雞巨噬細(xì)胞CCL4抗禽白血病病毒作用及其機(jī)制初探

陳緒靖，趙宗儀，吉紫荊，豆春峰，吳 挺，陳世豪，耿拓宇，胡序明*，崔恒宓*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

病毒感染后其免疫應(yīng)答反應(yīng)的差異性與家禽遺傳抗性有關(guān)，特別是天然免疫基因在禽類病毒感染后的差異表達(dá)與宿主對(duì)病毒的易感性密切相關(guān)[1]。因此，抗病毒天然免疫也成為家禽病毒與宿主相互作用的研究熱點(diǎn)。其中，趨化因子(chemokines)在炎癥反應(yīng)中的重要作用及其在病毒感染后的異常表達(dá)已逐漸引起科學(xué)家們的研究興趣。

趨化因子配體4(chemokine CC motif ligand 4,CCL4)屬于CC類趨化因子亞家族，又稱巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1β(macrophage inflammatory protein-1β,MIP-1β)，通過(guò)特異性結(jié)合免疫細(xì)胞表面的CCR5受體以發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[2]。研究表明，CCL4是一個(gè)關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，在天然免疫應(yīng)答和病毒清除過(guò)程中起到重要作用。近年來(lái)，CCL4在家禽病毒感染過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律已逐漸被認(rèn)識(shí)。傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)感染早期，CCL4基因在法氏囊組織中的表達(dá)明顯升高[3]，但是在J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)感染的18胚齡中并未檢測(cè)到CCL4基因的差異表達(dá)。隨后檢測(cè)10日齡和30日齡雞法氏囊組織，發(fā)現(xiàn)CCL4基因在前者中表達(dá)顯著上調(diào)，而在后者中其表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)明顯下降[4]。另外，CCL4基因在易感品系雞中差異表達(dá)，并影響雞對(duì)新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染的敏感性[5]。目前，對(duì)CCL4基因特別是在禽類腫瘤病毒感染過(guò)程中具體作用和機(jī)制的研究甚少。

本試驗(yàn)選擇雞CCL4基因作為研究對(duì)象，探索CCL4在禽類腫瘤病毒ALV-J感染巨噬細(xì)胞(HD11)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)ALV-J感染HD11細(xì)胞后主要抑制CCL4表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CCL4的下調(diào)與ALV-J病毒編碼的env蛋白有關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)CCL4可能通過(guò)激活抗病毒基因S100A9相關(guān)的上、下游通路來(lái)抑制ALV-J的增殖。本試驗(yàn)為今后深入研究CCL4的功能及其宿主遺傳抗性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料DMEM basic(1×)高糖培養(yǎng)基、RPMI Medium 1640 basic(1×)培養(yǎng)基和胎牛血清FBS(美國(guó)Gibco公司)；XfectTMTransfection Reagent(日本TaKaRa公司)；RNA-easy Isolation Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT SuperMIX for qPCR(+gDNA wiper)、熒光染料ChamQ SYBR qPCR、Taq酶和膠回收試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；胰蛋白酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞(蘇州新賽美生物科技有限公司)；限制性核酸內(nèi)切酶 Hind Ⅲ、BamHⅠ和T4DNA連接酶(美國(guó)NEB公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA純化試劑盒(美國(guó)Omega Bio-tek公司)；pGEM-T-easy Vector(美國(guó)Promega公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。ALV-J JS09GY3和ALV單抗JE9均由揚(yáng)州大學(xué)秦愛(ài)建教授饋贈(zèng)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成PCR及qPCR引物根據(jù)NCBI的已知序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 PCR及qPCR引物序列

1.2 RT-qPCR檢測(cè)目的基因表達(dá)水平參照Vazyme總RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行總RNA的提取；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q RT SuperMIX for qPCR(+gDNA wiper)將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物；cDNA產(chǎn)物稀釋后通過(guò)CFX ConnectTM實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行定量分析。以CCL4、S100A9、IFN-α、TLR7為檢測(cè)基因，GAPDH作為內(nèi)參基因。20 μL反應(yīng)體系：ChamQ SYBR qPCR 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，無(wú)酶水5 μL。反應(yīng)條件：95℃ 3 min;95℃ 10 s,60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析結(jié)果。

