禽源Klebsiella variicola引起宿主血流感染的SNP篩選分析

尹 磊，沈?qū)W懷，張丹俊，趙瑞宏，戴 銀，胡曉苗，周學(xué)利，潘孝成

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

Klebsiellavariicola是肺炎克雷伯菌復(fù)合體家族成員之一，作為一種新出現(xiàn)的人獸共患病原菌，它對(duì)宿主具有多種感染方式，其中最常見也是最嚴(yán)重的方式是血流感染(bloodstream infection，BSI)[1]。近年來，由Klebsiellavariicola引起的感染事件頻繁發(fā)生，不僅嚴(yán)重威脅著人類的健康，而且對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。Klebsiellavariicola的致病性主要依賴于自身攜帶的毒力因子，這與先前在肺炎克雷伯菌中描述的毒力因子是相對(duì)應(yīng)的，主要有莢膜、脂多糖(LPS)、鐵載體和菌毛等[3]。

BSI是細(xì)菌等病原微生物侵入血液生長繁殖并產(chǎn)生大量毒素和代謝產(chǎn)物，它會(huì)導(dǎo)致高度活躍的炎癥免疫反應(yīng)，隨后誘導(dǎo)過多的炎性細(xì)胞因子或趨化因子，進(jìn)而引起的嚴(yán)重全身性感染綜合征，可導(dǎo)致感染性體克、急性呼吸窘迫綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血甚至多器官功能障礙綜合征等一系列并發(fā)癥，是感染性疾病最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式之一[4]。為了引起B(yǎng)SI，病原微生物必須避開血流中的多種宿主防御機(jī)制，包括吞噬作用、血清補(bǔ)體和抗菌肽的殺菌作用。事實(shí)上，抗血清殺菌能力已被證明是病原微生物的一個(gè)重要毒力特征[5]。研究表明，Klebsiella的致病特性與其血清抗性密切相關(guān)，莢膜和LPS在細(xì)菌抵抗血清殺菌活性中發(fā)揮著重要作用，其主要機(jī)理可能是通過限制C3補(bǔ)體蛋白在細(xì)菌表面的沉積、阻斷膜攻擊復(fù)合物或其他一些尚不清楚的機(jī)制來促進(jìn)Klebsiella的血清抵抗力，從而引起宿主的BSI[6]。此外，動(dòng)物血清中的鐵被轉(zhuǎn)鐵蛋白等宿主化合物隔離，導(dǎo)致游離鐵的濃度極低[7]，由于鐵是一系列細(xì)菌功能所必需的，因此，Klebsiellavariicola是否通過調(diào)控自身新陳代謝，以適應(yīng)血清中可獲得的營養(yǎng)物質(zhì)，這一過程還有待研究探討。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-sequencing，RNA-Seq)可以對(duì)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類分析，確定功能基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu),常用于新基因的挖掘、已有基因結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、可變剪接事件的尋找以及RNA水平上的單核甘酸多態(tài)性(SNP)篩查等[8]，為進(jìn)一步研究相關(guān)基因的功能提供參考。目前，關(guān)于Klebsiellavariicola在抵抗血清殺菌活性的研究國內(nèi)外尚無報(bào)道，因此，本研究采用RNA-Seq技術(shù)比較了禽源Klebsiellavariicola在LB肉湯培養(yǎng)基和SPF雞血清中的轉(zhuǎn)錄組SNP，篩選出Klebsiellavariicola在宿主血清中生存和發(fā)展相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究禽源Klebsiellavariicola導(dǎo)致宿主BSI的相關(guān)基因提供參考，從而為Klebsiellavariicola致病機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株AHKv-S01分離自安徽某家禽養(yǎng)殖場，經(jīng)全基因組測序鑒定為野生型致病性Klebsiellavariicola，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存，GenBank登錄號(hào)為CP047360。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)挑取AHKv-S01的單菌落接種于LB肉湯中，37℃、150 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。次日，以1∶100比例分別接種于LB肉湯中和SPF雞血清，振蕩培養(yǎng)至菌液D600 nm值為0.4～0.6，4℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，菌體沉淀用無菌PBS洗滌3次，收集菌體沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA-Seq測序提取LB組和SPF雞血清組的總RNA，使用Illumina公司生產(chǎn)的Ribo-Zero Magnetic Kit(Bacteria,MRZB12424)消化核糖體RNA，加入打斷試劑將RNA打斷成短片段；以打斷后的RNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA。在cDNA二鏈合成時(shí)以dUTP代替dTTP，然后連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP的1條鏈進(jìn)行消化，只保留連接鏈不同接頭的cDNA一鏈；使用試劑盒純化cDNA一鏈；純化的cDNA一鏈再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的RNA文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina測序儀進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析測序所得的數(shù)據(jù)稱為raw reads，隨后對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)控(QC)，以確定測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。質(zhì)控合格后，將過濾之后的clean reads 比對(duì)到參考基因組上。通過統(tǒng)計(jì)比對(duì)率、reads在參考序列上的分布情況等，判斷比對(duì)結(jié)果是否通過第2次質(zhì)控(QC of alignment)。若通過，基于樣本與參考基因組的比對(duì)結(jié)果，利用Samtools軟件進(jìn)行染色體坐標(biāo)排序、去重等處理，再用Samtools、Bedtools等軟件預(yù)測樣本中的SNP位點(diǎn)。為了降低SNP檢測的錯(cuò)誤率，使用 QUAL(a quality score associated with the inference of the given allele) ≥20，且DP(combined depth across samples)≥4進(jìn)行過濾結(jié)果。然后利用SnpEff等軟件進(jìn)行功能注釋，對(duì)篩選出的SNP位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析、pathway顯著性富集分析，篩選出與抗血清殺菌能力相關(guān)的基因。

