前列腺素E2介導(dǎo)由金黃色葡萄球菌引起的奶牛子宮內(nèi)膜組織損傷

劉 昆，曹金山，劉 博，丁玉玲，裴 樂(lè)，毛 偉*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

哺乳動(dòng)物子宮在產(chǎn)后或交配的過(guò)程中易受到細(xì)菌的感染而導(dǎo)致不孕癥或慢性子宮內(nèi)膜炎。細(xì)菌感染產(chǎn)后奶牛子宮時(shí)，約20%的奶牛患子宮內(nèi)膜炎，嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶量與再孕率[1-2]。臨床上常用于治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的方法主要通過(guò)抗生素治療，但無(wú)法提高該類疾病的治愈率和患病奶牛的再孕率[3]。

哺乳動(dòng)物子宮微環(huán)境穩(wěn)態(tài)對(duì)胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要，同時(shí)該穩(wěn)態(tài)的維持與子宮內(nèi)膜疾病的發(fā)生及患病后的用藥治療效果直接相關(guān)[4-6]。據(jù)報(bào)導(dǎo)，前列腺素E2(PGE2)可通過(guò)調(diào)控結(jié)締組織生長(zhǎng)因子及具有血管再生作用的IL-8的表達(dá)，在人子宮內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。PGE2由花生四烯酸經(jīng)一系列酶的催化作用產(chǎn)生，催化產(chǎn)生的酶類物質(zhì)，除磷脂酶外還包括環(huán)氧合酶-1(cyclooxygenase-1，COX-1)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)。有研究指出,在奶牛發(fā)生子宮內(nèi)膜炎的過(guò)程中，COX-2的mRNA表達(dá)量顯著高于健康奶牛[8];另外，PECCHI等[9]提出PGE2是前列腺素類化合物中與各種炎癥性疾病關(guān)聯(lián)最密切的一種前列腺素，這表明PGE2不僅可修復(fù)子宮內(nèi)膜而且與子宮內(nèi)膜炎的炎癥過(guò)程相關(guān)，而且細(xì)菌感染很大程度上誘導(dǎo)了奶牛子宮內(nèi)膜中PGE2的合成[10]。

常見(jiàn)的感染奶牛子宮內(nèi)膜的細(xì)菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與一些厭氧型細(xì)菌[11]。在細(xì)菌性子宮內(nèi)膜炎中，奶牛子宮內(nèi)膜受到細(xì)菌感染后引起炎癥反應(yīng)，細(xì)菌及細(xì)菌毒素誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子與趨化因子。同時(shí)，受損或死亡的細(xì)胞所釋放的內(nèi)源性分子通過(guò)激活免疫細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答，這一類內(nèi)源性分子被稱為損傷相關(guān)因子。高遷移率蛋白(high-mobility grope box protein 1，HMGB-1)與透明質(zhì)酸(hyaluronidase，HA)可作為多種炎癥過(guò)程中的損傷相關(guān)因子。HMGB-1是一種重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞內(nèi)DNA的轉(zhuǎn)錄、重組、翻譯和修飾[12]。HMGB-1的釋放與壞死細(xì)胞相關(guān)，該過(guò)程可簡(jiǎn)要描述為壞死的細(xì)胞釋放的染色質(zhì)被遞呈細(xì)胞上的膜受體識(shí)別后釋放到細(xì)胞外[13],說(shuō)明HMGB-1與組織損傷相關(guān)。透明質(zhì)酸酶廣泛分布于多種組織及細(xì)胞內(nèi)，在發(fā)生炎癥的過(guò)程中，透明質(zhì)酸酶由聚合的大分子物質(zhì)，分解為小分子物質(zhì)，并且分解的小分子物質(zhì)常與其他蛋白相結(jié)合，形成透明質(zhì)酸酶結(jié)合蛋白(hyaluronidase binding protein,HABP)，其中，形成的透明質(zhì)酸酶結(jié)合蛋白1(hyaluronidase binding protein-1,HABP-1)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14]。

