microRNA調(diào)控病毒與宿主相互作用機制研究進展

趙學亮，劉海金，王興龍，蕭 颯，黨如意，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

MicroRNAs(miRNAs) 是一類長度為19～24 nt的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，通過與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)或5′UTR特異性結(jié)合，降解或抑制mRNA的翻譯，進而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[1]。LEE等[2]在1993年利用定位克隆法從秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中首次發(fā)現(xiàn)可階段性調(diào)控胚胎后期發(fā)育的小分子RNA lin-4。隨后REINHART等[3]在2000年發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控線蟲發(fā)育的基因let-7，這是第2個調(diào)控時序性發(fā)育的小分子，也是一個負調(diào)控因子。此后，國內(nèi)外學者于2001年同時報道了在人、線蟲和果蠅中鑒定到近百個小RNA分子，并統(tǒng)一正式命名為microRNA(miRNA)[4-6]，至此，開啟了miRNA研究新的里程碑。截至目前，Sanger miRBase(http://www.mirbase.org/ Release 22.1，October 2018)數(shù)據(jù)庫中收錄的miRNA數(shù)目已達到38 589條，包括動物、植物和病毒在內(nèi)的271個物種[7]，其中病毒的miRNA數(shù)量：320條前體miRNA和530條成熟體miRNA。每1條miRNA都可以靶向調(diào)控多個mRNA，同樣，一個靶基因也可同時被多個miRNA調(diào)控。據(jù)報道，在真核生物中有60%～70%編碼基因受miRNA的調(diào)控[8]，并廣泛參與細胞增殖、分化、發(fā)育、代謝和凋亡等多種生理活動。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的調(diào)控作用幾乎貫穿真核生物整個生命活動，并可通過直接作用于病毒，間接調(diào)控先天免疫、細胞凋亡及干擾素等途徑參與抗病毒感染[9-10]。在病毒與宿主共進化的過程中，發(fā)現(xiàn)病毒基因組也可以編碼miRNA，并在病毒-宿主相互作用中發(fā)揮關鍵作用[11]。因此，鑒定宿主來源/病毒來源關鍵miRNA，探究其在病毒感染、復制和抗病毒過程中發(fā)揮的作用，可為病毒致病機制的深入研究提供思路?，F(xiàn)將系統(tǒng)梳理近年來參與調(diào)控病毒miRNA的研究進展，重點關注miRNA調(diào)控病毒逃避宿主天然免疫應答，為研究miRNA調(diào)控病毒與宿主相互作用提供參考和依據(jù)。

1 miRNA的生物合成

miRNA的生物合成比較復雜，首先miRNA在細胞核轉(zhuǎn)錄生成primary miRNA(pri-miRNA)，然后被RNA酶Ⅲ Drosha-DGCR復合體切割成60～70 nt的3′末端具有核苷酸突出、5′末端具有磷酸基的莖環(huán)中間體，即precursor miRNA(pre-miRNA)。隨后，轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5識別pre-miRNA的3′端并與之結(jié)合，通過Ran-GTP途徑出核運輸至細胞質(zhì)。最后，Dicer酶(雙鏈RNA專一性內(nèi)切酶)識別pre-miRNA雙鏈的3′及5′末端信號，將其剪切成約22 nt的成熟雙鏈miRNA。最初，單獨的miRNA沒有功能且易降解，miRNA只有與Ago蛋白、雙鏈RNA結(jié)合蛋白和Dicer核糖核酸內(nèi)切酶等結(jié)合形成RNA誘導基因沉默復合物RISC(RNA-induced silencing complex，RISC)才能發(fā)揮功能[12]。通常，miRNA作用機制有2種，即靶向轉(zhuǎn)錄抑制和降解，前者主要存在于動物中，后者則多見于植物中[13]。miRNA種子序列(seed sequence)在RISC的介導下與其靶基因mRNA 3′UTR區(qū)結(jié)合，從而發(fā)揮負調(diào)控靶基因的作用[14]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA除結(jié)合mRNA的3′UTR區(qū)之外，還可以結(jié)合5′UTR、啟動子或編碼區(qū)發(fā)揮功能。