1.5 qRT-PCR熒光定量驗(yàn)證隨機(jī)選取7個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因，以GenBank公布的dnaE基因作為內(nèi)參基因。用Primer(Version 5.0)軟件分析并設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。采用SYBR GreenⅠ方法進(jìn)行mRNA表達(dá)量分析，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 SNP篩選與分析以QUAL≥20且DP≥4為標(biāo)準(zhǔn)篩選SNP位點(diǎn)。相較于LB組，血清組分別獲得210 434，195 472，150 845個(gè)SNP位點(diǎn)，通過韋恩圖取3組的交集，獲得143 682個(gè)SNP位點(diǎn)(圖1)，其中檢測到單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)有100 790個(gè)，顛換(transversion)42 890個(gè)，包括A-C(4 444個(gè))，A-G(24 078個(gè))，A-T(3 315個(gè))，C-A(4 576個(gè))，C-G(9 123個(gè))，C-T(26 181個(gè))，G-A(25 838個(gè))，G-C(9 398個(gè))，G-T(4 631個(gè))，T-A(3 116個(gè))，T-C(24 693個(gè))，T-G(4 287個(gè))。在所有檢出的SNP中，轉(zhuǎn)換類型總數(shù)(A-G，C-T，G-A和T-C)極顯著高于顛換類型總數(shù)(A-C，A-T，C-A，C-G，G-C，G-T，T-A和T-G)(P<0.01)；而轉(zhuǎn)換類型SNP中，A-G，C-T，G-A和T-C并不存在顯著性差異(P>0.05，圖2)。此外，對(duì)獲得的SNP位點(diǎn)所在區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)SNP主要集中在外顯子區(qū)域(131 093個(gè))，這些SNP相較于其他區(qū)域的SNP更容易引起基因的有效突變，從而導(dǎo)致基因功能及菌株性狀發(fā)生差異(圖3)。

每部分中的數(shù)字表示不同血清組的SNP的數(shù)量

圖2 SNP突變類型統(tǒng)計(jì)

圖3 SNP所在區(qū)域統(tǒng)計(jì)

2.2 SNP對(duì)應(yīng)基因的GO富集分析通過對(duì)SNP位點(diǎn)所在基因進(jìn)行GO富集分析，篩選3種分類(biological process、cellular component、molecular function)中對(duì)應(yīng)差異基因數(shù)目大于2的GO條目，按照每個(gè)條目對(duì)應(yīng)的-log10Pvalue由大到小排序的各10條,篩選前30條GO條目(圖4)。結(jié)果顯示，基因參與的生物過程主要富集在DNA脫烷基化與DNA修復(fù)、DNA去甲基化、γ-氨基丁酸分解代謝過程、鐵同化過程、蛋白水解過程等；細(xì)胞組分主要有細(xì)胞外膜的組成部分、硝酸還原酶復(fù)合物、核酸外切酶修復(fù)復(fù)合物、膜的組成部分、孔復(fù)合體等；分子功能主要有醇脫氫酶(NADP+)活性、甲基化DNA- [蛋白質(zhì)]-半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶活性、組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移激酶活性、鎳陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、磷酸泛素結(jié)合等。

圖4 GO富集分析圖(Top 30)

2.3 SNP對(duì)應(yīng)基因的KEGG富集分析將位于基因外顯子區(qū)域的SNP結(jié)合RNA-Seq測序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步富集獲得上述SNP位點(diǎn)所在的候選差異基因，在此基礎(chǔ)上結(jié)合KEGG注釋結(jié)果，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)其所在基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因主要富集在8個(gè)與宿主抗血清殺菌能力相關(guān)的通路上，其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白158個(gè)，鐵載體基團(tuán)非核糖體肽的生物合成5個(gè)，細(xì)菌的趨化性4個(gè)，二元調(diào)控系統(tǒng)63個(gè)，群體感應(yīng)35個(gè)，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)25個(gè)，LPS生物合成7個(gè)，細(xì)菌分泌系統(tǒng)9個(gè)(圖5)。