本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織作為研究對(duì)象，經(jīng)熱滅活金黃色葡萄球菌刺激，與COX-2抑制劑共孵育，通過(guò)ELISA、q-PCR、Western blot、免疫熒光及病理切片觀察，檢測(cè)內(nèi)源性PGE2在降低后，金黃色葡萄球菌所引起的奶牛子宮內(nèi)膜組織損傷因子HMGB-1與HABP-1表達(dá)水平及其組織的損傷是否發(fā)生變化。旨在通過(guò)闡述PGE2對(duì)細(xì)菌所引起的奶牛子宮內(nèi)膜組織損傷的調(diào)控作用，為臨床中合理使用前列腺素類藥物治療細(xì)菌性子宮內(nèi)膜炎而導(dǎo)致的不孕癥，繼而提高奶牛繁殖能力提供新的疾病防制學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料本試驗(yàn)使用的金黃色葡萄球菌為內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎臨床分離株,由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室保存(鑒定證書編號(hào)：SYS110018)；Mueller-Hinton(M-H)肉湯培養(yǎng)基(OXOID，England);COX-2抑制劑NS-398、CAY10404(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI);DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco，China);青鏈霉素(Gibco，China);兩性霉素B(Generay,China);Western blot試驗(yàn)所用一抗HABP-1、HMGB-1(Abbexa,UK),二抗山羊抗兔IgG抗體(Abcam,USA);RNA提取試劑盒(Axygen Scientific,USA);PGE2ELISA檢測(cè)試劑盒(Cayman,Ann Arbor,MI);反轉(zhuǎn)錄試劑Primer ScriptRTMaster Mix(TaKaRa,Japan);SYBR Green Master(Rox,Germany);引物由Invitrogen公司合成。

1.2 奶牛子宮內(nèi)膜組織的體外培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[7]方法與內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室建立的優(yōu)化培養(yǎng)條件，培養(yǎng)方法：取健康奶牛子宮角，置于含5%青鏈霉素、2%兩性霉素的PBS中，4℃處理30 min。在無(wú)菌的環(huán)境下縱向剪開奶牛子宮角，暴露子宮內(nèi)膜后，將奶牛子宮內(nèi)膜剪成條索狀并置于含2%青鏈霉素、1%兩性霉素的PBS中4℃處理20 min，并重復(fù)此步驟。將處理后的奶牛子宮內(nèi)膜組織剪成直徑約2 mm，厚度約1 mm的塊狀組織，放入到含2%青鏈霉素、5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)液。

1.3 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)與熱滅活金黃色葡萄球菌的制備使用M-H培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)基D600 nm值的不同，繪制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線，以確定金黃色葡萄球菌達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的時(shí)間。將達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌5 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，使用無(wú)菌PBS重懸浮后置于85℃水浴中，處理30 min。

1.4 熱滅活金黃色葡萄球菌體外刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織與抑制劑的處理方法培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜組織后3 d，將含5%胎牛血清與青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，更換為DMEM/F12培養(yǎng)基，饑餓處理后8 h，再將培養(yǎng)基更換為僅含5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中分別加入無(wú)菌PBS，1×108CFU/mL熱滅活的金黃色葡萄球菌處理8 h。在培養(yǎng)基中加入濃度均為1×10-7MNS-398、CAY10404處理15 min后，加入1×108CFU/mL熱滅活金黃色葡萄球菌，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)8 h后收集奶牛子宮內(nèi)膜組織與培養(yǎng)基上清液。

1.5 奶牛子宮內(nèi)膜組織RNA提取及反轉(zhuǎn)錄使用Axgeny RNA提取試劑盒提取不同處理組的奶牛子宮內(nèi)膜組織中RNA(具體步驟見(jiàn)說(shuō)明書)，并檢測(cè)提取的RNA濃度。將所有RNA樣品均稀釋至終質(zhì)量濃度為100 mg/L。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：ddH2O 5 μL,cDNA 3 μL，5×Primer Mix 2 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min,85℃ 5 s。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng)熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR GreenMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，模板2.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s,60℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。引物信息如表1所示。

