丹參提取物體外協(xié)同慶大霉素抗金黃色葡萄球菌的作用

崔玉梅，陳峙峰，張思琪，鄒宜諾，鄧旭明，王建鋒*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.長春西諾生物科技有限公司，吉林 長春 130062；3.吉林市豐滿區(qū)小白山鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林 吉林市 132000)

近年來，抗生素耐藥性問題在養(yǎng)殖業(yè)日趨嚴重，動物養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的耐藥菌的檢出率不斷增高，我國已經(jīng)針對養(yǎng)殖業(yè)出臺“禁抗、限抗和減抗”相關政策[1]。金黃色葡萄球菌簡稱金葡菌是臨床上和動物養(yǎng)殖過程中最常見的多重耐藥菌之一，如耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)使大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素的治療作用降低或消失，耐萬古霉素金葡菌(vancomycin-resistantStaphylococcusaureus，VRSA)使治療嚴重耐藥菌感染的“最后一道防線”萬古霉素失去療效[2-3]。因此，臨床上急需解決多重耐藥金葡菌嚴重感染的問題。

氨基糖苷類抗生素具有化學性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水和口服不易吸收等特性被廣泛應用于臨床治療嚴重細菌感染，該類抗生素抗菌譜廣，對需氧型革蘭陰性菌和金葡菌具有很好的殺滅作用[4]。慶大霉素作為我國自主研發(fā)的氨基糖苷類廣譜抗生素已經(jīng)在臨床上使用多年，其可以與包括β-內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)的多種抗生素聯(lián)合使用治療多種致病菌混合感染，對MRSA和VRSA等耐藥金葡菌同樣具有顯著的治療作用[5]。但近年來隨著慶大霉素在臨床上的大量使用，已經(jīng)出現(xiàn)部分金葡菌對慶大霉素產(chǎn)生低度耐藥[6]。金葡菌對慶大霉素耐藥性在逐年增加，解決金葡菌對慶大霉素耐藥迫在眉睫[7]。

丹參作為一味常用中藥存在于多種處方中，其具有活血化瘀、改善肝腎功能和促進組織修復再生等多種藥理學作用[8]。丹參注射液作為治療心血管疾病的中成藥已經(jīng)在臨床使用多年，其主要化學成分包括隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和丹酚酸B等[9]。但丹參提取物與氨基糖苷類抗生素聯(lián)合使用是否可以恢復抗生素對耐藥金葡菌的抗菌活性至今鮮有報道，因此，開發(fā)中藥丹參作為氨基糖苷類抗生素增效劑具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌株本試驗所用金葡菌USA300、USA400、ATCC25904、ATCC25923和ATCC29213均購自美國標準菌種保藏管理中心(ATCC)，-80℃保存于本實驗室。

1.2 藥品與試劑丹參提取物由本實驗室提?。浑[丹參酮等標準品購自上海源葉生物科技有限公司；慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、多黏菌素B和頭孢噻吩等抗生素購自中國藥品生物制品檢定所；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 棋盤法最小抑菌濃度檢測挑取固體TSB培養(yǎng)基上單個菌落于液體TSB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日，使用分光光度計將菌液D值調(diào)整至D600 nm=0.1，備用。將各受試抗生素、丹參提取物以及有效成分對照品(包括隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和丹酚酸B)按照2倍連續(xù)稀釋法在無菌96孔板中用MHB培養(yǎng)基連續(xù)倍比稀釋，最后將調(diào)整后的菌液每孔加入1 μL，于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16～24 h后通過肉眼觀察各孔的渾濁程度來判定最小抑菌濃度(MIC)值，以抑制細菌生長的最小藥物濃度作為該藥對本株菌的MIC值[10]。

棋盤法是將2種藥物按照橫向從左到右，縱向從上至下進行2倍倍比稀釋，根據(jù)二者聯(lián)合后各濃度下的MIC來判定丹參提取物或其有效成分是否與抗生素具有協(xié)同作用。分級抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC) 指數(shù)判定標準如下：FIC指數(shù)<0.5為協(xié)同作用；0.5 ≤ FIC指數(shù)<1為相加作用；12為拮抗作用。

