塔羅科血橙新系炭疽病發(fā)生情況調(diào)查及防治藥劑篩選

陳 泉，黃仁軍，馮小華，羊 練，何錦輝

（1.重慶三峽農(nóng)業(yè)科學院，重慶萬州 404155；2.重慶市萬州區(qū)植物保護與果樹技術(shù)推廣站，重慶萬州 404155）

塔羅科血橙新系（C.sinensis‘Tarocco’）是20世紀60 年代以來，依托農(nóng)業(yè)部柑橘948 項目、國家農(nóng)業(yè)部八五重點攻關(guān)計劃項目等，由中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所牽頭，聯(lián)合相關(guān)單位，從意大利引入三峽庫區(qū)試種，后從其實生后代中篩選出一個優(yōu)良變異單株，并在川渝多地進行了品種觀察和生態(tài)適應性評價。四川富順、資中，重慶萬州、長壽等地海拔500 m以下的區(qū)域，年日照時數(shù)達到1 300 h，最冷月氣溫6～8 ℃，少霜凍，2—4月氣溫平穩(wěn)，降雨量少，非常適宜塔羅科血橙著色和越冬，表現(xiàn)出了良好的優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)特性。因此，川渝兩地的塔羅科血橙逐步發(fā)展壯大，成為我國塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)，種植規(guī)模達5 萬公頃，形成獨具特色的地方農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)［1］。

在我國，炭疽病是柑橘發(fā)生最普遍的病害之一，在所有柑橘產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病重的果園病株率在90%以上，冬、春落葉率40%～50%，有的果園甚至絕收［2］。病菌可為害柑橘各個部位，具有弱寄生性和潛伏侵染特性，在貯藏期還可繼續(xù)發(fā)病引起爛果［3-4］。柑橘炭疽病可進行多次再侵染，常造成巨大經(jīng)濟損失［5-7］。

通常，國內(nèi)對柑橘炭疽病的防治常常與輪斑病、褐斑病、黑斑病、青霉病、綠霉病防治等結(jié)合起來，很少將柑橘炭疽病單獨作為防治指標。柑橘炭疽菌的主要寄主之一是甜橙類［4］，而塔羅科血橙新系就屬于甜橙類，是晚熟柑橘中的一類重要寄主。幾乎所有塔羅科血橙新系每年都要環(huán)割修剪2～3次，越來越多的新品種高換等造成的傷口，易引發(fā)侵染危害［8］。近年來，塔羅科血橙新系主產(chǎn)區(qū)炭疽病發(fā)生率有上升趨勢，且現(xiàn)有防治措施的防效低下，常常導致嚴重落果和采后貯藏病害，從而帶來直接經(jīng)濟損失。本研究對川渝地區(qū)塔羅科血橙炭疽病發(fā)病情況進行了調(diào)查，并開展了田間藥效試驗，以期為掌握柑橘炭疽病的發(fā)生情況和防治技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 炭疽樣品

2019—2021 年，在重慶長壽、開州、奉節(jié)、云陽、涪陵，四川資中、富順、內(nèi)江等地采集疑似柑橘炭疽病癥狀的樣品（果實、枝條、葉片），共收集樣品239份。

1.1.2 PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，煮沸后定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 供試藥劑

25%吡唑醚菌酯懸浮劑（山東康喬生物科技有限公司），97%礦物油［上海滬聯(lián)生物藥業(yè)（夏邑）股份有限公司］，80%代森錳鋅可濕性粉劑（利民化工股份有限公司），25%多菌靈可濕性粉劑（江蘇藍豐生物化工股份有限公司），25%咪鮮胺乳油（山東華陽農(nóng)藥化工集團）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原分離鑒定

菌株的分離采用組織分離方法，參考《植病研究法》（方中達編著，1979），單孢純化后，接種到PDA培養(yǎng)基斜面中，25 ℃培養(yǎng)長出菌落后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 直接PCR分子檢測

實驗用通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTATGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），采用直接PCR 進行擴增。直接PCR 反應體系：2×Taq PCR Master Mix15ul（2×H-TECH SYBR qPCR Mix videgene Cat.GDQ3003），上下游引物各0.5 μL，ddH2O 14 μL，菌絲少量。反應條件為：預變性95 ℃3 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，44 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增出條帶后，用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，核酸染料為低毒的Gel Red 染料。

1.2.3 ITS序列比對

將陽性菌株的PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工生物公司單向測序，對測得序列刪除引物序列，在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行Blast 檢索，比對菌株是否為炭疽菌。

