超聲波輔助法提取核桃青皮總黃酮工藝及抗氧化活性研究

呂名蕊，張 旋，樊 璐，嚴(yán) 燁，惠衛(wèi)甲,楊 雯

1.西安悟空檢測科技有限公司 (西安 710000) 2.中糧工科(西安)國際工程有限公司 (西安 710082)

核桃青皮，亦稱胡桃青皮或青龍衣，是核桃的外果皮，目前核桃青皮尚未得到有效的利用，一般都是作為廢棄物堆放在田間、地頭或是溝邊，不僅會(huì)造成資源的極大浪費(fèi)，還會(huì)嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境[1,2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)核桃青皮含有的黃酮類化合物等在醫(yī)學(xué)上有抗癌、抗菌和防衰老等功效[3-5]。核桃青皮成分分析研究表明核桃青皮黃酮類化合物含量豐富。目前，對核桃青皮中黃酮提取工藝的研究報(bào)道較少，通過對核桃青皮黃酮的提取，不僅能將核桃青皮資源很好的利用起來，而且也避免其分解產(chǎn)物污染環(huán)境。

利用超聲波[6]產(chǎn)生的高速、劇烈的空化效應(yīng)和震蕩力，破壞植物細(xì)胞壁，使溶劑充分深入到細(xì)胞中，達(dá)到很好的提取效果。本文采用超聲波輔助法從核桃青皮中提取黃酮，通過單因素試驗(yàn)，分別研究浸取時(shí)間、超聲功率、超聲溫度、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素對黃酮提取率的影響。通過單因素試驗(yàn)確定四個(gè)主要因素設(shè)計(jì)一個(gè)四因素三水平的正交試驗(yàn)，確定提取核桃青皮黃酮的最佳工藝條件。并對核桃青皮中黃酮對羥基自由基和DPPH自由基的清除作用進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

新鮮核桃青皮，產(chǎn)于河南鄭州，-20 ℃下冷藏；蘆丁，購自南京蘇朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司；無水乙醇、NaOH、AlNO3、NaNO2、Tris、鄰二氮雜菲、鹽酸、七水合硫酸亞鐵、Vc、DPPH、30%過氧化氫試劑，均為分析純試劑。

KQ-100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-3600型紫外分光光度計(jì)，Shimadzu公司；XPE105DR型分析天平，梅特勒-托利多國際有限公司；LGL-10C型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；DK-8 AX型恒溫水浴槽，上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黃酮提取液的制備

將核桃青皮清洗干凈，在-60 ℃下冷凍干燥48 h，粉碎，過40目篩，室溫下儲(chǔ)存干燥器中備用。采用超聲輔助法乙醇浸取核桃青皮中的總黃酮，浸取液抽濾、濃縮，得到黃酮提取液，待測。

1.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在60 ℃下烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品[7-9](98%純度) 8.80 mg，用70%的乙醇溶解，定容10 mL，搖勻后獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度為0.862 4 g/L。

準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，依次加入70%的乙醇10.0 mL和5%的NaNO2溶液2.0 mL，搖勻靜置5 min后，加入 10%的 Al(NO3)3溶液2.0 mL，靜置6 min，再加入5%的NaOH溶液20.0 mL，用70%的乙醇定容，混勻顯色15 min，510 nm 處測定溶液的吸光值 A。以溶液的吸光值A(chǔ)對蘆丁濃度C 作圖(圖1)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合回歸方程見公式(1)，根據(jù)公式(1)計(jì)算核桃青皮中黃酮的含量，由公式(2)得出核桃青皮中總黃酮的提取率。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

Y=13.189 9X-0.007 5(R2=0.999 2)

(1)

(2)

1.2.3核桃青皮黃酮含量的測定

準(zhǔn)確稱取核桃青皮粉末1.00 g，用不同料液比、不同浸取時(shí)間、不同超聲功率、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇和不同提取溫度進(jìn)行浸取，抽濾后，將濾液定容至100 mL，得到核桃青皮提取物。向核桃青皮提取物中依次加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉，利用鋁離子與黃酮類化合物上的羥基發(fā)生顯色絡(luò)合反應(yīng)[10,11]，記錄其510 nm處吸光度值A(chǔ)，根據(jù)公式(1)計(jì)算核桃青皮總黃酮的含量，由公式(2)計(jì)算核桃青皮總黃酮的提取率。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 料液比對黃酮提取率的影響

在超聲功率350 W、超聲溫度30 ℃、浸取時(shí)間30 min、溶劑為70%的乙醇的條件下，分別將1.00 g核桃青皮粉末溶于10、15、20、25、30、35 mL 70%的乙醇中進(jìn)行黃酮的提取，完成后測定并計(jì)算黃酮提取率[12]。

1.2.4.2 浸取時(shí)間對黃酮提取率的影響

在超聲功率350 W、超聲溫度30 ℃、料液比(g/mL)1∶30、溶劑為70%乙醇、浸取時(shí)間10、20、30、40、50、60 min的條件下對核桃青皮中黃酮進(jìn)行提取，完成后測定并計(jì)算黃酮提取率。

