Ⅰ型和Ⅱ型酮病奶牛系統(tǒng)性炎癥和肝損傷狀態(tài)的分析與比較

陳喜瑩，范明赫，白洪旭，李 偉，宋玉祥，李心慰，劉國文，王 哲，杜希良，李小兵

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

奶牛酮病是圍產(chǎn)期高發(fā)和頻發(fā)的一種以能量代謝障礙為基礎(chǔ)的營養(yǎng)代謝紊亂性疾病。產(chǎn)后奶牛能量攝入不能滿足能量需求，導(dǎo)致機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，發(fā)生體脂動員，生成大量游離脂肪酸(NEFA)，在肝臟中不完全氧化生成大量酮體(β-羥丁酸(BHBA)、乙酰乙酸和丙酮)并釋放到血液中。當(dāng)血液中酮體含量高于1.2 mmol/L時，便可診斷為酮病[1]。酮病奶牛通常表現(xiàn)為精神沉郁、消化機(jī)能紊亂、產(chǎn)奶量下降、體質(zhì)量減輕等，嚴(yán)重影響奶牛的免疫性能、生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益[2]。另外，酮病增加其他疾病的患病風(fēng)險，包括乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、真胃變位和胎衣不下等[3]。因此，酮病的防治對于圍產(chǎn)期奶牛健康至關(guān)重要。

根據(jù)酮病發(fā)病機(jī)理的差異，HOLTENIUS等[4]將奶牛酮病分為Ⅰ、Ⅱ型酮病。Ⅰ型酮病又稱饑餓型酮病，主要由于泌乳對糖的需求超過糖異生的能力，血漿中葡萄糖(Glu)和胰島素的濃度降低，進(jìn)而引起脂類不完全氧化作用加強(qiáng)，導(dǎo)致酮體生成增加。Ⅰ型酮病奶牛以低血糖、低胰島素、高NEFA和高血酮為特征，多發(fā)生于產(chǎn)后的3～6周[2]；Ⅱ型酮病與人類Ⅱ型糖尿病相似，其病理基礎(chǔ)是脂肪肝和胰島素抵抗(IR)，由于脂質(zhì)在肝細(xì)胞中蓄積誘發(fā)胰島素抵抗，導(dǎo)致肝臟對脂質(zhì)完全氧化過程減弱，使酮體生成增加。此外，肝臟胰島素耐受性降低減少了Glu的吸收，故Ⅱ型酮病以高血糖或血糖正常、高胰島素和高NEFA血癥為特征，且常伴發(fā)乳房炎等其他疾病，常發(fā)生于產(chǎn)后早期(泌乳5～15 d)[5]。

已有研究表明Ⅰ型酮病奶牛血清中包括結(jié)合珠蛋白(HP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎性相關(guān)因子的濃度增加[6]，說明Ⅰ型酮病奶牛存在系統(tǒng)性炎癥，然而Ⅱ型酮病奶牛是否存在類似情況尚不清楚。另外，有研究報道患有肝損傷的產(chǎn)后奶牛更容易發(fā)生Ⅱ型酮病[7]。肝臟是糖代謝的重要器官，肝臟受損，機(jī)體出現(xiàn)糖代謝異常，胰島素作用減弱，機(jī)體呈現(xiàn)不同程度的胰島素抵抗，導(dǎo)致血糖不能及時進(jìn)入細(xì)胞供能[8]。因此，肝功能受損引起的糖代謝紊亂可能是引起機(jī)體發(fā)生IR，誘發(fā)Ⅱ型酮病的重要因素。雖然已有報道Ⅰ型酮病奶牛表現(xiàn)為肝損傷[9]，但Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛肝損

傷程度是否存在差異并不清楚。因此，本試驗通過分析與比較Ⅰ、 Ⅱ型酮病血液中炎性和肝功能相關(guān)指標(biāo)的差異，剖析不同類型酮病奶牛的發(fā)病機(jī)理，以期為酮病的診斷、防治及監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物荷斯坦奶牛均選自吉林省長春市某奶牛場，所有奶牛接受常規(guī)體檢確保沒有其他并發(fā)癥的存在。根據(jù)Glu、BHBA和NEFA的含量選擇健康奶牛20頭、Ⅰ和Ⅱ型酮病奶牛各20頭。健康奶牛的判斷標(biāo)準(zhǔn)包括：無異常的臨床表現(xiàn)、各項臨床指征(呼吸、脈搏、體溫等)均正常，血液生化指標(biāo)BHBA<1.2 mmol/L、Glu>3.0 mmol/L；Ⅰ型酮病奶牛的判定標(biāo)準(zhǔn)為BHBA>1.20 mmol/L、Glu<2.80 mmol/L；Ⅱ型酮病奶牛的判定標(biāo)準(zhǔn)為BHBA>1.20 mmol/L、Glu>3.0 mmol/L[10]。