1.4 生長曲線將過夜培養(yǎng)的受試金葡菌培養(yǎng)物擴大培養(yǎng)至100 mL TSB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm值為0.3；將菌液分裝至5個50 mL錐形瓶中，分為陽性對照組(菌液不做任何處理)和不同質(zhì)量濃度藥物處理組(32～256 mg/L，需減去藥物本身D值)。分裝好的培養(yǎng)菌液置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h取出分別測定D600 nm值，記錄并繪制成曲線。

1.5 殺菌試驗將過夜培養(yǎng)的受試金葡菌培養(yǎng)液調(diào)整至菌量為5×l05CFUs/mL (D600 nm=0.1時，1∶200稀釋)，備用。將調(diào)整后的菌液加入無菌96孔培養(yǎng)板中分為陽性對照組(不作處理)、單獨抗生素組(1/4 MIC)、單獨提取物(1/4 MIC)以及抗生素和提取物聯(lián)用組，每組10個平行孔。對不同處理組進行菌液連續(xù)10倍倍比稀釋涂板計數(shù),作為0 h各處理組的菌落數(shù)。然后將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，在各時間點分別取對應孔內(nèi)的菌液，涂板計數(shù)，繪制時間-殺菌曲線。

1.6 丹參提取物主要成分提取和含量測定

1.6.1丹參主要成分提取條件 丹參藥材購自河南省亳州典世堂藥業(yè)銷售有限公司，參照文獻[11]方法，取1 kg丹參藥材粉碎后過3號篩，準確稱取20 g丹參粉末，采用乙醇回流法進行提取，提取條件為80%乙醇體積分數(shù)，料液比為1∶10，提取2次，每次2 h。

1.6.2高效液相色譜條件 丹參酮類：色譜柱Agilnt C18，5 μmol/L，250.0 mm×4.6 mm，USA；流動相A為乙腈，B為0.1%磷酸溶液；流速1.0 mL/min；柱溫20℃；進樣量10 μL；梯度洗脫方法：0～6 min 61% A，6～20 min 61%→90% A，20～20.5 min 90%→61% A，20.5～25 min 61% A；檢測波長：270 nm。

丹酚酸B：色譜柱Agilnt C18，5 μmol/L，250.0 mm×4.6 mm，USA；流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)；流速1.2 mL/min；柱溫20℃；進樣量10 μL；檢測波長286 nm。

1.7 丹參提取物對不同細胞毒性檢測試驗在含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中分別傳代培養(yǎng)的A549細胞、J774細胞和RAW264.7細胞通過胰酶消化脫離培養(yǎng)瓶，反復吹打混勻后對細胞進行計數(shù)。將100 μL的各細胞(2×104個/孔)分別接種于96孔板中，使每孔終體積為200 μL，然后將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。于次日棄去各孔中的培養(yǎng)基，無菌PBS溶液洗滌3次，然后每孔加入含有不同濃度丹參提取物的DMEM培養(yǎng)基200 μL，其中以含有0.2% Triton孔作為陽性對照，不作任何處理的孔作為陰性對照，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。

將上述培養(yǎng)后的細胞1 000 r/min離心10 min，吸取各孔上清100 μL置于新的96孔板中；將配置好的LDH檢測試劑按照1∶1加入上清中，避光反應15～30 min至陽性對照孔變成暗紅色后，使用酶標儀測定D492 nm值，統(tǒng)計并計算各濃度條件下丹參提取物的細胞毒性。

1.8 丹參提取物對A549細胞由細菌介導損傷的保護作用挑取細菌固體培養(yǎng)基上的單個菌落于TSB肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取菌液1 mL于4℃、5 000 r/min離心10 min。無菌PBS洗滌后DMEM培養(yǎng)基稀釋菌液至D600 nm=0.1。將不同處理(包括丹參提取物處理組、慶大霉素處理組、聯(lián)合處理組和陽性對照組)的細胞培養(yǎng)液加入A549細胞中培養(yǎng)6 h，吸出100 μL 上清液用于LDH檢測。

