(duì)樣品進(jìn)行處理，考察提取溫度（70、80、90、100、110、120、130、140 ℃）以及酸度（2%、3%、4%、5%、6%）對(duì)提取率的影響，通過(guò)測(cè)定各形態(tài)砷含量的總和與樣品總砷含量的比值計(jì)算提取率，優(yōu)選最佳提取溫度及酸濃度。

1.2.4 HPLC-ICP-MS條件 色譜條件：流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫:30 ℃；流動(dòng)相：A相：5 mmol/L碳酸銨 ，B相：100 mmol/L碳酸銨。 洗脫方式：梯度洗脫。

ICP-MS工作參數(shù)：射頻功率：1550 W；采樣深度：5 mm；半導(dǎo)體制冷溫度: -5℃；檢測(cè)器電壓（計(jì)數(shù)）1037.5 V；檢測(cè)器電壓（模擬）：-1787.5 V；冷卻氣流量：14 L/min；As質(zhì)量數(shù)：75；檢測(cè)模式：KED；采樣錐和截取錐：鉑錐；載氣：≥99.999%高純氬。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)量數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用 Origin 8.0 繪圖軟件繪圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

GB 5009.11-2014（第二篇 第二法 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法）中組分的保留時(shí)間和分離度主要通過(guò)控制流動(dòng)相的濃度和pH來(lái)調(diào)節(jié)。本文選擇的流動(dòng)相成分為碳酸銨，采用梯度洗脫的方式，既避免了配制組分復(fù)雜的流動(dòng)相，又不用調(diào)節(jié)pH。經(jīng)試驗(yàn)最終確定流動(dòng)相A：碳酸銨（5 mmol/L），流動(dòng)相B：碳酸銨（100 mmol/L）。洗脫程序見(jiàn)表1，分離效果見(jiàn)圖1。六種形態(tài)砷在10 min內(nèi)分離開(kāi)，保證了砷甜菜堿（AsB）與As（Ⅲ）分離度，確保測(cè)定干制野生菌時(shí)砷甜菜堿（AsB）含量過(guò)高對(duì)三價(jià)砷檢測(cè)的影響，且As（V）的峰面積明顯增加，提高了檢出限。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Steps for gradient elution of mobile phase

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的砷形態(tài)分離譜圖Fig.1 Speciation spectrum of arsenic in standard solution

2.2 食用菌中砷形態(tài)檢測(cè)的影響因素

2.2.1 樣品前處理方法的選擇 定量分析砷形態(tài)時(shí)，砷化合物的提取率是關(guān)鍵，本文選取姬菇、牛肝菌比較微波萃取-酸提取、加熱震蕩酸提取、超聲輔助-酸提取3種常見(jiàn)提取方式[15-18]，通過(guò)測(cè)定各形態(tài)砷含量的總和與樣品總砷含量的比值計(jì)算提取率，比較不同前處理方式的提取效果，見(jiàn)表2。

表2 前處理方式對(duì)砷化合物提取率的影響（n=7，X±S）Table 2 Effects of pretreatment methods on extraction rate of arsenic compounds (n=7, X±S)

干制食用菌含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、粗纖維等，樣品粉碎后顆粒偏大，特別容易因?yàn)闃悠非疤幚矸绞讲划?dāng)致使提取率偏低[19-20]。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品中As（Ⅲ）最難被提取，同時(shí)進(jìn)一步說(shuō)明尋找更為有效的提取方式的必要性。加熱震蕩酸提取和超聲輔助-酸提取因?yàn)樘崛l件相對(duì)溫和，無(wú)法完全破壞干制食用菌的有機(jī)成分，均不能有效地提取樣品中砷的形態(tài)化合物。結(jié)果見(jiàn)表2。微波萃取-酸提取方式可高效提取樣品中的砷的形態(tài)化合物，相比其他方式具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)選用微波萃取-酸提取對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