表1 引物信息

1.7 Western blot檢測(cè)研磨奶牛子宮內(nèi)膜組織，置于1.5 mL離心管中，加入組織裂解液與磁珠后，在磁珠研磨機(jī)中裂解3 min，冰上靜置5 min后，14 000 r/min 離心10 min，收集上清液，測(cè)定所提取蛋白的濃度，并與5×蛋白緩沖液進(jìn)行混合。電泳：配制12% SDS-PAGE膠，每孔蛋白質(zhì)量為20 μg。以80 V電壓，恒壓電泳至條帶到膠的末端后停止電泳。切下蛋白大小為31,42,23 kDa附近的SDS-PAGE膠。轉(zhuǎn)膜：按照正極—電轉(zhuǎn)海綿—濾紙—PVDF膜—SDS-PAGE膠—濾紙—電轉(zhuǎn)海綿—負(fù)極的順序裝配，調(diào)整轉(zhuǎn)膜儀電壓至25 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min。封閉：取出PVDF膜放入到5%脫脂乳中室溫孵育2 h。一抗孵育：按照β-actin 1∶3 000,HABP-1、HMGB-1為1∶1 000的比例進(jìn)行稀釋，與電轉(zhuǎn)后的PVDF膜在4℃條件下過(guò)夜孵育。二抗孵育：取出PVDF膜，使用TBST潤(rùn)洗10 min，潤(rùn)洗3次后在室溫環(huán)境下孵育二抗1 h。成像：使用TBST潤(rùn)洗 5 min，潤(rùn)洗4次后置于成像儀中，加入ECL顯色液后，根據(jù)PVDF膜上的條帶清晰程度調(diào)整曝光時(shí)間。

1.8 奶牛子宮內(nèi)膜組織中PGE2ELISA試驗(yàn)收集體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織的上清液，以10 000 r/min 離心10 min后收集上清液，使用PBS稀釋20倍，用以檢測(cè)奶牛子宮內(nèi)膜組織分泌到培養(yǎng)液中PGE2的含量。

1.9 HE染色將不同處理組的奶牛子宮內(nèi)膜組織，置于梯度酒精中進(jìn)行脫水處理(酒精濃度為：100%,95%,80%,75%,50%)，置于石蠟中包埋，并制作切片，使用蘇木精、伊紅染色液對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下(40×)觀察組織病理變化，拍照記錄。

1.10 免疫熒光染色試驗(yàn)將奶牛子宮內(nèi)膜組織制作成冰凍切片，經(jīng)冷丙酮固定后，加入3%過(guò)氧化氫溶液處理5 min以去除非特異性結(jié)合。使用TBST潤(rùn)洗3次，每次10 min。封閉：將冰凍切片置于含5%牛血清白蛋白中室溫封閉2 h；一抗孵育；將HABP-1與HMGB-1一抗按照1∶200進(jìn)行稀釋后與冰凍切片在4℃條件下過(guò)夜孵育;二抗孵育：取出冰凍切片，使用TBST潤(rùn)洗10 min，潤(rùn)洗3次后加入熒光二抗，置于暗盒中，室溫孵育1 h；成像：TBST潤(rùn)洗5 min，潤(rùn)洗4次后，使用激光共聚焦顯微鏡成像。