棄去各孔中剩余培養(yǎng)基，PBS清洗3次，向96孔板中加入0.2% Triton×100裂解細胞，取20 μL使用10倍倍比稀釋的細胞裂解液涂布于TSB固體培養(yǎng)基平板(含有2 mg/L 甲氧西林)上，于37℃條件下培養(yǎng)過夜，記錄并統(tǒng)計不同組合處理后細胞裂解液中的菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 丹參提取物顯著提高多種抗生素的抗菌作用通過棋盤法MIC測定丹參提取物與不同抗生素之間的協(xié)同效果，結(jié)果如圖1和表1所示，丹參提取物可顯著提高慶大霉素(FIC=0.31)、頭孢噻吩鈉(FIC=0.38)、硫酸多黏菌素B(FIC=0.38)和紅霉素(FIC=0.38)對典型MRSA菌株USA300的抗菌作用，即丹參提取物與上述抗生素協(xié)同效果顯著。而與氯霉素和四環(huán)素聯(lián)合僅有相加作用或無效。

本研究進一步用慶大霉素與丹參提取物聯(lián)合對多種不同金葡菌進行MIC檢測，結(jié)果由圖2可見，慶大霉素與丹參提取物聯(lián)合對多種不同金葡菌均具有顯著協(xié)同作用(FIC<0.5)(表1)。此外，研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物對金葡菌ATCC25923具有良好的抗菌活性，其MIC值為64 mg/L。

表1 丹參提取物及其有效成分與不同抗生素的FIC值測定

為驗證丹參提取物是否與所有氨基糖苷類抗生素具有上述顯著協(xié)同效果，本試驗選擇了鏈霉素、卡那霉素、大觀霉素和阿米卡星4種氨基糖苷類抗生素進一步與丹參提取物進行MIC檢測，如圖2和表1所示，丹參提取物與鏈霉素和卡那霉素協(xié)同效果顯著(FIC<0.5)，與阿米卡星和大觀霉素只有相加作用(FIC=0.5)。

每個組合至少重復4次，各孔中出現(xiàn)肉眼可見細菌生長的次數(shù)越多，顏色越深

圖2 丹參提取物聯(lián)合氨基糖苷類抗生素對不同金葡菌的MIC

2.2 丹參提取物顯著恢復慶大霉素對MRSA的殺菌作用通過生長曲線試驗檢測不同濃度的丹參提取物對金葡菌USA300和ATCC25904生長的影響，結(jié)果顯示，丹參提取物在亞抑菌濃度條件下對受試金葡菌的生長無顯著影響(圖3A,B)。殺菌試驗結(jié)果表明，1/4 MIC慶大霉素和1/4 MIC丹參提取物聯(lián)合后在10 h之內(nèi)可將培養(yǎng)基中的金葡菌全部殺死，而單獨1/4 MIC慶大霉素和1/4 MIC丹參提取物均不能將金葡菌完全殺死(圖3C，D)。

2.3 丹參提取物可提高慶大霉素對A549細胞由金葡菌介導損傷的保護作用丹參提取物對A549細胞、J774細胞和RAW264.7細胞毒性檢測結(jié)果表明，丹參提取物質(zhì)量濃度在512 mg/L及以下時，LDH釋放量均低于25%，且該質(zhì)量濃度遠大于本研究中所使用的有效質(zhì)量濃度(圖4A～C)。如圖4D所示，單獨慶大霉素和丹參提取物處理后均可降低由金葡菌介導的細胞損傷，而且二者聯(lián)合后效果更佳。與單獨慶大霉素和丹參提取物處理相比，聯(lián)合后細胞裂解液中細菌數(shù)量顯著降低(圖4E)。