圖5 KEGG通路富集

2.4 熒光定量PCR分析SNP對(duì)應(yīng)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平隨機(jī)選擇7個(gè)位于KEGG富集通路中的基因，通過熒光定量PCR比較LB組與SPF血清組各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明(圖6)，相較于LB組，SPF血清組各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.01)。

圖6 qRT-PCR分析SNP對(duì)應(yīng)基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

3 討論

Klebsiellavariicola是革蘭陰性機(jī)會(huì)性病原體，在人和動(dòng)物感染中普遍存在，長期以來，Klebsiellavariicola和Klebsiellapneumoniae表現(xiàn)出相似的生化特征；因此，Klebsiellavariicola常被誤認(rèn)為是肺炎克雷伯菌，隨著基因組測序技術(shù)和系統(tǒng)分型方法的發(fā)展，Klebsiellavariicola作為一種新的人獸共患病原菌被鑒定[9-10]。人感染Klebsiellapneumoniae的重要性已為所知，但對(duì)Klebsiellavariicola的相關(guān)知識(shí)還很匱乏。最新的研究表明，在成人患者中，由Klebsiellavariicola引起的BSI與30 d死亡率最高相關(guān)，而與Klebsiellapneumoniae感染相關(guān)的死亡率相比則較低，同時(shí)，在患有血流感染的宿主中，Klebsiellavariicola的臨床分離率更高。相關(guān)研究顯示，雖然Klebsiellavariicola的毒力不如典型的臨床Klebsiellapneumoniae分離株，但由Klebsiellavariicola引起的感染會(huì)造成更為嚴(yán)重的后果[11]。迄今為止，很少有研究報(bào)道農(nóng)場動(dòng)物中存在Klebsiellavariicola感染，對(duì)農(nóng)場動(dòng)物健康生產(chǎn)的潛在風(fēng)險(xiǎn)知之甚少。本研究從安徽省某養(yǎng)禽場分離到1株禽源Klebsiellavariicola，該菌能造成雛雞孵化率顯著降低，其感染方式是BSI，通過RNA-Seq分析該菌在雞血清中生存和生長的SNP位點(diǎn)來評(píng)判Klebsiellavariicola在發(fā)病機(jī)制中的重要作用，從而為防控Klebsiellavariicola提供新的策略。

在基因組水平上，由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性即稱為SNP,SNP可進(jìn)行復(fù)雜性狀的關(guān)聯(lián)分析，從而揭示相關(guān)性狀的機(jī)理[12]。本試驗(yàn)利用血清這種生長條件來模擬Klebsiellavariicola在宿主感染期間遇到的條件，進(jìn)而去洞察Klebsiellavariicola適應(yīng)血清所需SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的變化，從而為解析Klebsiellavariicola引起的BSI性狀的調(diào)控機(jī)理提供理論參考。一直以來，Klebsiellavariicola被認(rèn)為是開放性的基因組，其原因在于它能通過適應(yīng)不同的環(huán)境條件來整合毒力因子的變異程度，從來增強(qiáng)自身的致病性[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，血清組SNP位點(diǎn)的變化對(duì)應(yīng)的基因主要富集在鐵載體的生物合成，二元調(diào)控系統(tǒng)，群體感應(yīng)系統(tǒng)，LPS的生物合成等，這與Klebsiellavariicola目前已鑒定出的毒力因子是相對(duì)應(yīng)的，也提示了SNP位點(diǎn)的變化與Klebsiellavariicola對(duì)毒力基因的整合程度有一定的關(guān)聯(lián)性。

