云煙精油陶瓷膜分離組分的關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的相關(guān)性分析

許春平，曲利利，杜歡哲，楊華武

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001;

2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，湖南 長沙 410007

0 引言

膜分離技術(shù)是一種選擇性分離技術(shù)，其主要通過一系列陶瓷膜和有機(jī)膜過濾進(jìn)而實(shí)現(xiàn)不同粒徑分子混合物的分離[1-8].近年來，國內(nèi)一些學(xué)者利用該技術(shù)對煙葉成分進(jìn)行提取純化.如張靜楠等[9]將膜分離技術(shù)應(yīng)用于再造煙葉生產(chǎn)，可有效降低煙葉提取液中的煙葉碎渣和蛋白質(zhì)含量，改善和提高再造煙葉的感官評吸品質(zhì)；占小林等[10]以廣昌曬紅煙“黑老虎”煙葉為原料，采用生物酶法和膜分離技術(shù)分離純化“黑老虎”煙葉浸膏，發(fā)現(xiàn)添加“黑老虎”浸膏后，干草香、甜香、烘焙香、可可香、辛香、膏香等卷煙風(fēng)味特征均得到明顯提升.近年來，偏最小二乘回歸法(PLSR)可說明多個(gè)因變量和多個(gè)自變量之間的相關(guān)性，在生物信息學(xué)、食品科學(xué)、煙草科學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11].殷飛[12]采用PLSR等統(tǒng)計(jì)方法建立了清香型卷煙主流煙氣化學(xué)成分與感官指標(biāo)之間的相關(guān)性模型，結(jié)果表明，清香與巨豆三烯酮、花香與丁烯酸呈顯著正相關(guān)關(guān)系，酸香與油酸呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；周志磊[13]為分析煙氣主要甜味物質(zhì)的來源和形成過程，利用PLSR模型對煙草中46種成分與煙氣主要甜味和苦味物質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，13種成分與煙氣甜味呈顯著正相關(guān)關(guān)系，5種成分與煙氣甜味呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系.

相對氣味活度值(ROAV)是分析揮發(fā)性香氣成分的新方法.在分析古井貢酒、梨酒、竹酒、刺梨果渣、綠茶和雞蛋干的的關(guān)鍵香氣組分相關(guān)研究中，均通過比較香味物質(zhì)ROAV確定關(guān)鍵香氣組分，認(rèn)定ROAV大于1的指標(biāo)為決定香氣的關(guān)鍵因素[14-22].目前，利用ROAV衡量煙草中揮發(fā)性成分對煙草整體風(fēng)味貢獻(xiàn)程度的研究，以及利用膜分離技術(shù)分離云煙精油后進(jìn)行PLSR分析的研究鮮見報(bào)道.鑒于此，本研究擬通過GC-MS分析云煙精油陶瓷膜分離組分的香氣成分，利用主成分分析篩選出對香氣貢獻(xiàn)較大的關(guān)鍵組分，并計(jì)算ROAV以進(jìn)一步確定云煙精油的關(guān)鍵香味成分，進(jìn)而分析云煙精油關(guān)鍵香味成分與感官指標(biāo)的相關(guān)性，以期為云煙精油感官品質(zhì)的研究和控制提供理論依據(jù)，為卷煙增香提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

主要材料與試劑：YC7659云煙精油，上海祺源香精香料有限公司產(chǎn)；空白煙，湖南中煙有限責(zé)任公司產(chǎn)；無水乙醇(色譜純)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)；石油醚、乙酸乙酯均為色譜純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠產(chǎn).

主要儀器：BONA-GM-18型陶瓷膜分離實(shí)驗(yàn)機(jī)，濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；Agilent GC6890-MS5973N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)；EYELAN-2100型全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州瑞涵實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)；DLSB-5/10型低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)；HRH-186K香精注射機(jī)，北京慧榮和科技有限公司產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 云煙精油的膜分離準(zhǔn)確稱取50.00 g云煙精油于1000 mL燒杯中，加入500 mL體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇，待精油完全溶解后，用 50 nm 陶瓷膜去除固形顆粒雜質(zhì)，保留截留液和透過液.

1.2.2 云煙精油的柱層析分離處理1)樣品的預(yù)處理.將截留液M1、透過液M2旋蒸濃縮后，各稱取5 g濃縮物，分別加入1.5倍的硅膠粉，混勻，60 ℃條件下烘干.

2)裝柱.采用硅膠粉干裝法制備長度為 45 cm，直徑為5 cm的硅膠柱，將上述烘干后的樣品覆蓋于硅膠柱上部，再將少許的硅膠粉覆蓋于樣品之上，最后以棉花覆蓋.