2.2.2 溫度對(duì)樣品提取的影響 本文借助可精準(zhǔn)控溫的微波消解技術(shù)，將提取溫度分別設(shè)置為70、80、90、100、110、120、130、140 ℃，通過(guò)測(cè)定各形態(tài)砷含量的總和與樣品總砷含量的比值，考察提取溫度對(duì)樣品中總砷提取率的影響。將微波提取的時(shí)間設(shè)定為15 min。結(jié)果如圖2所示。隨著溫度的提高，提取率逐步上升，溫度超過(guò)110 ℃時(shí)，提取率變化不明顯。從提取液形態(tài)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫度的提升主要影響的是As（Ⅲ）的提取效率，隨溫度升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；而As（V）則隨溫度的提高變化不明顯，但可觀察到在高溫范圍內(nèi)有緩慢的下降趨勢(shì)，初步推論 2 種不同價(jià)態(tài)的無(wú)機(jī)砷在高溫下有微量的轉(zhuǎn)化；溫度在110 ℃時(shí)，各形態(tài)砷總和與總砷測(cè)定結(jié)果一致，證實(shí)此溫度下總砷被有效提取出來(lái)。

圖2 溫度對(duì)總砷提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of total arsenic

2.2.3 酸度對(duì)樣品測(cè)定的影響 砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液以純水配制，樣品中砷的形態(tài)化合物提取溶液為HNO3，酸度不一致，而陰離子交換柱的分離效果受pH 影響較大。本研究綜合考慮提取液酸度對(duì)提取效率和色譜分離帶來(lái)的影響。以2%、3%、4%、5%、6%的硝酸溶液作為提取液，微波溫度設(shè)定為110 ℃時(shí)，時(shí)間15 min。結(jié)果見(jiàn)圖3。提取率隨著硝酸濃度而增加，當(dāng)濃度大于4%時(shí)，隨著酸度增加，提取率無(wú)明顯的變化。故將提取液的酸度確定為4%。將各個(gè)酸度的提取液重復(fù)上機(jī)50余次，發(fā)現(xiàn)樣液酸度對(duì)色譜分離效果基本沒(méi)有影響，分離效果見(jiàn)圖4。6種砷形態(tài)保留時(shí)間基本沒(méi)有發(fā)生偏移。再一次驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)色譜條件的優(yōu)越性。

圖3 酸度對(duì)總砷提取率的影響Fig.3 Effect of acidity on extraction rate of rate of total arsenic

圖4 不同酸度下樣液色譜分離效果圖Fig.4 Chromatogram of different acidity sample liquid

2.2.4 優(yōu)化提取條件的驗(yàn)證 樣品前處理既要完全提取樣品中的砷，又要保證樣品中的砷形態(tài)不發(fā)生改變。本文通過(guò)選取珍珠菌做提取條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，向其中加入0.25 mL， 1 μg/mL砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入25 mL，4%的硝酸，于110 ℃下微波提取15 min，上機(jī)測(cè)定，考察各形態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液在該提取條件下的提取效率和穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3，通過(guò)回收率發(fā)現(xiàn)，樣品中的砷形態(tài)化合物提取完全，AsB、 DMA、 AsC、MMA等有機(jī)砷化合物基本沒(méi)有轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)砷。As（Ⅲ）有些許轉(zhuǎn)化成As（V），但實(shí)驗(yàn)測(cè)定的無(wú)機(jī)砷是As（V）和As（ Ⅲ）的總和，故沒(méi)有影響。

表3 砷形態(tài)的加標(biāo)回收率及轉(zhuǎn)化情況Table 3 Arsenic speciation recovery and transformation

2.3 線性范圍及檢出限

用HPLC-ICP-MS分析測(cè)定干制食用菌中砷的形態(tài)，結(jié)果如下：方法在1～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好。根據(jù)檢出限的方法，測(cè)定砷甜菜堿 AsB、亞砷酸根As（Ⅲ）、二甲基砷 DMA、砷膽堿 AsC、一甲基砷MMA、砷酸根 As（V）的檢出限。按照前處理方式稱(chēng)樣量為0.5 g，定容量為25 mL，計(jì)算該方法各砷形態(tài)化合物的定量限分別為0.009、 0.012、0.013、0.010、0.011、0.010 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 方法的精密度