此外，miRNA的表達具有嚴格的組織特異性和時空性，人們把在肌肉中特異性表達的miRNA命名為myomiRs家族，包括miR-1、miR-133a和miR-206等，這些基因僅在心肌和骨骼肌中表達[15]。在線蟲中，miR-35～miR-41基因家族僅存在Caenorhabditiselegans胚胎和幼蟲期，在其他發(fā)育階段未發(fā)現(xiàn)[6]；而miR-209～miR-295只在小鼠胚胎期表達[16]?？傊?，在真核生物不同發(fā)育階段miRNA有其特定的表達模式。隨著新一代測序技術(next generation sequencing，NGS)的發(fā)展，miRNA也越來越多的被發(fā)現(xiàn)，在病毒感染方面，對miRNA關注的焦點逐漸轉(zhuǎn)向作用機制研究。據(jù)報道，宿主和部分病毒均可編碼miRNA，病毒感染細胞后，宿主miRNA可以直接與病毒基因組相互作用抑制病毒復制[17]，在病毒和宿主共進化的過程中，病毒編碼的miRNA通過直接與宿主mRNA結(jié)合，影響宿主翻譯效率，抑制免疫應答，參與逃避宿主抗病毒免疫應答，促進病毒復制[18]。

2 宿主源miRNA的功能

在病毒感染過程中，宿主細胞編碼的miRNA表達模式發(fā)生很大變化，同時這些差異表達的miRNA可通過調(diào)節(jié)先天性免疫、調(diào)控細胞凋亡和干擾病毒復制因子等途徑進一步調(diào)節(jié)宿主基因的表達以抵抗病毒感染，此外，miRNA還可以作為病毒性疾病診斷和預后的生物標志[19]。目前，雖然病毒感染過程中宿主源miRNA表達調(diào)控機制尚未完全清晰，但可以肯定的是宿主源miRNA與病毒感染密切相關[20]。

2.1 miRNA調(diào)控宿主先天免疫先天免疫應答是在生物進化過程中宿主受到病毒入侵時，為保護自身穩(wěn)定而形成的免疫系統(tǒng)。當病毒在宿主細胞復制時，天然免疫細胞會識別病原靶分子，即病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。宿主細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體PAMPs來抵抗病毒感染[21]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在復雜的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，并可通過JAK/STAT、NF-κB和Wnt等信號通路誘導干擾素和炎性細胞因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)宿主免疫應答水平。DUAN等[22]研究發(fā)現(xiàn)，gga-miR-27b-3p通過靶向調(diào)控SOCS3/SOCS6增強IFN-1表達，提高STATs基因轉(zhuǎn)錄水平以及STAT1在701位酪氨酸的磷酸化水平，抑制傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)復制。在宿主適應能力與免疫選擇壓力的雙重作用下，病毒形成了一套完整的拮抗干擾素通路的策略，使得病毒有效的在機體內(nèi)復制。例如，在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、仙臺病毒(Sendai virus，SeV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)中過表達內(nèi)源性miR-1225-3p可通過IFN/JAK/STAT信號通路抑制IFN產(chǎn)生，從而促進病毒感染。干擾miR-1225-3p后，則使其靶基因GAB3過表達，增強干擾素應答和病毒觸發(fā)的先天性免疫激活抵抗病毒感染[23]。H5N1感染A549細胞后，miR-324-5p的表達下調(diào)，機制研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p通過JAK1-STAT3途徑靶向負調(diào)控子CUEDC2誘導ISGs表達，IFN-I和IFN-Ⅲ的大量表達進而抑制H5N1復制[24]。此外，miR-30可通過IFN/JAK/STAT通路靶向抑制SOCS1/SOCS3表達，來抑制流感病毒(avian influenza virus，AIV)感染[25]。WU等[26]通過H5N1 AIV感染A549細胞后，miRNA136上調(diào)表達并促進RIG-I介導的天然免疫活化，抵抗病毒感染。CHEN等[27]通過對NDV感染的DF-1細胞進行深度測序，發(fā)現(xiàn)gga-miR-451和gga-miR-199-5p促進了NDV復制，而gga-miR-19b-3p和gga-miR-29a-3p抑制了NDV復制。進一步的功能研究表明，gga-miR-19b-3p可靶向RNF11和ZMYND11激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導，促進炎性細胞因子產(chǎn)生來抑制NDV復制[28]。在豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染的宿主中發(fā)現(xiàn)miR-221-5p以劑量依賴性方式抑制病毒復制，干擾內(nèi)源性miR-221-5p會增強病毒復制。過表達miR-221-5p后可通過激活NF-κB信號傳導，在病毒感染期間上調(diào)IFN-β的表達來抑制PEDV[29]。在感染登革熱病毒(Dengue virus，DENV)、西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)和寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)等黃病毒家族的宿主中，miR-34可抑制Wnt/β-catenin信號傳導的能力而抵抗病毒感染，并證實miR-34增強了IRF3的磷酸化，誘導宿主細胞釋放IFN-I。并發(fā)現(xiàn)Wnt和IFN信號通路之間的交叉點發(fā)生在糖原合酶激酶3β(GSK3β)-TANK結(jié)合激酶1(TBK1)結(jié)合點，誘導IRF3磷酸化并啟動下游IFN信號傳導，從而抵抗黃病毒感染[30]。