1.2.4.3 超聲功率對黃酮提取率的影響

在料液比(g/mL)1∶30、超聲溫度30 ℃、浸取時(shí)間60 min、溶劑為70%乙醇、超聲功率(200、250、300、350、400、450 W)的條件下對核桃青皮中的黃酮進(jìn)行提取，完成后測定并計(jì)算黃酮提取率。

1.2.4.4 超聲溫度對黃酮提取率的影響

在6個(gè)100 mL圓底燒瓶中，分別加入1.00 g核桃青皮粉末和30 mL 70% 乙醇，超聲功率400 W，浸取時(shí)間60 min，考察不同溫度(30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)對核桃青皮中的黃酮進(jìn)行提取，完成后測定并計(jì)算黃酮提取率。

1.2.4.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

分別稱取1.00 g核桃青皮粉末置于6個(gè)100 mL圓底燒瓶中，在料液比(g/mL)1∶30、超聲功率400 W、浸取時(shí)間60 min、超聲溫度50 ℃條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%)對核桃青皮中的黃酮進(jìn)行提取，完成后測定并計(jì)算黃酮提取率。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇超聲功率、浸取時(shí)間、料液比及乙醇體積分?jǐn)?shù)作為考察因素，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

1.2.6核桃青皮黃酮的體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 核桃青皮黃酮對羥基自由基清除能力的測定

采用水楊酸法[13,14]測定核桃青皮黃酮的·OH清除能力。以蒸餾水為參比溶液，測定體系510 nm處的吸光度Ax，A0為所測溶液濃度為0時(shí)溶液的吸光度，同時(shí)用水代替H2O2溶液測得吸光度Ay，以VC作為對照，OH清除率用公式(3)計(jì)算得到，3次平行試驗(yàn)求清除率的平均值。

(3)

1.2.6.2 核桃青皮黃酮對DPPH自由基清除能力的測定

核桃青皮黃酮對DPPH自由基清除能力的測定在Kumaran課題組[15]實(shí)驗(yàn)方法上稍加修改。取一定濃度黃酮提取液2 mL于10 mL 的棕色比色管中，加入無水乙醇1 mL，0.1 mol/L的DPPH 自由基的無水乙醇溶液3 mL，搖勻，室溫避光下，反應(yīng)30 min，記錄溶液517 nm處的吸光度A，以蒸餾水代替待測液作為空白，以VC作為對照。樣品對DPPH 自由基的清除能力用公式(4)計(jì)算得到，3次平行試驗(yàn)求清除率的平均值。

(4)

式中，A0表示2 mL 水和3 mL DPPH 自由基反應(yīng)液的吸光度；Ai表示2 mL 樣品和3 mL DPPH 自由基反應(yīng)液的吸光度；Aj表示2 mL 樣品和3 mL 無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比對黃酮提取率的影響

由圖2可知，料液比(g/mL)在1∶10～1∶20時(shí)，核桃青皮中黃酮隨著溶劑提取量的增加提取率逐漸減小，料液比(g/mL)在1∶20～1∶30提取率逐漸增高，料液比(g/mL)為1∶30時(shí)提取率達(dá)到最大，之后再增加溶劑的量提取率直線下降。溶劑較少時(shí)，黃酮提取率較低，可能是由于部分黃酮未被浸取出來。隨著溶劑的量不斷增加，核桃青皮粉末與溶劑的接觸面積不斷增大，反應(yīng)充分進(jìn)行，核桃青皮中黃酮溶出較多。當(dāng)料液比(g/mL)為1∶30，繼續(xù)增加溶劑的量，色素和雜質(zhì)的溶出率增加，而對黃酮的提取率并沒有明顯增加。因此，提取核桃青皮中黃酮的料液比(g/mL)的最佳條件為1∶30。

圖2 料液比的確定

2.1.2浸取時(shí)間對黃酮提取率的影響

由圖3可知，在10～60 min 范圍內(nèi)，核桃青皮總黃酮提取率隨著浸取時(shí)間的增加呈升高趨勢，在40～50 min范圍內(nèi)變化最明顯，50 min之后趨于平緩。這表明在浸取時(shí)間達(dá)到一定值后，在超聲波的機(jī)械振動(dòng)和空化的共同作用下，核桃青皮細(xì)胞壁的破裂越來越徹底，總黃酮溶出率大大提高；而隨著浸取時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)的其他物質(zhì)的溶出率也增加，黃酮類物質(zhì)的損失和氧化也隨之增加。因此，提取核桃青皮中黃酮的最佳浸取時(shí)間為50 min。

圖3 浸取時(shí)間的確定

2.1.3超聲功率對黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲功率為200～450 W范圍內(nèi)，核桃青皮中總黃酮的提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在超聲功率為400 W時(shí)，總黃酮的提取率達(dá)到最大值，為7.13%。初步分析其原因可能超聲功率過大容易使試驗(yàn)溫度出現(xiàn)猛然升高，從而導(dǎo)致部分黃酮類物質(zhì)分解，同時(shí)乙醇容易揮發(fā)，從而導(dǎo)致總黃酮的提取率下降。因此。核桃青皮中黃酮的提取超聲功率不宜過大，400 W較為適宜。

