冠突散囊菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

景 悅，路曉杰，曹永國(guó)，張乃生

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因不明的慢性腸道炎癥，在人類和動(dòng)物中均存在一定的發(fā)病率[1]。UC表現(xiàn)為免疫異常，病程較長(zhǎng)并伴發(fā)許多并發(fā)癥，具有一定的癌變率甚至可誘發(fā)死亡[2]。目前UC患者可通過(guò)藥物治療控制病情，包括氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等。這些藥物雖可使病情得到緩解，但均會(huì)引起不同程度的副作用[3]。而且，有些患者無(wú)法獲得持久的緩解，必須通過(guò)手術(shù)切除大部分甚至全部結(jié)腸，但手術(shù)治療常會(huì)引起各種術(shù)后并發(fā)癥；因此，當(dāng)務(wù)之急是尋找新的可用于UC防治的療法。

UC發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，涉及遺傳易感性，腸道上皮屏障缺陷，免疫失調(diào)和環(huán)境因素等[4]。據(jù)報(bào)道，巨噬細(xì)胞反應(yīng)失調(diào)與UC的發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)，過(guò)表達(dá)的促炎因子增加了UC的發(fā)病率[5]。核因-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是調(diào)節(jié)炎癥的重要途徑，當(dāng)IκB磷酸化時(shí)，下游的NF-κB信號(hào)通路可通過(guò)p65易位激活進(jìn)入核內(nèi)，從而改變相關(guān)炎癥基因的表達(dá)。越來(lái)越多的研究表明，NF-κB參與了UC的發(fā)病機(jī)制，并且有針對(duì)性地抑制NF-κB可以減輕UC的預(yù)后[6]。而且，抑制NF-κB途徑激活可降低促炎細(xì)胞因子水平[6]。因此，探索調(diào)節(jié)NF-κB的新治療策略可能對(duì)UC治療有廣闊的前景。此外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號(hào)通路也是主要的炎癥途徑，在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌中起關(guān)鍵作用[7]。 從ZHANG等[8]的研究可知，MAPK信號(hào)通路在葡萄糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠中被顯著激活。另外，腸道屏障是保護(hù)腸道健康的重要防線。結(jié)腸中緊密連接(tight junction,TJ)蛋白的結(jié)構(gòu)異常是引發(fā)UC患者腸屏障破壞的重要因素之一[9]。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum,E.cristatum)是一種用于發(fā)酵茯磚茶的益生真菌，越來(lái)越多的研究表明，E.cristatum具備多種生物活性及藥理價(jià)值，例如提高機(jī)體免疫力、降血脂、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用[10]。然而，關(guān)于E.cristatum對(duì)UC的作用及其潛在機(jī)制尚無(wú)明確信息。本試驗(yàn)采用DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型來(lái)探索E.cristatum對(duì)UC的治療作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DSS(MK 36 000～50 000 Da)購(gòu)自MP Biomedicals公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)和白介素10(IL-10)ELISA試劑盒購(gòu)自Biolegend公司；IκB，p65，p38，p-IκB，p-p65，p-p38，β-actin等一抗購(gòu)自Cell Signaling TE.cristatumhnology 公司；HRP標(biāo)記的二抗山羊抗兔抗體和山羊抗小鼠抗體購(gòu)自Immunoway公司；TJ蛋白o(hù)ccludin一抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；即用型免疫組化超敏UItraSensitiveTMS-P檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司。

1.2 制備E.cristatum挑取茯磚茶葉上黃色菌落置于生理鹽水中，75℃水浴5～10 min后，倍比稀釋，并在麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基上涂開(kāi)，于30℃恒溫條件培養(yǎng)3～5 d。挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)鑒定是E.cristatum后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組將40只8周齡雄性C57BL/6J小鼠(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，中國(guó)遼寧)隨機(jī)分為4組：對(duì)照(Control)組，Control/E.cristatum組、DSS 組，DSS/E.cristatum組(每籠5只小鼠，每組10只小鼠)。試驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠于(24±1)℃適應(yīng)新環(huán)境1周。試驗(yàn)期間，Control組和Control/E.cristatum組小鼠每天自由飲水，DSS組和DSS/E.cristatum組小鼠每天飲用1.5% DSS，其中Control組和DSS組小鼠灌服無(wú)菌生理鹽水(每只小鼠0.2 mL/d)，Control/E.cristatum和DSS/E.cristatum組小鼠灌服E.cristatum(每只小鼠3×107孢子/d)，每天記錄體質(zhì)量，并根據(jù)建立的評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)，持續(xù)7 d。于試驗(yàn)結(jié)束后，處死所有小鼠，并收集相關(guān)樣品用于后續(xù)分析。

1.4 組織病理學(xué)觀察收集的結(jié)腸組織用10%中性福爾馬林緩沖液固定，脫水，石蠟包埋，以 5 μm 的厚度切片后用蘇木精和曙紅(HE)進(jìn)行染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 炎性細(xì)胞因子測(cè)定將結(jié)腸組織在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(1∶9)中勻漿，并將混合物在4℃、12 000 r/min 離心15 min后，收集上清液并用于炎性細(xì)胞因子測(cè)定。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)量TNF-α、IL-1β和IL-10的水平。