1.2.4 致病性鑒定

選取健康的塔羅科血橙新系果實，用75%乙醇表面消毒5 min，無菌水清洗2～3 次，然后用無菌紗布擦干。針刺果實腰部果皮10針，在針刺處接種菌株菌絲塊，25 ℃下保濕培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。每菌株重復3次，以針刺果實不接種菌絲塊為對照。

根據(jù)檢測結(jié)果，計算發(fā)病率。

發(fā)病率（%）＝檢測為陽性的樣品數(shù)/檢測樣品總數(shù)×100

1.2.5 田間藥效試驗

2019—2020 年，選擇萬州區(qū)甘寧鎮(zhèn)南橋村炭疽病發(fā)病嚴重的天奧果園開展田間藥效試驗，樹齡10年，長勢一致。試驗設(shè)置6 個處理（見表1），每個處理重復3 次，共計18 個小區(qū)，每個小區(qū)5 株柑橘樹，隨機區(qū)組排列，小區(qū)間及試驗田四周設(shè)有保護行。采用電動噴霧器噴霧，先噴清水對照，然后噴試驗藥劑。噴施藥劑時按照濃度由低到高的順序進行，換藥前清洗干凈噴霧器。2019 年6 月12 日、6 月28日、7 月15 日各噴藥1 次，采前20 d 再噴1 次，其他管理正常進行。在2019 年8 月2 日、2020 年1 月22 日調(diào)查防效，以及采后10 d、采后20 d、采后30 d 分別調(diào)查果實發(fā)病情況，試驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0 軟件分析。每樹分東南西北4 個方位，隨機調(diào)查2 個枝條的全部葉片及5 個果實，調(diào)查葉片和果實上病斑情況，計算病情指數(shù)。

表1 塔羅科血橙新系炭疽病田間藥劑篩選試驗設(shè)計

病情分級標準：0 級，無?。? 級，每葉（果）1～5 個病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積5%以下；3級，每葉（果）6～10個病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積6%～10%；5 級，每葉（果）11～15 個病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積11%～25%；7 級，每葉（果）16～20 個病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積26%～50%；9級，每葉（果）21個病斑以上或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積51%以上。

病情指數(shù)=∑［（各級病葉（果）數(shù)×相對級數(shù)值）］/［調(diào)查總?cè)~（果）數(shù)×9］×100；

防治效果（%）=（空白對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/空白對照區(qū)病情指數(shù)×100。

1.2.6 采后發(fā)病情況調(diào)查

2月25日進行采收，每樹分東南西北4個方位，隨機采收5個果實，每個處理共采收100個果實，每個處理的果實放入1個果框，室內(nèi)通風陰涼處貯藏，分別在采后10 d、20 d、30 d調(diào)查果實發(fā)病情況，計算病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 塔羅科血橙炭疽病發(fā)病情況調(diào)查

經(jīng)病原分離、PCR 檢測和致病性鑒定，在239 份樣品中，有151 份樣品感染了炭疽病，檢出率為63.18%，其中89份表現(xiàn)為強致病性，發(fā)病部位涉及葉片、枝梢、果實等，尤以葉片為重，主要表現(xiàn)為葉片尤其嫩葉上有圓形斑點，子實體輪紋狀排列，以及葉尖出現(xiàn)急性“V”字形失水枯萎等兩種癥狀；果實發(fā)病其次，一般表現(xiàn)為成熟期果實出現(xiàn)干疤、腐爛等癥狀。發(fā)病嚴重的會造成樹勢衰弱，成熟期病果多，落葉、落果嚴重，或引發(fā)貯藏期腐爛。

從采樣地點來看，塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)均表現(xiàn)出一定程度的發(fā)病，發(fā)病率最低的是重慶開州的44.83%，最高為重慶萬州的90.24%，這一結(jié)果也與筆者走訪調(diào)查結(jié)果相符。根據(jù)筆者走訪調(diào)查和室內(nèi)檢測結(jié)果，重慶地區(qū)的柑橘炭疽病發(fā)病率顯著高于四川地區(qū)，可能與塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)縣處于三峽庫區(qū)地帶有關(guān)。萬州區(qū)為塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)，近年來規(guī)模化發(fā)展迅速，種植水平較高，果實品質(zhì)優(yōu)良，但因三峽庫區(qū)高溫高濕、寡日照的氣候條件，以及炭疽病弱寄生性和潛伏侵染特點，萬州塔羅科血橙發(fā)病較其他地區(qū)嚴重。