1.3 獲得雞CCL4基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的雞CCL4基因(登錄號(hào)：NM_001030360.2)的mRNA編碼蛋白區(qū)序列，設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增出全長(zhǎng)產(chǎn)物的引物。其中，5′端含有Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)，3′端含有BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，兩端分別加上3個(gè)保護(hù)堿基。使用20 μL PCR擴(kuò)增體系：2×Taq酶10 μL,cDNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL,RNase-free water 7 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃ 7 min,4℃保存PCR產(chǎn)物。進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的片段后，參照Promega公司pGEM-T載體系統(tǒng)說(shuō)明書將其與pGEM-T Vector室溫連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后涂板,用Amp抗性篩選法挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌檢PCR，最后挑選5個(gè)陽(yáng)性菌,由蘇州金唯智生物公司測(cè)序。

1.4 構(gòu)建CCL4、ALV-J env、ALV-J GP85和ALV-J GP37真核表達(dá)載體及鑒定取正確序列的重組質(zhì)粒進(jìn)行大量擴(kuò)增。用Hind Ⅲ和BamHⅠ自pGEM-T載體上切下目的基因，16℃過(guò)夜正向連接至pcDNA3.1表達(dá)載體對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)上，重組成雞CCL4基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CCL4轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α,后續(xù)試驗(yàn)方法同上。測(cè)序所得正確結(jié)果的重組質(zhì)粒采用雙酶切法鑒定。50 μL酶切體系：2 μg 重組質(zhì)粒,Hind Ⅲ內(nèi)切酶1 μL,BamHⅠ內(nèi)切酶1 μL,Cutsmart 5 μL,RNase-free water補(bǔ)足至50 μL。置于37℃水浴中反應(yīng)3～6 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別獲得了與目的條帶相符的片段和pcDNA3.1表達(dá)載體大小的片段，說(shuō)明pcDNA3.1-CCL4真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以大量擴(kuò)增重組質(zhì)粒后抽提，制備好的重組真核表達(dá)載體用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照上述步驟構(gòu)建其他3個(gè)基因真核表達(dá)載體。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)37℃水浴復(fù)蘇雞巨噬細(xì)胞系HD11后，使用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于41℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定時(shí)給細(xì)胞傳代，避免細(xì)胞狀態(tài)不佳從而影響試驗(yàn)結(jié)果。

1.6 病毒感染先將HD11細(xì)胞接種至6孔板，待孔中細(xì)胞密度達(dá)到約50%時(shí)將 ALV-J(MOI=5)接種于細(xì)胞孔中，用病毒分別感染細(xì)胞6，12，24，36，48 h 后收集細(xì)胞檢測(cè)病毒復(fù)制水平，同時(shí)設(shè)置每個(gè)感染病毒時(shí)間點(diǎn)的空白對(duì)照組。

1.7 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d，處理HD11細(xì)胞接種至6孔板(每個(gè)孔接種約4×105個(gè)細(xì)胞)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)，使用ALV-J感染細(xì)胞，6～8 h 后進(jìn)行重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；當(dāng)每個(gè)孔細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)，使用XfectTMTransfection Reagent納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑盒，將室溫下靜置10 min的重組質(zhì)粒與納米顆?；旌衔锛尤爰?xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置pcDNA3.1-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒作為對(duì)照組，41℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞的熒光亮度，以此判斷細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。

1.8 Western blot將SDS-PAGE膠置于電泳槽，每孔上樣20 ng總蛋白，90 V電泳20 min后電壓改為120 V 2 h。膜轉(zhuǎn)移按照黑色面—濾紙—海綿—膠—膜—海綿—濾紙—白色面的順序，置于膜轉(zhuǎn)移液中，200 mA轉(zhuǎn)移2 h。將轉(zhuǎn)移膜放入含5%脫脂乳的TBST封閉1 h。將ALV-J囊膜糖蛋白的特異性單抗JE9和內(nèi)參GAPDH抗體用含5%脫脂乳的TBST進(jìn)行稀釋，4℃過(guò)夜孵育。TBST洗滌3次，每次5 min，加入用含5%脫脂乳的TBST稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色并拍照。