在實(shí)際產(chǎn)品中不容易找到同時(shí)存在6種砷化合物的樣品，本實(shí)驗(yàn)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.0 μg/L）上機(jī)進(jìn)行測(cè)試7次，結(jié)果見(jiàn)表4。亞砷酸根As（Ⅲ）、砷酸根As（V）、一甲基砷 MMA、二甲基砷 DMA、砷甜菜堿AsB、砷膽堿 AsC相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）均＜10%，方法精密度良好。

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取羊肚菌、黑松露兩種干制食用菌做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別向其中添加三個(gè)水平（0.80 、5.00、10.00 μg/L）的砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分析結(jié)果見(jiàn)表5。六種砷形態(tài)的加標(biāo)回收率分別在 83.6%～105.5%之間。滿足GB/T 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)。由此可見(jiàn)，在本實(shí)驗(yàn)選定的實(shí)驗(yàn)條件下，研究選用的儀器條件和實(shí)驗(yàn)方法的可靠性較高。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析測(cè)定

用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM1568b和GBW（E）100348進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果見(jiàn)表6，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)形態(tài)砷的總和，無(wú)機(jī)砷的含量均在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。說(shuō)明在本研究選用的儀器條件和實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度較高。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取市售的9種干制食用菌, 按所建立的HPLC-ICP-MS分析方法考察,其中的無(wú)機(jī)砷及其他砷形態(tài)分布情況詳見(jiàn)表7。結(jié)果表明：食用菌中砷以各種形態(tài)的方式存在，在考察砷污染情況的同時(shí)，更應(yīng)該細(xì)化的去了解它的價(jià)態(tài)組成，總砷含量高的樣品，有毒的無(wú)機(jī)砷含量不一定高，特別是松茸菌。

表4 6種砷形態(tài)線性回歸方程、檢出限及精密度（n=7，μg/L）Table 4 Standard curve, limits of detection and precision (relative standard deviation) for six arsenic species (n=7, μg/L)

表5 不同樣品中砷形態(tài)的加標(biāo)回收率Table 5 Recoveries of arsenic speciation in different samples

表6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中砷形態(tài)的測(cè)定結(jié)果（mg/kg）Table 6 Results of arsenic speciation in reference materials (mg/kg)

表7 樣品中不同價(jià)態(tài)砷的含量（mg/kg）Table 7 Contents of different valence states of arsenic in samples (mg/kg)

3 結(jié)論

HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)分析測(cè)定不同砷形態(tài)是目前較為先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)。本文選擇的流動(dòng)相組成和洗脫程序，解決了常用色譜條件下砷形態(tài)分離度較差，因樣液酸度的不同導(dǎo)致的色譜峰的漂移，As（V）檢測(cè)靈敏度低和分析時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。省去了樣品前處理時(shí)調(diào)節(jié)pH值這一繁瑣的步驟，大大簡(jiǎn)化了前處理的過(guò)程。前處理方式選擇了借助微波-酸提取的方法，過(guò)程簡(jiǎn)便、提取完全，砷的形態(tài)化合物基本沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)化。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取方式比較和提取條件的優(yōu)化，建立了微波-酸提結(jié)合HPLC-ICP-MS聯(lián)用測(cè)定干制食用菌中6種形態(tài)砷化合物的方法。最優(yōu)提取條件為提取溫度110 ℃、提取時(shí)間15 min。選用5和100 mmol/L碳酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫，可以在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了砷形態(tài)的分離，結(jié)果表明：該方法的峰分離效果好，線性關(guān)系（r＞0.9990），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）＜10.0% ，6種形態(tài)砷的定量限分別為0.009、0.012、0.013、0.010、0.011、0.010 mg/kg，以羊肚菌、黑松露兩種基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，砷形態(tài)的加標(biāo)回收率在83.6%～105.5%之間，采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性良好。所建立的方法靈密度高、準(zhǔn)確性好、精密度高、 前處理簡(jiǎn)單且提取效率高，滿足大批量，長(zhǎng)時(shí)間的干制食用菌中砷形態(tài)的定量分析要求。