急性冷應(yīng)激對(duì)斷奶仔豬全血中HSP70/TLR4/NF-κB通路的影響

陳 妍，徐 彬，劉 鵬，袁建彬，連 帥，計(jì) 紅，柳巨雄，楊煥民*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

斷奶仔豬(30日齡)消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，由依靠母乳生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)椴墒筹暳仙L(zhǎng)，很容易損害消化器官，造成營(yíng)養(yǎng)不良。其次仔豬從育仔舍轉(zhuǎn)到常規(guī)舍，濕度、溫度、光照、氣體、噪音等環(huán)境因素發(fā)生改變[1]。這些外源性應(yīng)激源都會(huì)對(duì)仔豬免疫系統(tǒng)和生理穩(wěn)態(tài)造成破壞。冷應(yīng)激是我國(guó)寒冷地區(qū)危害極大的一種應(yīng)激性致病因素，冷應(yīng)激會(huì)使動(dòng)物機(jī)體對(duì)外源性和內(nèi)源性致病因子的抵抗力下降，極易感染疾病，嚴(yán)重情況下會(huì)影響動(dòng)物存活，導(dǎo)致畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。

熱休克蛋白70(HSP70)在正常情況下穩(wěn)定表達(dá)于動(dòng)物細(xì)胞中，在溫度沖擊或其他應(yīng)激刺激下，大量合成，可保護(hù)機(jī)體免受細(xì)胞內(nèi)蛋白變性或死亡[2]。近年有研究表明，HSP70不僅具有分子伴侶[3]和應(yīng)激保護(hù)的功能，細(xì)胞表面和細(xì)胞外過(guò)度表達(dá)的HSP70有可能成為“危險(xiǎn)信號(hào)”啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)[4]。Toll樣受體(TLRs)是近年來(lái)在免疫活性細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的表達(dá)豐富的病原模式識(shí)別受體[5]，Toll樣受體4(TLR4)是TLRs家族重要一員，可接受外源性或內(nèi)源性配體的刺激，從而激活下游信號(hào)分子，同時(shí)釋放一系列炎性因子而引起炎癥反應(yīng)。HSP70已被證明可作為T(mén)LR4內(nèi)源性激活劑[6]。髓樣分化因子88(MyD88)在TLR4介導(dǎo)的通路中發(fā)揮銜接子的作用[7]，誘導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路。NF-κB是一種控制一系列炎性因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，TLR4信號(hào)中NF-κB最常激活的形式是由RelA(p65)和p50組成的異二聚體，RelA-p50異二聚體作為一種潛在的及不活躍的形式，通過(guò)與未受刺激細(xì)胞中的IkB蛋白相互作用而保存在細(xì)胞質(zhì)中。無(wú)活性的p65被上游信號(hào)分子激活后，快速磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，負(fù)責(zé)TLR4介導(dǎo)的炎性因子的誘導(dǎo)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等[8]。鑒于HSP70/TLR4/NF-κB通路在抗細(xì)菌或病毒免疫和炎性過(guò)程中的重要作用，我們推測(cè)其可能參與了冷應(yīng)激條件下斷奶仔豬的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。本試驗(yàn)采用qRT-PCR方法檢測(cè)冷應(yīng)激不同時(shí)間后斷奶仔豬全血中HSP70/TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵分子的表達(dá)變化，探討是否可以把HSP70/TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵分子作為斷奶仔豬遭受冷應(yīng)激程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)而為系統(tǒng)揭示冷應(yīng)激發(fā)生時(shí)斷奶仔豬的炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制及防控技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取體況相近健康斷奶仔豬(30日齡)16頭，在人工氣候室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組：常溫對(duì)照組、冷應(yīng)激2，6,12 h組，每組4頭。冷應(yīng)激溫度選取為(4±2)℃，正常飼養(yǎng)溫度選取為(24±2)℃，相對(duì)濕度均為40%～50%。預(yù)飼后1 d，22:00將冷應(yīng)激12 h組仔豬放入人工冷應(yīng)激氣候室，進(jìn)行冷應(yīng)激。2 d，6:00 將冷應(yīng)激6 h組仔豬放入冷應(yīng)激人工氣候室，進(jìn)行冷應(yīng)激；12:00將冷應(yīng)激2 h組仔豬放入冷應(yīng)激人工氣候室，進(jìn)行冷應(yīng)激。分別在第2天8:00、10:00、12:00、14:00采集常溫對(duì)照組、冷應(yīng)激12，6，2 h組斷奶仔豬的全血樣品，-80℃保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)和合成應(yīng)用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)豬HSP70、MyD88、TLR4、p65、IL-6、白介素-10(IL-10)的mRNA序列進(jìn)行查詢(xún)，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.3 全血中總RNA提取從-80℃超低溫冰箱中取出0.5 mL全血溶化后，加入1.5 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min；4℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移到新的RNAfree EP管中，加入0.2 mL氯仿，吹打混勻后，室溫靜置15 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，將上層水相吸取轉(zhuǎn)移到新的RNAfree EP管中，在冰上進(jìn)行所有操作。向EP管中加入0.5 mL異丙醇，充分混勻，放置10 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min；棄上層水相，加入1 mL 75%乙醇，充分吹打沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min；棄上層水相，使EP管內(nèi)液體除盡，加入20 μL DEPC處理水吹吸沉淀。取1 μL RNA樣品，直接滴加在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定其濃度和D值。