2 結(jié)果

2.1 CCL4基因在ALV-J感染HD11細(xì)胞不同時(shí)間后的表達(dá)規(guī)律首先分析ALV-J感染對(duì)雞CCL4基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。熒光定量PCR結(jié)果顯示，在ALV-J感染早期的HD11細(xì)胞中，CCL4基因表達(dá)量在病毒感染后6 h上調(diào)(圖1A)。隨著ALV-J不斷增殖(圖1B)，CCL4基因在病毒感染的巨噬細(xì)胞中持續(xù)性下調(diào)表達(dá)。如圖1A所示，ALV-J感染后24，36，48 h，CCL4基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)均極顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)果表明，ALV-J感染HD11細(xì)胞后主要抑制CCL4基因表達(dá)。

A.CCL4基因在ALV-J感染的HD11細(xì)胞中的表達(dá)情況；B.不同時(shí)間ALV-J增殖情況

2.2 CCL4、ALV-J env、ALV-J GP85和ALV-J GP37真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建pGEM-T-CCL4載體用通用引物M13進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的CCL4 mRNA序列同源性達(dá)100%，說(shuō)明已經(jīng)成功擴(kuò)增出CCL4基因編碼蛋白區(qū)域。按上述步驟將ALV-J env、ALV-J GP85和ALV-J GP37連入pGEM-T載體中測(cè)序，結(jié)果顯示，3個(gè)基因的序列同源性分別達(dá)99%。如圖2所示，分別對(duì)4個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切處理，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在5 000,270,1 700,1 000，600 bp左右處可見(jiàn)明顯條帶，測(cè)序結(jié)果同上，說(shuō)明4個(gè)目的片段已經(jīng)成功連接入表達(dá)載體中，pcDNA3.1-CCL4、pcDNA3.1-ALV-J env、pcDNA3.1-ALV-J GP85、pcDNA3.1-ALV-J GP37這4個(gè)重組真核表達(dá)載體構(gòu)建正確，可用于下一步試驗(yàn)。

M.DL5000 DNA Marker；1.pcDNA3.1-CCL4雙酶切產(chǎn)物；2.pcDNA3.1-ALV-J env雙酶切產(chǎn)物；3.pcDNA3.1-ALV-J GP85雙酶切產(chǎn)物；4.pcDNA3.1-ALV-J GP37雙酶切產(chǎn)物

2.3 ALV-J的env基因抑制CCL4基因表達(dá)進(jìn)一步分析ALV-J的env基因是否抑制CCL4基因表達(dá)。用上述構(gòu)建的pcDNA3.1-ALV-J env、pcDNA3.1-ALV-J GP85和pcDNA3.1-ALV-J GP37共3個(gè)過(guò)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染HD11巨噬細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR分析CCL4基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，ALV-J env、ALV-J GP85和GP37均能極顯著抑制CCL4基因表達(dá)(P<0.01)，表明ALV-J可以通過(guò)其編碼env基因抑制CCL4的表達(dá)，也進(jìn)一步證實(shí)了ALV-J感染巨噬細(xì)胞后主要抑制CCL4基因表達(dá)。

圖3 ALV-J env過(guò)表達(dá)對(duì)CCL4基因的影響

2.4 CCL4基因過(guò)表達(dá)抑制ALV-J增殖既然ALV-J可以通過(guò)其編碼env基因抑制天然免疫基因CCL4的表達(dá)，那么是否意味著CCL4具有抵抗ALV-J增殖的能力呢？為此構(gòu)建了CCL4真核表達(dá)載體(圖2)。通過(guò)過(guò)表達(dá)CCL4基因來(lái)觀察其對(duì)ALV-J增殖的影響。如圖4所示，在mRNA水平檢測(cè)，過(guò)表達(dá)CCL4極顯著抑制了ALV-J的增殖(P<0.01)；在蛋白水平檢測(cè)，結(jié)果相同。

2.5 CCL4基因過(guò)表達(dá)激活巨噬細(xì)胞天然免疫相關(guān)基因和S100A9表達(dá)上述研究表明CCL4具有抑制ALV-J增殖的功能。那么CCL4通過(guò)何種途徑抑制ALV-J增殖呢？為此檢測(cè)CCL4受體CCR5及其下游相關(guān)天然免疫基因和其他抗病毒基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，在CCL4過(guò)表達(dá)48 h后，CCR5和TLR7表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，IFN-α表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.01)，鈣衛(wèi)蛋白S100A9亦極顯著上調(diào)(升高約6倍，P<0.01)。這說(shuō)明CCL4可能不是通過(guò)激活細(xì)胞抗病毒天然免疫的途徑抑制ALV-J增殖，而是通過(guò)激活抗病毒基因S100A9及其上、下游通路抑制ALV-J增殖的。

