埃里希氏體病和萊姆病雙重?zé)晒舛縋CR診斷方法的建立

常 瑾，高 超，于喜冰，李俊嬌，穆佳琦，柴浩然，成姍育，尹仁福

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062)

蜱蟲(chóng)是專性吸血的體外寄生蟲(chóng)，是僅次于蚊子的第二大媒介，可傳播細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物等，對(duì)公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重危害。新興細(xì)菌感染性疾病中的很大一部分是由蜱蟲(chóng)等人畜共患病媒介傳播的。這些疾病中最突出的是萊姆病、埃里希體病和巴爾通體病[1]。

伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi, B.g)是引起萊姆病的病原體。萊姆病(Lyme disease,LD)是一種機(jī)體多系統(tǒng)多器官炎癥性反應(yīng)的人獸共患病[2]，現(xiàn)已廣泛分布于歐洲、亞洲，是美國(guó)最常見(jiàn)的蜱蟲(chóng)傳播疾病，具有分布廣、傳播快、致殘率高的特點(diǎn)[3]。1986年在黑龍江省林?？h首次分離到伯氏疏螺旋體，證明了我國(guó)存在伯氏疏螺旋體。目前已證實(shí)我國(guó)30多個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)存在伯氏疏螺旋體感染，20個(gè)省、市、自治區(qū)存在自然疫源地[4]。

無(wú)形體科埃里希氏體屬的成員在人類和動(dòng)物中引發(fā)埃里希氏體病[5]。埃里希氏體是一種專性的胞內(nèi)寄生菌，除野生動(dòng)物宿主外，家畜、伴侶動(dòng)物和人類也均為其易感宿主[6]。自1935年在阿爾及利亞發(fā)現(xiàn)第1株埃里希氏體后[7]各地不斷出現(xiàn)埃里希氏體病例，目前已有研究人員在我國(guó)犬、鼠、羊、蜱及人體內(nèi)檢測(cè)到埃里希氏體核酸及抗體[8]，顯示我國(guó)可能存在該病的自然疫源地。

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，人與自然接觸逐漸增多，以蜱蟲(chóng)為媒介的傳染病如萊姆病和埃里希氏體病的診斷與防控已引起人們的關(guān)注。目前主要通過(guò)將血細(xì)胞進(jìn)行吉姆薩染色，鏡下觀察是否存在桑葚體來(lái)確診埃里希氏體病，而萊姆病的診斷雖有現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但其推薦的病原分離及血清學(xué)檢測(cè)操作難度大，周期長(zhǎng)，對(duì)操作人員要求較高，且目前缺少同時(shí)診斷這兩種疾病的方法及標(biāo)準(zhǔn)，而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由于特異性好，操作簡(jiǎn)單成為一種廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法[9]。因此建立一種同時(shí)診斷萊姆病及埃里希體病的分子生物學(xué)診斷方法成為亟待解決的問(wèn)題，也可為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體伯氏疏螺旋體B31標(biāo)準(zhǔn)菌株、埃里希氏體、鉤端螺旋體、立克次體、大腸桿菌、綠膿桿菌基因組樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存；蜱蟲(chóng)樣品于2018年采集自黑龍江省佳木斯市牛體表；pGEM?-T Easy 載體系統(tǒng)購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑Wizard?Genomic DNA Purification Kit購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Axygen公司；PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)、DL2000 DNA Marker等試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 引物合成擴(kuò)增埃里希氏體groEL基因保守區(qū)域及伯氏疏螺旋體ospA基因全長(zhǎng)，并選取上述基因保守序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，根據(jù)蜱細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ基因(cytochrome coxidase subunit Ⅰ,Cox Ⅰ)設(shè)計(jì)蜱種鑒定引物[10],詳見(jiàn)表1。引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建參照Wizard?Genomic DNA Purification Kit說(shuō)明書(shū)提取純化伯氏疏螺旋體基因組，通過(guò)普通PCR方法擴(kuò)增埃里希氏體基因組樣品中熱休克蛋白groEL保守區(qū)域(使用Ehr-groel-F和Ehr-groel-R引物，反應(yīng)程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán);72℃ 10 min)及伯氏疏螺旋體表面A蛋白o(hù)spA全長(zhǎng)(使用ospA F和ospA R引物，反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min)。反應(yīng)體系：上、下游引物各2 μL；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye) 15 μL；ddH2O 7 μL；模板4 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，凝膠回收，連接至pGEM?-T Easy載體并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，提取重組質(zhì)粒，使用T載體通用M13引物通過(guò)PCR方法鑒定，將鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)后，將陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pT-groEL及pT-ospA。