1.6 Western blot檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書方法提取結(jié)腸組織中的總蛋白。將蛋白質(zhì)樣品在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上分級(jí)分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用30% BSA封閉，加入適當(dāng)?shù)囊豢?℃過(guò)夜。次日，將蛋白膜與適當(dāng)?shù)亩狗跤詈笫褂蔑@影液進(jìn)行顯影。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)根據(jù)試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)occludin蛋白。將每個(gè)載玻片與一抗occludin(1∶500)在4℃孵育過(guò)夜，用PBS洗滌，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體孵育。然后，將每個(gè)切片用新制備的二氨基聯(lián)苯胺染色，最后將玻片在蘇木精中復(fù)染，并在氨水中返藍(lán)后于顯微鏡下觀察圖像。

2 結(jié)果

2.1E.cristatum對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的緩解作用DAI評(píng)分是衡量UC嚴(yán)重程度的常用參數(shù)，是糞便黏稠和直腸出血的綜合評(píng)分。Control組小鼠的體質(zhì)量和DAI評(píng)分始終無(wú)顯著性變化。與Control組小鼠相比，DSS組小鼠體質(zhì)量明顯減輕，DAI評(píng)分顯著增加。但是，E.cristatum干預(yù)促使UC小鼠的上述指標(biāo)發(fā)生了顯著改善(圖1A，B)。此外，與Control組相比，DSS組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，而E.cristatum明顯改善了DSS造成的結(jié)腸縮短的情況(圖1C，D)。與此同時(shí)，Control/E.cristatum組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)于Control組沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明該劑量的E.cristatum對(duì)正常小鼠無(wú)副作用。

A.體質(zhì)量變化；B.DAI評(píng)分；C，D.結(jié)腸長(zhǎng)度

2.2E.cristatum對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎結(jié)腸組織的保護(hù)作用病理組織學(xué)結(jié)果表明，Control組小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)較為完整，腸上皮細(xì)胞的形態(tài)清晰可見(jiàn)。而DSS可引起急性炎癥，其特征是杯狀細(xì)胞大面積丟失，隱窩消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞破壞。與DSS組相比，DSS/E.cristatum組的黏膜損傷情況得到了緩解。這表明E.cristatum可以有效地改善UC小鼠的腸道病理組織學(xué)變化(圖2A)。

TJ蛋白o(hù)ccludin是維持上皮細(xì)胞完整性和通透性的必不可少的機(jī)械屏障，其表達(dá)程度與結(jié)腸組織的健康程度密切相關(guān)。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，DSS組小鼠的結(jié)腸組織中occludin表達(dá)明顯降低，而E.cristatum干預(yù)后可明顯改善UC小鼠腸屏障的完整性(圖2B)。

2.3E.cristatum對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎炎性因子的調(diào)節(jié)作用為了探討E.cristatum對(duì)炎性細(xì)胞因子水平的影響，本試驗(yàn)檢測(cè)了結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎細(xì)胞因子(IL-10)的表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，DSS組小鼠的結(jié)腸組織中TNF-α和IL-1β水平顯著升高，而IL-10水平上顯著降低。E.cristatum干預(yù)后，UC小鼠的3種炎癥細(xì)胞因子的分泌水平均得到了顯著性改善(圖3A～C)。

A.組織病理學(xué)變化；B.腸屏障的完整性

*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.4E.cristatum對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎炎癥通路的影響已有研究證實(shí)了NF-κB信號(hào)途徑和MAPK信號(hào)途徑與腸道內(nèi)炎癥的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)[11-12]。磷酸化p65、IκB蛋白代表NF-κB信號(hào)途徑的激活狀態(tài)，磷酸化p38代表MAPK的激活狀態(tài)。結(jié)果顯示，與Control組小鼠相比，DSS組小鼠的結(jié)腸組織中磷酸化p65、IκB和p38的表達(dá)顯著上調(diào)，E.cristatum干預(yù)顯著抑制了UC小鼠結(jié)腸組織中磷酸化p65、Iκ-B和p38的水平(圖4)；表明E.cristatum可以通過(guò)抑制NF-κB和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)的激活發(fā)揮抗炎作用。

圖4 Western blot檢測(cè)p65、p-p65、IκB、p-IκB、p38和p-p38的蛋白表達(dá)(A，C)及量化分析(B，D)