2 結(jié)果

2.1 PGE2的分泌水平檢測(cè)結(jié)果為驗(yàn)證熱滅活金黃色葡萄球菌是否可誘導(dǎo)PGE2的蓄積，以及本試驗(yàn)所使用的COX-2抑制劑是否可降低由熱滅活金黃色葡萄球菌所上調(diào)的PGE2的分泌量。在體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)液中分別加入PBS(control，空白對(duì)照組)、熱滅活的金黃色葡萄球菌(HK-S.aureus)、熱滅活金黃色葡萄球菌與COX-2抑制劑(CAY10404、NS-398)共孵育8 h后收集上清液，ELISA檢測(cè)PGE2分泌量。結(jié)果如圖1所示，加入熱滅活金黃色葡萄球菌后，PGE2蓄積量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),而與CAY-10404與NS-398共孵育后，PGE2表達(dá)量較熱滅活金黃色葡萄球菌處理組顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明本試驗(yàn)使用的COX-2抑制劑可降低由熱滅活金黃色葡萄球菌所上調(diào)的PGE2的分泌量，該濃度的抑制劑可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 HMGB-1、HABP-1 mRNA與蛋白的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)損傷相關(guān)因子HMGB-1、HABP-1的表達(dá)水平，以證明PGE2在體外是否可介導(dǎo)由金黃色葡萄球菌所引起的奶牛子宮內(nèi)膜組織的損傷。HMGB-1、HABP-1 mRNA與蛋白表達(dá)水平如圖2所示，僅加入COX-2抑制劑(CAY-10404與NS-398)時(shí)，HMGB-1與HABP-1 mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明該濃度下的抑制劑對(duì)培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織無(wú)影響，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。加入熱滅活金黃色葡萄球菌處理后，HMGB-1、HABP-1 mRNA與蛋白表達(dá)量與空白對(duì)照組比較顯著上升(P<0.05)，而熱滅活金黃色葡萄球菌與CAY-10404、NS-398共孵育后，HMGB-1(圖2A,C)與HABP-1(圖2B,D) mRNA與蛋白表達(dá)量與熱滅活金黃色葡萄球菌處理組相比，顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明PGE2在體外可介導(dǎo)由金黃色葡萄球菌所引起的奶牛子宮內(nèi)膜組織的損傷。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖2 HMGB-1(A,C)和HABP-1(B,D)表達(dá)量

2.3 HMGB-1、HABP-1免疫熒光檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步檢測(cè)HMGB-1、HABP-1的表達(dá)水平，使用免疫熒光的方法檢測(cè)HMGB-1(圖3A～D) 及HABP-1(圖3E～H) 在奶牛子宮內(nèi)膜組織中的熒光強(qiáng)度。檢測(cè)結(jié)果顯示，收集不同處理組的奶牛子宮內(nèi)膜組織，分別加入PBS處理(圖3A,E)、熱滅活金黃色葡萄球菌(圖3B,F)、熱滅活金黃色葡萄球菌與CAY-10404(圖3C,G)、熱滅活金黃色葡萄球菌與NS-398(圖3D,H)。結(jié)果顯示:加入熱滅活金黃色葡萄球菌后HMGB-1與HABP-1熒光強(qiáng)度上升(P<0.05)，而加入CAY-10404與NS-398及HMGB-1(圖3I)與HABP-1(圖3J)后熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)。

圖3 HMGB-1(A～D,I)與HABP-1(E～H,J)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

2.4 HE染色結(jié)果為驗(yàn)證損傷相關(guān)因子的表達(dá)水平，是否與奶牛子宮內(nèi)膜組織的損傷程度相一致。本試驗(yàn)使用HE染色方法，觀察組織的實(shí)際損傷程度。不同處理組的奶牛子宮內(nèi)膜組織HE如圖4所示，對(duì)照組(圖4A)奶牛子宮內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞完整，且完整排列于腺體周圍，加入熱滅活金黃色葡萄球菌后(圖4B)，腺上皮細(xì)胞發(fā)生皺縮，而與CAY-10404(圖4C)與NS-398(圖4D)共孵育后，腺上皮細(xì)胞皺縮程度降低。