病原菌在宿主體內(nèi)生存繁殖的過程中，會(huì)不可避免的感受特定刺激信號(hào)的調(diào)控，通過激活一系列與毒力相關(guān)的基因來作出應(yīng)答反應(yīng)，形成復(fù)雜的級(jí)聯(lián)式或特定的復(fù)合體式協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，耐受或逃避宿主的防衛(wèi)機(jī)制，最終引發(fā)宿主致病[14]。在本研究中，Klebsiellavariicola適應(yīng)宿主血清環(huán)境的過程中，SNP位點(diǎn)的變化涉及到多種信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的改變，包括二元調(diào)控系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)、細(xì)菌的化學(xué)趨化系統(tǒng)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵載體的合成以及LPS的生物合成等。二元調(diào)控系統(tǒng)是病原菌對(duì)各種環(huán)境信號(hào)作出反應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制，病原菌通過感應(yīng)外界環(huán)境的變化而產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)，通過二元調(diào)控系統(tǒng)接收信號(hào)進(jìn)而啟動(dòng)一系列相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[15]。二元調(diào)控系統(tǒng)的存在使得病原菌在入侵宿主體內(nèi)的過程中大大地降低了被宿主免疫系統(tǒng)清除的可能性，這一過程包括病原菌在宿主的血清環(huán)境[16]。本試驗(yàn)結(jié)果提示Klebsiellavariicola的二元調(diào)控系統(tǒng)在調(diào)控對(duì)宿主抗血清殺菌活性中發(fā)揮重要作用，但該信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與Klebsiellavariicola毒力調(diào)節(jié)之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的探討。細(xì)菌的化學(xué)趨化性能確保其逃離不利的生存環(huán)境，從而增強(qiáng)生存上的競爭優(yōu)勢[17]，這種競爭優(yōu)勢可能是Klebsiellavariicola能夠在宿主血清環(huán)境中生存和發(fā)展的重要因素。群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌群體對(duì)信號(hào)分子的協(xié)同應(yīng)答，從而在多細(xì)胞水平上傳遞級(jí)聯(lián)信號(hào)的過程，最終使細(xì)菌利用群體的力量來應(yīng)付宿主的免疫清除。群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控病原菌的多種生理學(xué)功能，其中最主要的是調(diào)控生物被膜的形成[18]。我們推測生物被膜的形成使Klebsiellavariicola能夠形成協(xié)調(diào)的生存策略，從而適應(yīng)宿主的血清環(huán)境并促進(jìn)Klebsiellavariicola的存活，具體過程還有待后續(xù)進(jìn)一步的驗(yàn)證。當(dāng)病原菌內(nèi)化到宿主細(xì)胞時(shí)，它們需要適應(yīng)可利用營養(yǎng)物質(zhì)的新陳代謝，主要是宿主細(xì)胞中的碳源。例如碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)主要是通過磷酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)將各種糖及其衍生物進(jìn)行磷酸化然后運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)。其不僅參與碳、氮中心代謝，還調(diào)節(jié)鐵、鉀穩(wěn)態(tài)，調(diào)控某些病原體的毒力，還能介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)。在這些不同的調(diào)節(jié)過程中，信號(hào)由PTS組分的磷酸化狀態(tài)提供，而該磷酸化狀態(tài)根據(jù)PTS底物的可用性和細(xì)胞代謝狀態(tài)的變化而變化[19]。在本研究中，PTS可能通過干擾Klebsiellavariicola的整體代謝來影響其在血清中的存活。據(jù)報(bào)道，病原菌在抵抗宿主的血清殺菌能力的過程中，LPS通過介導(dǎo)補(bǔ)體蛋白形成連鎖反應(yīng)在菌體表面聚集成復(fù)合物，從而保護(hù)細(xì)菌不被殺滅[20]，此外，鐵是細(xì)菌生長繁殖的關(guān)鍵分子，是許多細(xì)胞過程所必需的。然而，由于Fe3+在生理?xiàng)l件下的不溶性以及Fe2+和Fe3+對(duì)宿主的限制，導(dǎo)致血清中的游離鐵很少。為了促進(jìn)病原菌在血清中的存活力，因此，入侵的細(xì)菌病原體編碼高親和力的鐵獲取系統(tǒng)來抵消宿主的營養(yǎng)免疫過程[21]。鐵載體是細(xì)菌內(nèi)部合成的小分子，然后輸出。在細(xì)胞外，鐵載體以極高的親和力結(jié)合環(huán)境中的鐵，并被運(yùn)回細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)菌提供生長所需的鐵，在這個(gè)過程中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)發(fā)揮著重要的作用，致病菌分泌的鐵載體的高親和性鐵離子-復(fù)合物分子通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的鐵離子通道來實(shí)現(xiàn)重新吸收[22]。此外，本試驗(yàn)從上述SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因富集的信號(hào)通路中隨機(jī)選取的7個(gè)基因，經(jīng)qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在血清中Klebsiellavariicola基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平是顯著上調(diào)的，這除了與先前的研究結(jié)果相兼容以外，對(duì)一些新的基因或調(diào)控系統(tǒng)在Klebsiellavariicola抗血清殺菌能力的解釋中似乎也是合理的。

本研究利用RNA-Seq比較Klebsiellavariicola在LB肉湯培養(yǎng)基和SPF雞血清中的SNP，發(fā)現(xiàn)篩選出的SNP所在的基因主要富集在二元調(diào)控系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)、細(xì)菌的化學(xué)趨化系統(tǒng)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵載體的合成以及LPS的生物合成等途徑。本研究對(duì)禽源Klebsiellavariicola在宿主血液環(huán)境中生存和發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行了初步分析和探索，為進(jìn)一步研究Klebsiellavariicola的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。