3 討論

UC是一種病因不明，對(duì)直腸和結(jié)腸有害的疾病。近年來(lái)，UC的發(fā)病率和患病率在全球范圍內(nèi)逐年增加，但其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。AHMED等[13]研究認(rèn)為UC主要與遺傳、感染、環(huán)境和免疫有關(guān)。UC的藥物治療主要基于氨基水楊酸、激素和免疫抑制劑，雖然可以控制UC癥狀，但肝毒性、激素抵抗性、副作用等問(wèn)題難以解決。因此,更為合理及有效的替代治療法仍然有待發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，多種天然食物成分被發(fā)掘于治療UC。橙皮苷可通過(guò)降低結(jié)腸組織中的髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量來(lái)下調(diào)血清中IL-6的水平[14]。大蒜素能調(diào)節(jié)CD68、MPO、MDA和炎癥因子表達(dá)，從而改善DSS誘導(dǎo)的UC[15]。GAO等[16]發(fā)現(xiàn)綠原酸通過(guò)抑制MAPK / ERK / JNK信號(hào)通路在UC的治療中發(fā)揮作用。E.cristatum是存在于茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)真菌，對(duì)茯磚茶的顏色和風(fēng)味起著重要作用，E.cristatum與金黃色葡萄球菌混合發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[17]。KANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)E.cristatum可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群改善肥胖。E.cristatum具有多種生物活性及藥用價(jià)值，但目前尚未有其改善UC的作用的報(bào)道；因此本試驗(yàn)以DSS誘導(dǎo)的小鼠作為UC動(dòng)物模型探究E.cristatum對(duì)UC的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

DAI評(píng)分是評(píng)估UC嚴(yán)重程度的主要參數(shù)[19]。在DSS組小鼠中，DAI分?jǐn)?shù)顯著增加，但是，E.cristatum明顯改善了DSS處理小鼠的DAI評(píng)分。此外，E.cristatum還改善了DSS引起的結(jié)腸縮短。本試驗(yàn)從病理組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DSS處理可導(dǎo)致隱窩和杯狀細(xì)胞明顯丟失，但是，E.cristatum顯著改善了這些變化，表明E.cristatum對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC具有保護(hù)作用。而且，Control/E.cristatum組的各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)于Control組沒(méi)有明顯變化，表明在試驗(yàn)劑量下，E.cristatum對(duì)機(jī)體沒(méi)有副作用。

研究表明，UC的發(fā)病機(jī)理與炎癥環(huán)境息息相關(guān)。UC患者的腸道上皮細(xì)胞會(huì)沉浸在慢性炎癥細(xì)胞因子環(huán)境中，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的促炎細(xì)胞因子[20]。在本試驗(yàn)中，DSS可顯著升高結(jié)腸組織中TNF-α和IL-1β的水平，而E.cristatum干預(yù)后顯著下調(diào)了UC小鼠結(jié)腸組織中的這些促炎細(xì)胞因子。作為多效抗炎細(xì)胞因子，大多數(shù)造血細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-10[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，E.cristatum干預(yù)可提高UC小鼠結(jié)腸中IL-10的水平。

UC是一種免疫相關(guān)疾病，NF-κB是調(diào)節(jié)固有免疫反應(yīng)和炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。激活的NF-κB通過(guò)參與調(diào)節(jié)結(jié)腸和直腸黏膜中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，達(dá)到抑制UC的作用。NF-κB的激活主要是通過(guò)其抑制劑IκB的磷酸化和解離來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，IκB和p65的磷酸化水平明顯增加[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，E.cristatum可以降低IκB和p65蛋白的磷酸化水平，從而抑制NF-κB的活性。MAPK是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶，參與介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、分裂和凋亡的過(guò)程，MAPK途徑與腸道損傷有關(guān)[23]。在MAPK中，p38被認(rèn)為是主要激酶，可以被多種細(xì)胞因子、激素和蛋白質(zhì)誘導(dǎo)[24]。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越意識(shí)到MAPK/p38信號(hào)通路在UC的發(fā)病機(jī)制中的重要作用[25]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E.cristatum可以改善UC小鼠的MAPK 信號(hào)通路中p-p38蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，E.cristatum可通過(guò)抑制NF-κB和MAPK分子途徑的激活發(fā)揮出色的抗炎功能。

腸道上皮細(xì)胞的TJ是維持細(xì)胞完整性和通透性的必不可少的機(jī)械屏障。據(jù)報(bào)道，UC患者的TJ蛋白如occludin的表達(dá)量明顯降低[26]。因此，調(diào)節(jié)TJ蛋白對(duì)于治療UC至關(guān)重要。本試驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)分析了occludin的表達(dá)，結(jié)果表明，E.cristatum處理抑制了DSS誘導(dǎo)的occludin表達(dá)水平下降，表明E.cristatum可能在維持occludin表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用，從而平衡了屏障的完整性并減輕了對(duì)結(jié)腸的損害。

綜上所述，E.cristatum可明顯地降低UC的嚴(yán)重程度，修復(fù)受損的結(jié)腸組織及腸道屏障，調(diào)節(jié)炎性因子，具有一定的抗炎效應(yīng)，且這一效應(yīng)很有可能是通過(guò)調(diào)控 NF-κB 信號(hào)通路和 MAPK 信號(hào)通路的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，E.cristatum可能是防治UC的一種新的天然產(chǎn)物，這對(duì)人類與動(dòng)物的UC在臨床上的治療與推廣具有一定的指導(dǎo)意義。