1.4 cDNA的合成以全血中提取的總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄過(guò)程應(yīng)用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，試驗(yàn)步驟：首先按照表2的試劑順序加入試劑，65℃加熱200 μL EP管10 min使模板-引物混合物變性，確保RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變性，然后立即將EP管置于冰上冷卻。再按照表3的試劑順序加入試劑，25℃ 10 min，之后55℃ 30 min，再加熱至85℃維持5 min 使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，將EP管立即置于冰上冷卻以停止反應(yīng)。

表2 模板-引物結(jié)合反應(yīng)體系

表3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.5 qRT-PCR采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)斷奶仔豬全血HSP70/TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵分子水平的表達(dá)。應(yīng)用Bio-Rad CFX96型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，具體按照用戶(hù)操作手冊(cè)在冰上避光進(jìn)行。反應(yīng)試劑：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL、RT reaction solution(cDNA) 2.0 μL、PCR Reverse Primer 1.0 μL、PCR Forward Primer 1.0 μL、dH2O 8.5 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃ 35 s，60℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)。然后繼續(xù)在65～95℃的溫度區(qū)間內(nèi)進(jìn)行建立熔解曲線的反應(yīng)，以0.5℃為循環(huán)梯度，每個(gè)循環(huán)5 s，共60個(gè)循環(huán)。將cDNA作為未知樣本，以GAPDH作為內(nèi)參，每管設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后得出每個(gè)樣本的Cq值，計(jì)算出相應(yīng)的2-ΔΔCq值，用校正后的值判定相對(duì)表達(dá)量的差異。

2 結(jié)果

2.1 斷奶仔豬全血中HSP70水平變化采用qRT-PCR方法檢測(cè)斷奶仔豬全血中HSP70水平,如圖1所示，與常溫對(duì)照組相比，急性冷應(yīng)激后各時(shí)間點(diǎn)斷奶仔豬全血中HSP70水平均升高，整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中冷應(yīng)激2，6 h組極顯著高于常溫對(duì)照組(P<0.01)，冷應(yīng)激6 h組達(dá)到峰值，冷應(yīng)激12 h組與常溫對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化。

*表示與常溫對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，***表示與常溫對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 斷奶仔豬全血中TLR4水平變化采用qRT-PCR方法檢測(cè)斷奶仔豬全血中TLR4水平,結(jié)果如圖2所示，與常溫對(duì)照組相比，急性冷應(yīng)激后各時(shí)間點(diǎn)仔豬全血中TLR4水平均升高，整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，冷應(yīng)激2 h組顯著高于常溫對(duì)照組(P<0.05)，冷應(yīng)激6 h組極顯著高于常溫對(duì)照組(P<0.01)，冷應(yīng)激6 h組達(dá)到峰值，冷應(yīng)激12 h組與常溫對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化。

圖2 急性冷應(yīng)激后斷奶仔豬全血中TLR4水平變化

2.3 斷奶仔豬全血中MyD88和p65水平變化采用qRT-PCR方法檢測(cè)TLR4信號(hào)通路下游關(guān)鍵信號(hào)分子MyD88和p65在仔豬全血中的水平變化，結(jié)果如圖3所示，與常溫對(duì)照組相比，急性冷應(yīng)激后各時(shí)間點(diǎn)仔豬全血中MyD88和p65的水平均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，MyD88和p65的水平在冷應(yīng)激2，6 h組極顯著低于常溫對(duì)照組(P<0.01)，而冷應(yīng)激12 h組極顯著高于常溫對(duì)照組(P<0.01)。

圖3 急性冷應(yīng)激后斷奶仔豬全血中MyD88和p65水平變化

2.4 斷奶仔豬全血中炎性因子水平變化采用qRT-PCR方法檢測(cè)斷奶仔豬全血中促炎因子TNF-α和IL-6和抗炎因子IL-10水平變化，結(jié)果如圖4所示，與常溫對(duì)照組相比，急性冷應(yīng)激后促炎因子TNF-α和IL-6的水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且都在冷應(yīng)激后6 h呈現(xiàn)暴發(fā)式增長(zhǎng)，其中IL-6在冷應(yīng)激2 h組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，TNF-α在冷應(yīng)激2，12 h組以及IL-6在冷應(yīng)激12 h組與常溫對(duì)照組相比無(wú)明顯變化?？寡滓蜃覫L-10的水平呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在冷應(yīng)激6 h組極顯著降低(P<0.01)，在冷應(yīng)激12 h組略升高，但仍顯著低于常溫對(duì)照組(P<0.01)。