1.5 反應(yīng)條件優(yōu)化通過(guò)普通PCR方法優(yōu)化退火溫度，依據(jù)引物Tm值±5℃范圍內(nèi)每2℃設(shè)置1個(gè)溫度梯度，并用矩陣法優(yōu)化引物濃度：0.2～1.0 μmol/L，每0.2 μmol/L設(shè)置1個(gè)梯度。

1.6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立測(cè)定陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT-groEL及pT-ospA濃度，依據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋為1×1010拷貝/μL。用Nuclease-Free Water將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍梯度稀釋為1×1010～1×101拷貝/μL。運(yùn)用上述反應(yīng)體系及條件，進(jìn)行單引物單模板熒光定量PCR，每組重復(fù)3次，輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 熔解曲線分析將通過(guò)最優(yōu)反應(yīng)條件擴(kuò)增獲得熔解曲線雙峰的Tm值，與單引物單模板熒光定量特異性熔解曲線單峰相比較，驗(yàn)證Tm值吻合程度。

1.8 特異性檢驗(yàn)運(yùn)用上述方法對(duì)鉤端螺旋體、立克次體、大腸桿菌、綠膿桿菌基因組進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其特異性。

1.9 重復(fù)性檢驗(yàn)隨機(jī)選取3個(gè)等濃度的pT-groEL和pT-ospA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，使用上述熒光定量PCR方法連續(xù)擴(kuò)增3次，通過(guò)對(duì)Ct值、Tm值等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性。

1.10 敏感性檢驗(yàn)以梯度稀釋后的pT-groEL及pT-ospA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，使用上述方法進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，利用熒光定量PCR儀不能檢出熒光信號(hào)時(shí)的稀釋濃度和Ct值，推算本方法所能檢出的敏感性下限。

1.11 臨床樣品檢測(cè)及符合度評(píng)價(jià)將采集自黑龍江省佳木斯市的蜱蟲(chóng)樣品，依據(jù)形態(tài)學(xué)差異分類，70%酒精清洗3次，用研缽將液氮冷凍后的蜱蟲(chóng)組織磨碎，參照Wizard?Genomic DNA Purification Kit說(shuō)明書(shū)對(duì)蜱蟲(chóng)樣品全基因組DNA進(jìn)行提取和純化。使用蜱種鑒定引物Cox Ⅰ擴(kuò)增(反應(yīng)程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，反應(yīng)體系同1.4)后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)后，確定蜱蟲(chóng)種類。使用本研究建立的方法對(duì)可能攜帶埃里希氏體和伯氏疏螺旋體的蜱基因組樣品進(jìn)行檢測(cè)。

將上述基因組DNA作為模板運(yùn)用埃里希氏體dsb基因[11]及伯氏疏螺旋體的5S～23S間隔序列[12]引物通過(guò)普通PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Blast比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功構(gòu)建陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pT-groEL及pT-ospA，通過(guò)目的基因特異性擴(kuò)增及載體通用引物鑒定與預(yù)期大小一致(圖1)，且測(cè)序結(jié)果正確。