表2 塔羅科血橙炭疽病發(fā)病情況調(diào)查

2.2 田間藥效試驗

2.2.1 不同處理對塔羅科血橙炭疽病的防治效果

病情調(diào)查在2019 年8 月2 日和2020 年1 月22 日進行，這時病情已經(jīng)穩(wěn)定，病斑癥狀明顯，較容易辨別區(qū)分。由調(diào)查數(shù)據(jù)可知（表4），試驗所選用的藥劑對葉片和果實炭疽病均有防效，均表現(xiàn)為處理4＞處理1＞處理5＞處理2＞處理3。

在兩次調(diào)查中，處理4 用25%咪鮮胺乳油配合97%礦物油的防效最高，葉片防效達85.83%，果實防效85.03%，顯著高于其他處理；處理1 用25%苯醚甲環(huán)唑乳油配合97%礦物油的防效其次，葉片防效為78.81%，果實防效80.22%；兩次調(diào)查防效最低的都是處理3（80%代森錳鋅可濕性粉劑），分別為50.74%、54.90%。在8月2日進行的葉片發(fā)病調(diào)查中，經(jīng)過三次施藥后，各處理炭疽病病情指數(shù)較對照有明顯降低，且處理間差異極顯著；在1 月22 日塔羅科血橙成熟期的調(diào)查中，處理2與處理5之間的防效差異不顯著。兩次調(diào)查中，處理4用處理5同樣的藥劑復配礦物油，防效均提升15%以上，處理1 的防效也較處理2 提升了15%以上，由此可見，柑橘炭疽病的防治，要選對藥劑，科學選用復配藥劑或助劑，殺菌效果更好。

表3 不同藥劑處理對炭疽病田間防效

2.2.2 果實采后發(fā)病情況

由表4 可知，采后常規(guī)貯藏10 d 后調(diào)查果實發(fā)病情況，各處理的病情指數(shù)均很低，對照也僅為20.1，防治效果均在50%以下。分析可能與塔羅科血橙新系果實降酸慢、成熟晚、耐貯藏等性能有關(guān)，采后10 d，整體發(fā)病較少，因而藥劑防治效果很難表現(xiàn)。隨著貯藏時間延長，采后20 d 的調(diào)查結(jié)果顯示，各處理的防效與田間調(diào)查趨勢一致，表現(xiàn)為處理4＞處理1＞處理5＞處理2＞處理3；對照處理的病情指數(shù)迅速增加，各處理之間的防效差異極顯著，處理4 的防效最高，達82.65%，處理3 的防效最低，為58.59%。采后30 d 的調(diào)查結(jié)果顯示，處理4 的防效仍然最高，為82.47%，較處理5 高14%，二者差異極顯著；處理1 的防效較處理2高15%，二者差異極顯著。

表4 塔羅科血橙新系果實采后炭疽病發(fā)病情況

3 小結(jié)與討論

本研究開展了四川、重慶兩地的塔羅科血橙炭疽病發(fā)生情況調(diào)查及防治藥劑篩選試驗。我們對柑橘炭疽病的傳統(tǒng)認知是發(fā)病普遍，危害嚴重，防治較易。針對塔羅科血橙這一優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)，因種植區(qū)域有限，使得塔羅科血橙成為只能在我國川渝兩地規(guī)模發(fā)展的獨特產(chǎn)業(yè)，研究其炭疽病發(fā)病情況及防治方法很有必要。研究結(jié)果顯示，塔羅科血橙的炭疽病發(fā)生普遍，檢出率為63.18%，其中有89 份表現(xiàn)為強致病性；大部分調(diào)查區(qū)域的發(fā)病程度不嚴重，一般只引起部分葉片有葉枯（急性型）、葉斑（慢性型）等癥狀，沒有造成嚴重損失，鮮少有專門防治措施跟進。研究結(jié)果還顯示，炭疽病在后期引起的采后貯藏病害不容小視，如不進行藥劑防治，采后30 d 的病情指數(shù)可達71.3；25%咪鮮胺乳油配合97%礦物油噴灑4 次后，綜合防效可達85%以上，效果最好，對采后發(fā)病的防治效果也顯著，防效可達82.47%，可以有效減輕炭疽病造成的采后腐爛。綜合本研究結(jié)果，同一藥劑復配礦物油在適宜季節(jié)使用，可以有效提高防效15%左右，是較為理想的選擇，可以推廣使用。在生產(chǎn)實踐中還應注意藥劑輪換使用，根據(jù)樹體情況進行營養(yǎng)補充，配合好修剪、控水等措施，方能達到最理想的防控效果。