2.2 miRNA調(diào)控病毒復制及染毒細胞凋亡病毒感染宿主后，染毒細胞通過凋亡影響病毒復制過程。然而，這種凋亡方式是抑制病毒復制還是促進病毒復制，至今還有一定的爭議。據(jù)報道，TAKAHASHI等[31]在感染SeV的細胞中發(fā)現(xiàn)LGP2表達量增加900倍，LGP2與miR-106b競爭結(jié)合TRBP，上調(diào)4種關鍵凋亡基因Caspases-2、Caspases-8、Caspases-3和Caspases-7來影響病毒復制。IBDV感染DF-1細胞后，gga-miR-16-5p通過靶向Bcl-2活化Caspases-9和Caspases-3觸發(fā)凋亡機制，促進病毒復制[32]。miRNA通過細胞凋亡影響病毒復制多見于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，miR-122通過下調(diào)/上調(diào)靶基因cyc-lin G(1)的表達來響應HBV感染，調(diào)節(jié)細胞凋亡，干擾p53對病毒的抑制，促進HBV的復制[33]。miR-340-5p直接與編碼激活轉(zhuǎn)錄因子7(ATF7)的mRNA結(jié)合，通過與熱休克蛋白A成員1B(HSPA1B)相互作用來促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，影響HBV復制[34]。miR-325-3p通過直接降低AQP5的表達來抑制Huh7-1.3和HepG2.2.15細胞的增殖并誘導其凋亡，發(fā)揮抗HBV的作用[35]。miR-211-5p可與lncRNA F11-AS1結(jié)合負調(diào)控NR1I3的表達，過表達miR-211-5p后抑制HepG2.2.15細胞凋亡，促進HBV復制增殖[36]。ZHANG等[37]利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染豬子宮內(nèi)膜上皮細胞，鑒定出54個差異表達的miRNA，其中有2個miRNA通過p53途徑參與了細胞凋亡機制。在感染馬立克病病毒(Marek's disease virus，MDV)的雞淋巴瘤細胞中，gga-miR-155可通過靶向RORA基因抑制細胞凋亡，促進病毒復制增殖[38]。WANG等[39]通過構(gòu)建AIV感染A549細胞模型，發(fā)現(xiàn)miR-34a能與Bax基因3′UTR區(qū)結(jié)合，在病毒感染過程中抑制細胞凋亡，影響子代病毒復制，發(fā)揮抗病毒作用。另外，AIV感染能夠誘導宿主細胞miRNA-29c表達，干擾Bcl-2家族抗凋亡蛋白表達，進而促進AIV誘導細胞凋亡進程[40]。