不同質(zhì)量濃度丹參提取物對金葡菌USA300(A)和ATCC25904(B)生長的影響；以及不同組合對金葡菌USA300(C)和ATCC25904(D)的殺菌效果檢測

A～C.丹參提取物對不同細胞的細胞毒性檢測；D.不同處理后A549細胞LDH釋放檢測；E.細胞裂解液中的金葡菌數(shù)，橫線表示相對應的兩個處理組進行差異性分析。*P<0.05；**P<0.01

2.4 丹參提取物有效成分與慶大霉素的協(xié)同作用對丹參提取物中的主要成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和丹酚酸B進行了高效液相色譜法檢測，如圖5和表2所示，丹參提取物水溶性成分丹酚酸B的含量較高，而脂溶性成分(隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA)的含量較低，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量分別為0.33%，0.05%，0.44%和9.02%。

圖5 丹參提取物有效成分高效液相檢測

表2 丹參提取物中主要化合物含量測定

將上述檢測的4種有效成分聯(lián)合慶大霉素進行MIC檢測，結(jié)果顯示，隱丹參酮和丹酚酸B與慶大霉素具有顯著的協(xié)同效果(FIC<0.5)，而丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA無協(xié)同效果(圖6)。

圖6 丹參提取物主要成分聯(lián)合慶大霉素對金葡菌USA300的MIC

3 討論

目前，“老藥新用”是針對臨床上出現(xiàn)耐藥菌感染的最快捷的策略。因為研發(fā)一種新型抗菌藥物需要投入大量的時間和資金[12]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參對部分革蘭陽性菌具有潛在的抗菌效果，這主要是因為其所含的如丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹酚酸等多種化學成分具有抗菌作用[13]。這使得研究人員對丹參的有效成分丹參酮ⅡA等進行設計和合成，以期提高其抗菌活性[14]。至今為止，丹參提高氨基糖苷類抗生素對金葡菌的抗菌作用均未見報道。丹參是否可增強慶大霉素等氨基糖苷類抗生素對革蘭陰性菌的抗菌作用需進一步驗證。因此，本試驗結(jié)果有助于擴大丹參的藥理作用，為丹參增強氨基糖苷類抗生素抗菌作用機制研究奠定基礎。

丹參的藥理學作用廣泛，毒副作用小，其已有注射劑和煎劑等劑型投入臨床使用[15-18]。丹參的不同制劑通過不同給藥途徑進行急性和亞慢性毒性試驗，小鼠、大鼠和家兔給予高劑量連續(xù)多日給藥后均未出現(xiàn)毒性反應，未出現(xiàn)死亡情況，實質(zhì)性器官未見病變，血液學和血液生化學指標正常，小鼠腹腔注射丹參注射液的半數(shù)致死劑量為6.3 g/kg，屬于無毒[19-20]。這為丹參作為慶大霉素增效劑的研發(fā)奠定了毒理學和制劑研發(fā)基礎。

本試驗結(jié)果顯示，丹參提取物有效成分隱丹參酮和丹酚酸與慶大霉素的協(xié)同效果顯著，但略低于丹參提取物，提示這可能是因為丹參中的有效成分之間存在協(xié)同作用，或丹參中還有其他含量更低的化合物也同樣發(fā)揮協(xié)同慶大霉素的作用。此外，隱丹參酮對金葡菌ATCC25923的抗菌作用較強(MIC=8 mg/L)。除本研究中檢測的有效成分之外，丹參提取物中含有異隱丹參酮、羥基丹參酮ⅡA、丹參新酮、丹參酸甲酯、二氫丹參酮Ⅰ和鼠尾草酚等多種天然化合物，這些化合物是否具有更好的協(xié)同效果有待進一步研究[21]。

丹參“活血化瘀，退陳生新”的功效有助于抗生素在體內(nèi)快速殺滅病原菌和降低慶大霉素等抗生素的毒副作用[22]，因此，本研究為治療臨床耐藥金葡菌感染提供了方案和策略。