A.mRNA水平檢測(cè)ALV-J被抑制；B.蛋白水平檢測(cè)ALV-J被抑制

A.過(guò)表達(dá)CCL4上調(diào)天然免疫基因；B.過(guò)表達(dá)CCL4上調(diào)S100A9

3 討論

CCL4是一個(gè)關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，在抗病毒天然免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色，而巨噬細(xì)胞作為一類關(guān)鍵的天然免疫細(xì)胞，在非特異性免疫和特異性免疫應(yīng)答中也同樣重要。研究表明，病毒感染或外界因素刺激雞巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)CCL4的表達(dá)。例如，cNK-2誘導(dǎo)CCL4在雞HD11細(xì)胞和原代單核細(xì)胞中表達(dá)[6]；熱應(yīng)激和脂多糖(LPS)刺激使得CCL4在雞巨噬細(xì)胞中表達(dá)[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)只有ALV-J感染巨噬細(xì)胞早期(感染后6 h)，CCL4在病毒感染的HD11細(xì)胞中顯著上調(diào)，從感染12 h后CCL4開(kāi)始下調(diào)。這一動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律與CCL4在ALV-J感染雞法氏囊組織中的表達(dá)趨勢(shì)類似[4]，暗示CCL4表達(dá)可能具有抑制ALV-J病毒復(fù)制的功能，因而在病毒感染晚期被抑制。為了證實(shí)這一推測(cè)，通過(guò)分別過(guò)表達(dá)ALV-J env、GP85和GP37，發(fā)現(xiàn)它們均可以顯著抑制CCL4表達(dá)，但env蛋白抑制作用更加明顯，說(shuō)明ALV-J編碼的env基因?qū)υ诓《靖腥具^(guò)程中抑制CCL4的表達(dá)起著重要作用。

再者，探索了CCL4的抗病毒作用。在HD11細(xì)胞中，CCL4過(guò)表達(dá)可以顯著抑制ALV-J增殖水平。進(jìn)一步通過(guò)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CCL4過(guò)表達(dá)可以上調(diào)其受體CCR5表達(dá)[2]，還可以上調(diào)天然免疫相關(guān)基因如TLR7和IFN-α的表達(dá)，結(jié)果與TLR7的配體可以誘導(dǎo)IFN-α表達(dá)相符[9]；同時(shí)顯著上調(diào)了抗病毒基因鈣衛(wèi)蛋白S100A9的表達(dá)。S100A9蛋白通常通過(guò)與CD85j受體相互作用激活NK細(xì)胞控制人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的復(fù)制[10]。S100A9可以與TLR4高特異性結(jié)合[11]，而CCL4可以通過(guò)TLR4信號(hào)通路被激活[12]，說(shuō)明CCL4上調(diào)S100A9表達(dá)可能是通過(guò)TLR4這個(gè)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

在病毒感染早期，ALV-J可能利用上調(diào)CCL4促進(jìn)病毒在感染細(xì)胞中的增殖，但隨著CCL4上調(diào)激活宿主免疫應(yīng)答后，ALV-J又通過(guò)其編碼的env蛋白下調(diào)CCL4表達(dá)。研究表明，許多致癌病毒能操縱趨化因子家族以達(dá)到逃避細(xì)胞免疫系統(tǒng)攻擊從而增殖的目的[13]。更加驚奇的是，一些病毒也能編碼人類趨化因子同源物。例如，人巨細(xì)胞病毒(HCMV)編碼CXCL-2；卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)編碼CCL1、CCL2和CCL3。人皰疹病毒6(HHV-6)可以編碼CCL4[14]，并且趨化因子由腫瘤細(xì)胞通過(guò)自分泌和旁分泌產(chǎn)生與其相應(yīng)配體結(jié)合支配著腫瘤的微環(huán)境，有助于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、血管生成和激活免疫抑制反應(yīng)[15]。因此，深入研究趨化因子在病毒感染過(guò)程中的作用及其機(jī)制，將有助于破解禽類腫瘤病毒的致病或致癌機(jī)制。

綜上所述，本研究揭示了CCL4在巨噬細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律及其抗ALV-J作用，為今后深入研究CCL4的功能及其宿主遺傳抗性奠定基礎(chǔ)。