2.3 miRNA干擾病毒復制因子一般而言，宿主miRNA不直接靶向結(jié)合病毒基因，而是通過作用于病毒受體等病毒復制所需的因子，通過調(diào)控基因表達間接干擾病毒復制。例如，DEF細胞衍生的外泌體miR-148a-5p通過負調(diào)控TLR3表達來促進鴨坦布蘇病毒復制[41]。在NDV中，gga-miR-455-5p通過靶向SOCS3抑制病毒復制，同樣miR-375可與靶基因ELAVL4結(jié)合抑制病毒復制[42-43]。miR-218可調(diào)節(jié)山羊外周血單個核細胞中的信號淋巴細胞活化分子(SLAM)介導小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)感染[44]。miR-c89通過靶向宿主類視黃醇X受體β基因抑制PRRSV的復制[45]。宿主miR-1307促進VP3降解，增強先天免疫應答來抑制口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)復制[46]。在人類疾病中，miR802通過調(diào)節(jié)肝癌細胞中SMARCE1的表達誘導HBV的復制和免疫逃逸等[47]。miR-130a通過依賴ATG5的自噬途徑靶向ATG5來調(diào)節(jié)宿主的抗病毒應答和HCV復制[48]。宿主miR340作為一種關鍵的抗病毒分子，在甲型流感和其他RNA病毒感染后，miR340下調(diào)表達，負調(diào)控RIG-I和OAS2表達，從而介導抗病毒應答[49]。

有趣的是，細胞編碼的miRNA也可能促進病毒復制，例如，EV71誘導的miR-124通過直接靶向IL-6R和STAT3來抑制IL-6R和STAT3的表達，并顯著降低宿主抗病毒免疫應答[50]。單純皰疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)感染細胞后，miR-373表達上調(diào)，通過特異性靶向IRF1 mRNA抑制干擾素調(diào)節(jié)因子表達，從而導致IFN-I和ISGs的下游降低，抑制先天免疫應答，最終促進HSV-1復制[51]。

3 病毒源miRNA

3.1 編碼miRNA的病毒種類除宿主細胞可以編碼miRNA外，部分病毒也可編碼miRNA來促進病毒復制，抑制宿主基因表達，創(chuàng)造有利于病毒的微環(huán)境逃避宿主免疫應答。2004年，PFEFFER等[52]首次發(fā)現(xiàn)愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)基因組能夠編碼miRNA，其加工過程與真核生物相同，目前已發(fā)現(xiàn)EBV共編碼25個miRNA，表達44種成熟miRNA[53-56]。隨后，越來越多的病毒被證實能夠編碼miRNA。比如，HBV[57]、HSV-1[58]、MDV[59]、家蠶核型多角體病毒(bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)[60]、埃博拉病毒(Ebola virus disease virus，EBOV)[61]、AIV[62]、傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)[63]、鴨腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)[64]、牛皰疹病毒5型(bovine herpesvirus 5，BoHV-5)[65]、人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)[66]等(表1)。由于HIV-1豐度低，生物學特性未知以及不同實驗室報道結(jié)果不一，HIV可編碼miRNA這一結(jié)論并沒有被廣泛接受。盡管miRNA在調(diào)控病毒與宿主相互作用機制方面取得了相當大的進展，但目前對病毒編碼miRNA的鑒定還存在一定困難，尤其在動物病毒中，其產(chǎn)生的過程還需要進一步明確，其詳細功能和作用機制仍需深入研究。據(jù)報道，目前僅有數(shù)十種病毒編碼數(shù)百個miRNA，通過與宿主靶mRNA結(jié)合，調(diào)控病毒復制過程、生命周期來逃避宿主天然免疫應答。