M.DL2000 DNA Marker；1.特異性引物擴(kuò)增；2.M13通用引物擴(kuò)增

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化依據(jù)反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果，確定雙重PCR反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)程序：94℃ 30 s，94℃ 5 s，50℃ 15 s，72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；最佳反應(yīng)體系:PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 10 μL，Nuclease free Water 4.5 μL，上、下游引物分別為groEL 0.75 μmol/L，ospA 1 μmol/L，2種陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒各1 μL。以DEPC水為模板設(shè)置陰性對(duì)照。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立每個(gè)稀釋梯度的重復(fù)樣品Ct值相同，隨著標(biāo)準(zhǔn)品稀釋程度的增加，Ct值逐漸增大。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度與Ct值建立相關(guān)性，分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)，具有較好的線性相關(guān)性，其中埃里希氏體標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.108 5x+37.99，R2=0.983 3(圖2)，伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.114 2x+35.367，R2=0.993 1(圖3)。通過(guò)對(duì)拷貝數(shù)x與Ct值之間的線性關(guān)系進(jìn)行推算，可對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行定量。

1～10.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為1×1010～1×101拷貝/μL；11.陰性對(duì)照

2.4 熔解曲線分析本研究所建立的方法在1條平滑的熔解曲線上產(chǎn)生了2個(gè)特異性的峰值，分別對(duì)應(yīng)埃里希氏體和伯氏疏螺旋體的Tm值，與單引物熒光定量產(chǎn)生的熔解曲線Tm值相吻合(圖4)。結(jié)果判斷：實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，觀察熔解曲線峰值(Tm值)分析試驗(yàn)結(jié)果：若檢測(cè)樣品出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)且在Tm=(78.12±0.40)℃出現(xiàn)單一的特異性峰判為埃里希氏體陽(yáng)性；若檢測(cè)樣品出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)且在Tm=(80.2±0.14)℃出現(xiàn)單一的特異性峰判為伯氏疏螺旋體陽(yáng)性；若Tm=(76.61±0.34)℃和Tm=(80.2±0.14)℃均出現(xiàn)峰值，表明埃里希氏體和伯氏疏螺旋體混合感染。

2.5 特異性檢驗(yàn)運(yùn)用本研究所建立雙重?zé)晒舛縋CR方法對(duì)埃里希氏、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、立克次體、大腸桿菌、綠膿桿菌基因組進(jìn)行檢測(cè)，僅試驗(yàn)組埃里希氏體及伯氏疏螺旋體出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他組均無(wú)交叉反應(yīng)(圖5)。

1～10.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為1×1010～1×101拷貝/μL；11.陰性對(duì)照

1.埃里希氏體單引物擴(kuò)增；2.伯氏疏螺旋體單引物擴(kuò)增；3.雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增；4.陰性對(duì)照

圖5 埃里希氏體和伯氏疏螺旋體雙重?zé)晒舛縋CR特異性檢驗(yàn)

2.6 重復(fù)性檢驗(yàn)本研究所建立的方法輸出熔解曲線重合度較高，對(duì)應(yīng)Tm值較為穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.1，變異系數(shù)(CV)均小于0.1%(表2)；說(shuō)明本方法擴(kuò)增重復(fù)性好，有良好的穩(wěn)定性。

表2 雙重?zé)晒舛縋CR的不同濃度重復(fù)性分析

2.7 敏感性檢驗(yàn)用本研究建立的埃里希氏體和伯氏疏螺旋體雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法對(duì)梯度倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，得出該方法對(duì)埃里希氏體及伯氏疏螺旋體的檢測(cè)下限均為1×101拷貝/μL(圖6) 。

1～10.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為1×1010～1×101拷貝/μL；11.陰性對(duì)照

2.8 臨床樣品檢測(cè)及符合度評(píng)價(jià)經(jīng)形態(tài)學(xué)分類及PCR鑒定(圖7)，瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段與預(yù)期大小一致，獲得序列經(jīng)比對(duì)確定蜱蟲(chóng)種類均為全溝硬蜱。分別使用普通PCR和雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，對(duì)25份全溝硬蜱基因組DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)(圖8，9)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，其中陽(yáng)性樣品Ct值為11.08～20.49，本研究建立的方法中埃里希氏體檢出率為28%，伯氏疏螺旋體檢出率為60%，與普通PCR方法樣品檢出率高12%。