3)洗脫.控制洗脫液的流速為10 mL/min，按照如下分段收集洗脫劑及其體積配比依次進(jìn)行洗脫，V(石油醚)V(乙酸乙酯)=201,101,51,21,11;V(乙酸乙酯)V(石油醚)=13，每組組分均取4個(gè)柱體積，以便收集各段不同組分的樣品，最后將硅膠柱層析洗脫分離后得到的產(chǎn)物進(jìn)行旋蒸濃縮.

1.2.3GC-MS分析條件色譜柱：HP-5MS色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣：He；載氣流速：3 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；分流比：101；進(jìn)樣量：1 μL；升溫程序：起始溫度50 ℃,以4 ℃/min 升至280 ℃；離子源：EI源；接口溫度：270 ℃；電子能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；采集模式：掃描；質(zhì)量掃描范圍：35～550 amu；檢索譜庫：NIST11庫.

1.2.4 關(guān)鍵香氣成分的確定利用SPSS軟件進(jìn)行主成分分析，根據(jù)相關(guān)系數(shù)列出相關(guān)矩陣，求出特征值及其相應(yīng)的特征向量，選出幾個(gè)較大的特征值及其特征向量，使其累積貢獻(xiàn)率在75%以上，并從中篩選出不同組分云煙精油的關(guān)鍵香氣物質(zhì).

進(jìn)一步利用ROAV確定樣品中揮發(fā)性成分對整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度，計(jì)算公式如下：

ROAVi≈(Ci/Cmax×Tmax/Ti)×100

其中，ROAVi為物質(zhì)i的相對香氣活性值；Ci為香氣成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Ti為香氣成分的香氣閾值；Cmax與Tmax分別為對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)和香味閾值.ROAV≥1的香味物質(zhì)被確定為關(guān)鍵香氣成分；0.1≤ROAV≤1 的香味物質(zhì)被確定為對總體風(fēng)味有貢獻(xiàn)的香氣成分.

1.2.5 感官分析將不同洗脫液配比下的流分在45 ℃條件下進(jìn)行真空濃縮，得到餾分濃縮物(1000 mL洗脫后的餾分濃縮為5 mL左右)，將餾分濃縮物按照體積分?jǐn)?shù)0.2%的比例用香精注射機(jī)添加10 μL到未加香加料的空白卷煙中，在溫度(22±2) ℃、相對濕度(60±5)%的恒溫恒濕箱中平衡24 h后進(jìn)行感官評吸，將僅加等量乙醇的空白煙作為對照.感官評吸小組從清甜香、木香、花香、干草香、辛香5種香韻評價(jià)樣品的感官屬性，感官特征的強(qiáng)度使用0～9分的等級進(jìn)行評分，其中0分代表無或不可察覺的強(qiáng)度，9分代表極高的強(qiáng)度.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析以關(guān)鍵香氣成分的ROAV作為X變量，以感官屬性評分為Y變量進(jìn)行相關(guān)性分析，建立云煙精油關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的PLSR模型，分析云煙精油關(guān)鍵香氣成分及感官品質(zhì)的影響，研究香氣成分與感官品質(zhì)之間的相關(guān)性和差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 云煙精油陶瓷膜分離組分的主成分分析

對截留液和透過液的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析(見表1)，分別提取截留液和透過液組分中前3個(gè)、前4個(gè)主成分，兩組組分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率可分別達(dá)到90.715%和78.352%.

表1 截留液和透過液成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

通過主成分分析，可分別推測出截留液和透過液對香味貢獻(xiàn)較大的香味物質(zhì)，得出兩組分關(guān)鍵香氣成分之間的差異.表2和表3分別為截留液和透過液的主成分載荷矩陣值.

由表2可知，截留液的第 1 主成分中二氫獼猴桃內(nèi)酯、3-羥基-β-大馬酮、亞麻酸乙酯、癸醛、棕櫚酸乙酯，第 2 主成分中巨豆三烯酮、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮，以及第3主成分中苯并噻唑、壬醛的載荷矩陣值較大，均達(dá)0.9以上.經(jīng)主成分分析得出，二氫獼猴桃內(nèi)酯、3-羥基-β-大馬酮、亞麻酸乙酯、癸醛、棕櫚酸乙酯、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、巨豆三烯酮、苯并噻唑、壬醛的載荷矩陣值較高，推測這些物質(zhì)可能為關(guān)鍵香氣成分.

表2 截留液主成分載荷矩陣值

由表3可知，透過液的第1主成分中棕櫚酸乙酯、亞麻酸乙酯、巨豆三烯酮的載荷矩陣值較大，均達(dá)到0.7以上；第2主成分中3-羥基-β-大馬酮、第3主成分中的1-己烯以及第4主成分中的檸檬酸三乙酯的主成分載荷矩陣也較大，達(dá)0.7以上.經(jīng)主成分分析得出，棕櫚酸乙酯、亞麻酸乙酯、巨豆三烯酮、3-羥基-β-大馬酮、1-己烯、檸檬酸三乙酯的載荷矩陣值較高，推測這些物質(zhì)可能為關(guān)鍵香氣成分.