表1 病毒編碼miRNA的靶點及功能

3.2 病毒miRNA對宿主的調(diào)控

3.2.1調(diào)控宿主信號通路 EBV miR-BHRF1-2-5p直接靶向IL-1受體1(IL1R1)并阻斷IL-1β，從而激活NF-κB通路[67]。白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)編碼的miRNA(WSSV-miR-22)可以通過靶向宿主STAT基因來促進WSSV感染，并通過JAK/STAT-TEP1/TEP2信號通路介導病毒感染的免疫反應[68]。MDV1-miR-M4-5p可靶向結(jié)合LTBP1蛋白，負調(diào)控TGF-β信號通路的活化，從而促進c-Myc的表達，誘導腫瘤發(fā)生[69]。病毒編碼的miRNA還可通過JAK-STAT信號通路及細胞因子促進病毒復制，進而逃避宿主天然免疫應答[70]。

3.2.2調(diào)控抗病毒免疫應答 自然殺傷細胞(natural killer cell，NK cell)與細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)對染毒細胞的殺傷是宿主對病毒防御的重要模式。EBV miR-BART2-5p可靶向抑制MICB在宿主細胞中的表達，通過抑制宿主NK細胞激活，從而逃避免疫識別[55]。猴病毒40(simian virus 40，SV40)編碼的miRNA可靶向作用病毒編碼的T抗原，干擾CTL對染毒細胞的敏感性，利用SV miRNA逃避宿主免疫系統(tǒng)[71]。人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)編碼的miRNA(HCMV miR-UL112-3p)可以抑制內(nèi)源性Toll樣受體2(toll-like receptor2，TLR2)的表達，調(diào)控NF-κB通路，使病毒感染細胞逃過免疫監(jiān)視[72]。

3.2.3調(diào)控細胞自噬與凋亡 在機體固有免疫中，宿主誘導染毒細胞凋亡是宿主阻止病毒擴散的一種方式。但病毒編碼的miRNA會調(diào)控細胞周期，降低促凋亡蛋白表達，抑制細胞凋亡。在EBV感染中，EBV miRNA可調(diào)控宿主凋亡蛋白表達以抗細胞凋亡，如低水平的潛伏膜蛋白1(latent memgrane protein1，LMP1)可通過影響NF-κB信號通路，抑制p53誘導的凋亡[73]。BmCPV-miR-1通過上調(diào)BmIAP基因表達抑制細胞凋亡，為病毒復制提供更好的環(huán)境[74]。

4 小結(jié)與展望

目前，在病毒與宿主相互作用方面，miRNA已被認為是發(fā)揮關鍵作用的調(diào)控因子，近年來，隨著生命科學研究的發(fā)展，越來越多新的宿主和病毒編碼miRNA被發(fā)現(xiàn)，但由于miRNA靶基因的多樣性及其在不同細胞和生物學過程中發(fā)揮不同作用，因此，在免疫應答及其調(diào)控過程中的機制較為復雜。目前，對于miRNA的研究只是冰山一角，仍然有大量未知序列及其生理功能等很多空白有待進一步探索。例如，目前對miRNA的研究多依賴于芯片及測序技術，對未知基因組序列的生物較少報道。如何突破現(xiàn)有方法和技術瓶頸，是揭開miRNA之謎的關鍵。miRNA的翻譯及特異性miRNA組合對宿主免疫反應調(diào)節(jié)影響的研究是一個重大挑戰(zhàn)。病毒感染導致宿主miRNA差異表達的機制以及miRNA如何通過ceRNA網(wǎng)絡介導病毒與宿主之間的聯(lián)系。目前有關miRNA的研究多在學術界，僅有少量的商品化miRNA產(chǎn)品，如何更好地把理論研究和臨床應用相結(jié)合，仍有待深入探索。此外，miRNA作為傳染性疾病的早期診斷標識物和治療靶點也將是miRNA應用的一個新思路。相信隨著科學研究的不斷深入，miRNA調(diào)控病毒與宿主相互作用中所存在的盲區(qū)終將清晰，未來將可能在病毒相關疾病的防制方面帶來新的突破。