圖4 超聲功率的確定

2.1.4超聲溫度對黃酮提取率的影響

由圖5可知，超聲溫度為30 ℃～ 55 ℃范圍內(nèi)，核桃青皮中總黃酮的提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在超聲溫度為40 ℃時(shí)，總黃酮的提取率達(dá)到最大值。這可能是由于溫度低于40 ℃時(shí)，核桃青皮中的黃酮未被浸取完全，從而導(dǎo)致提取率較低；而溫度高于40 ℃時(shí)，黃酮類物質(zhì)易發(fā)生氧化從而其結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致提取率降低。因此，最佳超聲溫度為40 ℃。

圖5 超聲溫度的確定

2.1.5乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

由圖6可知，在40%～50%范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大越有利于核桃青皮中黃酮的提?。辉?0%～90%范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，黃酮的提取率越低。這可能是由于黃酮是一種極性較大的物質(zhì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)太高或太低的情況下都不利于黃酮的提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)小不能很好的浸取核桃青皮中的總黃酮；乙醇體積分?jǐn)?shù)過大，會(huì)溶解核桃青皮中其他物質(zhì)與黃酮發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致黃酮提取率下降。因此，提取核桃青皮黃酮的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇超聲功率、浸取時(shí)間、料液比及乙醇體積分?jǐn)?shù)作為考察因素，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析見表2。

表1 因素水平表

由表2可知，各因素對核桃青皮黃酮提取率的影響程度為：B>A>D>C，即浸取時(shí)間的影響最大，其它因素依次為超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比。最佳工藝條件為A3B2C3D2，即為超聲功率為450 W、浸取時(shí)間40 min、料液比(g/mL)為1∶35、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了證實(shí)最佳工藝條件下黃酮的提取率的重現(xiàn)性，在最佳工藝條件下做了3組平行實(shí)驗(yàn)，測得核桃青皮總黃酮的提取率分別為：7.32%、7.33%和7.31%，平均提取率為7.32%，比正交實(shí)驗(yàn)中的最大提取率7.30%高。因此，超聲波輔助提取核桃青皮黃酮的最佳工藝條件為：超聲功率為450 W、浸取時(shí)間40 min、料液比(g/mL)為1∶35、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.4 體外抗氧化試驗(yàn)

2.4.1核桃青皮黃酮對羥基自由基清除能力的測定

以Vc作為對照，分析了核桃青皮總黃酮對·OH的清除能力[16]，測定結(jié)果見圖7。由圖7可知，核桃青皮總黃酮的質(zhì)量濃度在0.10～0.50 mg/mL范圍內(nèi)，其對·OH的清除能力隨濃度的增加而增強(qiáng)。在檢測濃度范圍內(nèi)，核桃青皮總黃酮對·OH的清除能力高于Vc。當(dāng)核桃青皮中總黃酮濃度達(dá)到0.50 mg/mL時(shí)，黃酮對羥基自由基的清除率為66.00%，Vc對羥基自由基的清率為65.45%，兩者非常接近。核桃青皮總黃酮在0.10 ～ 0.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，對·OH的清除能力強(qiáng)于Vc，具有良好的抗氧化能力。

圖7 核桃青皮中黃酮與VC對·OH 清除作用

2.4.2核桃青皮黃酮對DPPH自由基清除能力的測定

以Vc作為對照，分析了核桃青皮總黃酮對DPPH自由基的清除能力，測定結(jié)果見圖8。由圖8可知，核桃青皮總黃酮的質(zhì)量濃度在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，其對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加迅速增強(qiáng)。核桃青皮總黃酮濃度從0.01 mg/mL增加到0.05 mg/mL時(shí)，其對DPPH自由基的清除率從34.73%上升到89.86%，高于同濃度下Vc對DPPH自由基的清除能力，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖8 核桃青皮中黃酮與VC對DPPH自由基清除作用

3 結(jié)論

本文對超聲波輔助法提取核桃青皮中黃酮影響因素的單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了分析。正交實(shí)驗(yàn)顯示四種主要因素對核桃青皮黃酮提取率的影響大小為：浸取時(shí)間>超聲功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比。超聲波輔助法提取核桃青皮黃酮的最佳工藝條件為：浸取時(shí)間40 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比(g/mL)1∶35、超聲功率450 W，最佳工藝條件下核桃青皮中黃酮的提取率為7.32 mg/g。在0.10～0.50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，核桃青皮總中黃酮對·OH的清除能力明顯高于Vc；在0.01～0.05 mg/mL濃度范圍內(nèi)，其對DPPH自由基的清除率高于同濃度下Vc對DPPH自由基的清除能力，核桃青皮總黃酮具有良好的抗氧化能力，且隨濃度增加，其抗氧化能力增強(qiáng)。通過對核桃青皮總黃酮的提取及抗氧化活性的研究，為其在食品化學(xué)、藥物化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)等領(lǐng)域新型天然抗氧化劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。