表3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 份

3 討論

埃里希氏體病檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)間接免疫熒光(IFA)是最早用于埃里希氏體病檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但該病原培養(yǎng)周期長(zhǎng)、需要特殊細(xì)胞系，培養(yǎng)難度高，且與該屬其他病原存在交叉反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，臨床上并不常用。萊姆病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括病原和血清學(xué)檢查。病原菌檢測(cè)由于病原體分離率低，生長(zhǎng)緩慢，操作周期長(zhǎng)，難以及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，血清學(xué)檢測(cè)抗體間可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，具有一定的不準(zhǔn)確性，并且無(wú)法判斷特異性抗體是持續(xù)出現(xiàn)還是反復(fù)出現(xiàn)[13]。

多重?zé)晒釶CR方法具有檢測(cè)效率高，即多重?zé)晒釶CR可以實(shí)現(xiàn)一管多檢，簡(jiǎn)化操作流程，節(jié)省試劑成本和操作時(shí)間，尤其是在開(kāi)展大量樣品檢測(cè)時(shí)，顯著地降低檢測(cè)成本和操作時(shí)間等優(yōu)勢(shì)。本研究選用性價(jià)比較高的SYBR Green Ⅰ染料法熒光定量PCR，利用SYBR Green 染料的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量之間的線性關(guān)系，對(duì)PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)并利用熔解曲線為鑒別診斷提供了理論和技術(shù)支撐[14]。熔解曲線是反映DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)隨溫度升高產(chǎn)生降解程度的曲

A.蜱蟲(chóng)樣品背側(cè)觀；B.蜱蟲(chóng)樣品腹側(cè)觀；C.部分蜱蟲(chóng)樣品CoxⅠ基因鑒定結(jié)果；M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2～5.部分蜱蟲(chóng)樣品擴(kuò)增結(jié)果

A.埃里希氏體陽(yáng)性樣品dsb基因鑒定結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2～6.埃里希氏體陽(yáng)性樣品)；B.伯氏疏螺旋體5S～23S間隔序列鑒定結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker；1～10.部分伯氏疏螺旋體陽(yáng)性樣品；11.陰性對(duì)照)

圖9 部分陽(yáng)性樣品雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)結(jié)果

線，其總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的熔解溫度稱為T(mén)m值，Tm值與基因序列中的G-C值相關(guān)，所以，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物由于G-C值的不同而出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的不同Tm峰值時(shí)，可以通過(guò)這個(gè)特征峰將特異產(chǎn)物與其他產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)，達(dá)到鑒別診斷的目的。

伴侶groEL是一種熱激蛋白，輔助蛋白質(zhì)的加工和裝配，具有重要的免疫原性，可刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞并直接誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。胞內(nèi)寄生菌可將groEL蛋白分泌到宿主細(xì)胞質(zhì)中。埃里希氏體groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性，常用作分子流行病學(xué)調(diào)查及菌種鑒定的靶基因[15]。

萊姆疏螺旋體主要的外膜蛋白有6種，其中ospA(the outer surface protein A)存在于90%的伯氏疏螺旋體中，是最主要的外膜蛋白之一。研究表明，ospA對(duì)螺旋體在硬蜱中腸定居至關(guān)重要[16]，其編碼基因是分子生物學(xué)診斷的主要檢測(cè)靶基因，對(duì)多位點(diǎn)進(jìn)行PCR診斷的同時(shí)也可對(duì)伯氏疏螺旋體進(jìn)行分型[17]。

本研究成功建立同時(shí)診斷埃里希氏體病和萊姆病的雙重?zé)晒舛縋CR方法，該方法反應(yīng)條件及程序同時(shí)適用于普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)，為同時(shí)對(duì)埃里希氏體和伯氏疏螺旋體的分子流行病學(xué)調(diào)查和埃里希氏體病及萊姆病的防控提供技術(shù)支持，由于本研究選擇的基因在宿主蜱及患病動(dòng)物體內(nèi)均可表達(dá)，故本研究同時(shí)具有檢測(cè)患病動(dòng)物血液是否含有菌株的潛力，有待后續(xù)研究的進(jìn)一步探索。