3 討論

細(xì)菌性奶牛子宮內(nèi)膜炎多發(fā)于產(chǎn)后1～4周奶牛，其發(fā)病機(jī)理及炎癥過(guò)程中的調(diào)控過(guò)程尚不清楚[10,16-17]。PGE2是前列腺素類化合物中與炎癥反應(yīng)最密切的，在奶?；甲訉m內(nèi)膜炎時(shí)，COX-2與mPGES-1 mRNA的表達(dá)量均顯著高于健康奶牛[7,10]，并且與一些促炎性細(xì)胞因子呈正相關(guān)關(guān)系，這提示PGE2參與奶牛子宮內(nèi)膜炎。

本試驗(yàn)使用2種COX-2抑制劑：CAY10404和NS-398，結(jié)果顯示COX-2抑制劑可顯著降低損傷相關(guān)因子HMGB-1與HABP-1的mRNA和蛋白的表達(dá)量。HE染色結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌損傷奶牛子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞。研究表示，奶牛子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞除分泌功能外，還充當(dāng)著由胚體傳遞信號(hào)給母體的介質(zhì)作用，這種作用與維持胚胎的穩(wěn)定相關(guān)[16]。金黃色葡萄球菌可損傷腺上皮細(xì)胞，這可能與細(xì)菌性子宮內(nèi)膜炎導(dǎo)致的產(chǎn)后不孕相關(guān)，金黃色葡萄球菌在奶牛子宮內(nèi)膜炎中常被認(rèn)為是亞臨床型感染細(xì)菌，而不受到關(guān)注。本試驗(yàn)結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌可引起較為嚴(yán)重的子宮腺上皮損傷，因此在治療時(shí)，必須予以重視。COX-2抑制劑可顯著抑制金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞的損傷，并與損傷相關(guān)因子檢測(cè)結(jié)果相一致，說(shuō)明PGE2可調(diào)控奶牛子宮內(nèi)膜組織中損傷相關(guān)因子的表達(dá)。

我國(guó)奶牛存欄量已達(dá)1 400余萬(wàn)頭[16]，已成為我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的主要組成部分之一。在奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)工作中，造成奶牛淘汰的主要原因之一是生殖系統(tǒng)疾病。以內(nèi)蒙古自治區(qū)為例，因奶牛生殖系統(tǒng)疾病所導(dǎo)致的延期受孕、不孕或治療成本過(guò)高等而淘汰造成的經(jīng)濟(jì)損失每年約達(dá)10億元，在獸醫(yī)臨床上雖然常用前列腺素類藥物和非甾體類抗炎藥治療生殖系統(tǒng)疾病，但僅靠獸醫(yī)工作者的經(jīng)驗(yàn)用藥，難以獲得理想的用藥效果，缺乏系統(tǒng)的理論指導(dǎo)和基礎(chǔ)理論的支持。如何提高奶牛的生產(chǎn)性能和母牛的受胎率，顯著提高牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，提高奶牛繁殖障礙疾病的治愈率是亟待解決的問(wèn)題。同時(shí)，闡明生殖內(nèi)分泌的關(guān)鍵活性物質(zhì)的種類及其作用機(jī)制和生殖道疾病的發(fā)病機(jī)理，才能從根本上解決通過(guò)臨床上有效提高奶牛繁殖能力的問(wèn)題。本試驗(yàn)證明HABP-1與HMGB-1同樣可作為奶牛子宮內(nèi)膜炎的損傷相關(guān)因子，且受到PGE2的調(diào)控，表明PGE2調(diào)控細(xì)菌性子宮內(nèi)膜組織的損傷，這對(duì)科學(xué)治療奶牛生殖系統(tǒng)疾病和提高奶牛的繁殖能力具有現(xiàn)實(shí)意義。

總之，金黃色葡萄球菌可造成奶牛子宮內(nèi)膜組織嚴(yán)重?fù)p傷，損傷相關(guān)因子HMGB-1，HABP-1與奶牛子宮內(nèi)膜組織損傷程度呈正相關(guān)關(guān)系，PGE2可誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌所造成的奶牛子宮內(nèi)膜組織損傷。