表3 透過液主成分載荷矩陣值

2.2 云煙精油陶瓷膜分離組分的GC-MS分析

表4為不同洗脫液配比下截留液組分的GC-MS分析測試結(jié)果.由表4可知，截留液組分中共檢測出31種揮發(fā)性香味成分，主要包括酯類、醇類、酮類、烯類、烷烴類，其中，3-羥基-β-大馬酮、壬醛、3,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛、苯并噻唑的ROAV大于1.但是在云煙精油中并不含有苯并噻唑，其可能為柱層析過程中引入的雜質(zhì).因此，結(jié)合主成分分析和ROAV得出，3-羥基-β-大馬酮和壬醛為關(guān)鍵香味物質(zhì).

表4 不同洗脫液配比下截留液組分的GC-MS分析測試結(jié)果

表5為不同洗脫液配比下透過液組分的GC-MS分析測試結(jié)果.由表5可知，透過液組分中共檢測出20種揮發(fā)性香味成分，主要包括酯類、醇類、酮類、烯類、烷烴類,其中， 3-羥基-β-大馬酮、巨豆三烯酮的ROAV大于1，可確定其為關(guān)鍵香味物質(zhì).

結(jié)合表4和表5可知，與截留液相比，透過液組分中的揮發(fā)性成分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體偏低，這可能是截留的懸浮物和微粒吸附了大量脂溶性較好的揮發(fā)性成分所致[23-24].

2.3 感官評價(jià)結(jié)果分析

截留液組分的感官評價(jià)結(jié)果見表6，感官評價(jià)雷達(dá)圖見圖1a).在石油醚與乙酸乙酯配比為11的組分中，清甜香較明顯，微有干草香和辛香，這可能是3-羥基-β-大馬酮在這些組分中的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高且其ROAV大于1所致；在石油醚與乙酸乙酯配比為201的組分中，花香較明顯，稍有干草香和清香，這可能是由于壬醛在該組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高且其ROAV大于1所致.

透過液組分的感官評價(jià)結(jié)果見表6，感官評價(jià)雷達(dá)圖見圖1b).在石油醚與乙酸乙酯配比為13的組分中，清甜香較明顯，微有花香和干草香，這可能是3-羥基-β-大馬酮在該組分中的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高且其ROAV大于1所致，該分析結(jié)果與王鵬澤等[25]得出的3-羥基-β-大馬酮與清甜香韻呈極顯著正相關(guān)結(jié)果一致.

圖1 感官評價(jià)雷達(dá)圖

2.4 云煙精油陶瓷膜分離組分中關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的PLSR分析

圖2為關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的PLSR相關(guān)性載荷圖.由圖2a)可知，該模型中有5個(gè)感官指標(biāo)和2個(gè)關(guān)鍵香氣成分落在2個(gè)橢圓(R2=0.75和R2=1)之間，分別代表75%和100%的解釋方差，說明該模型能夠很好地解釋這些指標(biāo)[26-27].主要呈香成分3-羥基-β-大馬酮與清甜香距離較近，壬醛與花香距離較近，說明它們之間的相關(guān)性較強(qiáng).由圖2b)可知，有5個(gè)感官指標(biāo)和2個(gè)關(guān)鍵香氣成分落在2個(gè)橢圓(R2=0.75和R2=1)之間，分別代表75%和100%的解釋方差，說明該模型具有較好的解釋能力.主要呈香成分巨豆三烯酮與與辛香距離較近，3-羥基-β-大馬酮與清甜香距離較近，說明它們之間相關(guān)性較強(qiáng).

圖2 關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的PLS相關(guān)性載荷圖

3 結(jié)論

本研究采用GC-MS分析云煙精油陶瓷膜分離組分中的香氣成分，利用主成分分析篩選出對香氣貢獻(xiàn)度較大的關(guān)鍵組分，并通過ROAV進(jìn)一步確定了其關(guān)鍵香氣成分：在50 nm 云煙精油陶瓷膜截留液中，有31種不同的揮發(fā)性香味物質(zhì)，其中，3-羥基-β-大馬酮、壬醛為關(guān)鍵香氣成分，經(jīng)PLSR分析可知，清甜香與3-羥基-β-大馬酮的相關(guān)性較強(qiáng)，花香與壬醛的相關(guān)性較強(qiáng)；在50 nm云煙精油陶瓷膜透過液中，有23種不同的揮發(fā)性香味物質(zhì)，其中3-羥基-β-大馬酮、巨豆三烯酮為關(guān)鍵香氣成分，經(jīng)PLSR分析可知，辛香與巨豆三烯酮的相關(guān)性較強(qiáng)，清甜香與3-羥基-β-大馬酮的相關(guān)性較強(qiáng).該結(jié)論與ROAV分析中所篩查出的關(guān)鍵香氣成分相互印證，且所含香韻特征成分及分布與其感官評價(jià)結(jié)果吻合.