A.TNF-α水平變化;B.IL-6水平變化;C.IL-10水平變化

3 討論

冷應(yīng)激是寒冷地區(qū)最普遍存在的應(yīng)激源，先天性免疫的激活和炎癥因子的級(jí)聯(lián)效應(yīng)是應(yīng)對(duì)冷應(yīng)激的重要機(jī)制之一[9-11]。冷應(yīng)激的主要特點(diǎn)之一就是高度誘導(dǎo)合成熱休克蛋白(HSPs)。HSPs是指在機(jī)體遭受冷應(yīng)激及其他一些環(huán)境應(yīng)激，如濕熱環(huán)境、電磁輻射、有毒氣體、噪音等有害刺激后，快速合成，并在不利環(huán)境下積極發(fā)揮對(duì)機(jī)體和細(xì)胞起保護(hù)作用的一類(lèi)具有高度保守性的蛋白質(zhì)[12]。HSP70是約為70 kDa的熱休克蛋白，是HSPs家族中標(biāo)志性成員[13]。BHARATI等[14]研究表明，HSP70可能參與了塔卡帕克牛的熱應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)，其典型的雙相表達(dá)模式有助于保護(hù)動(dòng)物免受熱應(yīng)激，可作為塔帕卡牛慢性熱應(yīng)激的重要生物標(biāo)記。本試驗(yàn)中，在冷應(yīng)激2，6 h時(shí)，HSP70的水平顯著升高，說(shuō)明機(jī)體對(duì)冷應(yīng)激的響應(yīng)增強(qiáng)，有利于機(jī)體自身及時(shí)啟動(dòng)保護(hù)程序來(lái)抵抗冷應(yīng)激。隨著應(yīng)激時(shí)間的增加，HSP70水平開(kāi)始下降，在冷應(yīng)激12 h時(shí)，HSP70水平與常溫對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。推測(cè)隨著冷應(yīng)激時(shí)間增加，HSP70已無(wú)法抵抗冷應(yīng)激來(lái)保護(hù)機(jī)體。

先天性免疫是宿主抵抗感染和惡性轉(zhuǎn)化的最初防線，對(duì)適應(yīng)性免疫的建立具有深遠(yuǎn)的影響。TLRs是機(jī)體內(nèi)檢測(cè)多種微生物成分并激發(fā)先天性免疫反應(yīng)的主要傳感器[15]。近年來(lái)研究表明，HSP70承擔(dān)著分子伴侶和保護(hù)機(jī)體免受應(yīng)激損害的功能，當(dāng)HSP70高度表達(dá)時(shí)，可作為T(mén)LR4的內(nèi)源性配體[16]。ZHANG等[17]發(fā)現(xiàn)高氧后野生型小鼠肺和肺內(nèi)皮細(xì)胞(MLEC)內(nèi)所分泌的HSP70水平明顯升高，隨后證實(shí)HSP70和TLR4在肺組織和MLEC中免疫共沉淀，HSP70的細(xì)胞保護(hù)功能取決于TLR4。本試驗(yàn)檢測(cè)了不同冷應(yīng)激時(shí)間下TLR4的水平，發(fā)現(xiàn)TLR4與HSP70有相同的變化趨勢(shì)，即在冷應(yīng)激6 h組顯著升高，在冷應(yīng)激12 h組顯著降低，進(jìn)一步證明TLR4被HSP70所激活。

TLR4識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)后，通過(guò)其Toll/IL-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域的親和力相互作用招募一組具有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白MyD88，這種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起NF-κB的激活，導(dǎo)致隨后激活炎癥因子的基因被激活，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和趨化因子等[18]。一項(xiàng)研究表明，顱腦損傷后，姜黃素可通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制來(lái)減少小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的急性激活和神經(jīng)元凋亡，從而改善患者的預(yù)后[19]。本試驗(yàn)中，在冷應(yīng)激6 h時(shí)，MyD88和NF-κB p65水平顯著降低，促炎因子TNF-α、IL-6極顯著升高，抗炎因子IL-10極顯著降低，這一結(jié)果表明，在冷應(yīng)激條件下，TLR4響應(yīng)HSP70的過(guò)度表達(dá)被迅速激活，隨后下游的信號(hào)傳遞分子MyD88迅速增加進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，促炎因子的產(chǎn)生和釋放以及抗炎因子的抑制。而隨著冷應(yīng)激時(shí)間的增加，在冷應(yīng)激12 h時(shí)，MyD88和NF-κB p65水平顯著升高，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6顯著降低，抗炎因子IL-10顯著升高，表明此時(shí)仔豬機(jī)體免疫系統(tǒng)已遭到破壞不足以抵抗冷應(yīng)激。

綜上所述，急性冷應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致斷奶仔豬全血中HSP70/TLR4/NF-κB通路被激活，引起免疫反應(yīng)，而隨著冷應(yīng)激時(shí)間的增加，免疫功能會(huì)下降?？梢钥紤]把HSP70/TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵分子作為評(píng)價(jià)斷奶仔豬遭受冷應(yīng)激程度的客觀指標(biāo)，將有助于解決寒冷地區(qū)幼畜抗感染能力差、易患病等現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。