1.2 樣本采集通過臨床診斷，分別篩選健康和Ⅰ、Ⅱ型酮病的奶牛各20頭作為試驗對象，于清晨飼喂前頸靜脈無菌采集試驗牛的血液樣本。所采靜脈血置于10 mL肝素鈉抗凝劑內(nèi)用于分離血漿，10 mL置于未加抗凝劑的離心管中用來分離血清，3 800×g離心10 min，收集血漿(血清)，做好標(biāo)記后，-20℃短期保存，-80℃長期保存(6個月內(nèi))。

1.3 試劑血液樣品中Glu、NEFA和BHBA含量用Hitachi自動生化分析儀以及商用檢測試劑盒檢測；檢測急性期反應(yīng)蛋白HP、SAA的 ELISA 檢測試劑盒購自CUSABIO 公司；炎性因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、TNF-α 的ELISA 檢測試劑盒購自CUSABIO 公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛臨床參數(shù)和能量代謝指標(biāo)的比較如表1所示，Ⅰ型酮病奶牛的體況評分(BCS)顯著低于健康奶牛和Ⅱ型酮病奶牛，而Ⅱ型酮病奶牛的BCS高于健康奶牛和Ⅰ型酮病奶牛；Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的產(chǎn)奶量均顯著低于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛產(chǎn)量更低。此外，Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的NEFA和BHBA均顯著高于健康奶牛，而血糖(Glu)水平均顯著低于健康奶牛，但Ⅱ型酮病奶牛的Glu水平高于Ⅰ型酮病。結(jié)果表明，Ⅰ型酮病奶牛存在能量負(fù)平衡；Ⅱ型酮病常發(fā)生于肥胖奶牛，表現(xiàn)為血液高NEFA和高Glu。

表1 健康奶牛與Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛臨床參數(shù)和能量代謝指標(biāo)比較(n=20)

2.2 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛急性期反應(yīng)蛋白的比較如圖1所示，Ⅰ、Ⅱ型酮病中急性期反應(yīng)蛋白SAA和HP的質(zhì)量濃度均顯著高于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的SAA和HP的質(zhì)量濃度顯著高于Ⅰ型酮病奶牛。結(jié)果表明，酮病發(fā)生時，機(jī)體存在損傷并觸發(fā)急性反應(yīng)，且Ⅱ型酮病奶牛的損傷程度要高于Ⅰ型酮病奶牛。

圖1 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛血清中急性期反應(yīng)蛋白SAA(A)和HP(B)的質(zhì)量濃度

2.3 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛炎性相關(guān)指標(biāo)的比較如圖2所示，Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量均顯著高于健康奶牛，且這些促炎因子在Ⅱ型酮病奶牛血液中高于Ⅰ型酮病奶牛；抗炎因子IL-10的水平在Ⅰ、Ⅱ型酮病中顯著低于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的IL-10水平低于Ⅰ型酮病奶牛。結(jié)果表明，酮病發(fā)生時，機(jī)體存在系統(tǒng)性炎癥，且Ⅱ型酮病奶牛的炎性水平更高。

圖2 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛血清中促炎因子IL-1β(A)、IL-6(B)和TNF-α(C)以及抑炎因子IL-10(D)的質(zhì)量濃度比較

2.4 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛與健康奶牛肝臟功能相關(guān)指標(biāo)的比較檢測Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的肝損傷指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)酮病奶牛血液AST和ALT的活性顯著高于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的AST和ALT活性高于Ⅰ型酮病奶牛(圖3)；表明酮病奶牛表現(xiàn)為肝損傷，且Ⅱ型酮病奶牛的肝損傷程度更加嚴(yán)重。

圖3 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛中肝損傷相關(guān)指標(biāo)AST(A)和ALT(B)的活性比較

3 討論

酮病是普遍發(fā)生于奶牛圍產(chǎn)期的一種代謝性疾病，其發(fā)生與產(chǎn)后初期采食恢復(fù)緩慢及泌乳早期體內(nèi)的能量無法滿足泌乳需求所致的能量負(fù)平衡有關(guān)[11]。雖然Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛中均存在能量負(fù)平衡，但是由于Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的發(fā)病機(jī)理不同，其病理變化和代謝狀態(tài)可能存在差異[2]。因此本試驗比較分析了Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的急性期反應(yīng)蛋白(HP和SAA)、炎性相關(guān)指標(biāo)(IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α)和肝損傷指標(biāo)(ALT和AST)的差異，發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛均存在急性反應(yīng)、系統(tǒng)性炎癥和肝損傷，但Ⅱ型酮病奶牛更加嚴(yán)重。本試驗為解析酮病，尤其是Ⅱ型酮病的發(fā)病機(jī)理提供數(shù)據(jù)支撐。

糖脂代謝紊亂是酮病奶牛的代謝特征[12]，本試驗也發(fā)現(xiàn)酮病奶牛血液NEFA和BHBA的濃度顯著高于正常奶牛，而高濃度的NEFA和BHBA具有脂毒性，能夠引起急性反應(yīng)[13]。SAA和HP是由肝細(xì)胞分泌到血清中的急性反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染或損傷時，可迅速升高[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)酮病奶牛的SAA和HP水平均高于正常奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的SAA和HP水平均高于Ⅰ型酮病奶牛；這表明Ⅱ型酮病奶牛的機(jī)體損傷程度要高于Ⅰ型酮病奶牛。

急性反應(yīng)常伴隨著炎性反應(yīng)的發(fā)生，另外有研究表明奶牛Ⅱ型酮病與人類Ⅱ型糖尿病相似[15]，且促炎細(xì)胞因子可作為評價Ⅱ型糖尿病嚴(yán)重程度的關(guān)鍵指標(biāo)。本試驗中，酮病奶牛的促炎因子水平均高于正常奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的促炎因子水平高于Ⅰ型酮病奶牛，表明Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛均存在炎性反應(yīng)，且Ⅱ型酮病奶牛的炎性反應(yīng)要高于Ⅰ型酮病奶牛，這與急性反應(yīng)蛋白的表達(dá)是一致的。促炎因子TNF-α和IL-1β等在肝臟脂質(zhì)代謝障礙引發(fā)脂肪肝的生成中發(fā)揮著重要的作用[16]。高水平TNF-α或IL-1β能夠?qū)е赂闻K胰島素抵抗，使血漿中的NEFA升高[17]。同時，促炎因子能夠抑制脂肪細(xì)胞中脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性[18]，從而使脂肪細(xì)胞脂解增強(qiáng)，提高血液NEFA含量。高濃度NEFA具有脂毒性能夠使巨噬細(xì)胞分泌多種促炎因子，繼而加劇肝臟和脂肪組織的脂代謝紊亂，形成一個惡性循環(huán)[19]。本試驗中，Ⅱ型酮病奶牛血液炎性因子和Glu水平高于Ⅰ型酮病奶牛，說明Ⅱ型酮病奶牛的系統(tǒng)性炎癥和糖脂代謝更加嚴(yán)重，也說明Ⅱ型酮病奶牛存在嚴(yán)重的IR，而這可能是Ⅱ型酮病更難治療的潛在原因。

ALT和AST是衡量肝損害程度的特征性指標(biāo)[20]。正常情況下，AST在血液中的含量較少，但是當(dāng)肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重時，AST的活性會升高并大量釋放到血液中[21]。ALT主要貯存在肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，能夠反映肝細(xì)胞的完整性。孫菲菲等[22]研究表明高濃度的NEFA、BHBA以及炎性因子會引起肝損傷；與此研究一致的是，酮病奶牛存在明顯的肝損傷，且Ⅱ型酮病奶牛的肝損傷指標(biāo)AST和ALT的活性也顯著高于Ⅰ型酮病和健康奶牛，說明Ⅱ型酮病奶牛肝損傷更加嚴(yán)重，這可能是高濃度的NEFA和BHBA以及大量的促炎因子引起的。同時，肝損傷也會加重Ⅱ型酮病，增加治療難度。

總之，酮病發(fā)生時機(jī)體存在系統(tǒng)性炎癥和肝損傷，而且與Ⅰ型酮病相比，Ⅱ型酮病奶牛炎性反應(yīng)和肝損傷更加嚴(yán)重。因此，了解酮病奶牛炎性因子和肝功能指標(biāo)的變化情況，能夠更好地區(qū)分不同類型的酮病，對不同類型的酮病進(jìn)行針對性治療提供依據(jù)。