雞毒支原體TM-1蛋白嵌合新城疫病毒樣顆粒的構(gòu)建及鑒定

辛 梅，張 頔，李金斗，丁佳欣，于喜冰，徐小洪，丁 偉，邵亞男，單春輝，丁 壯

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130062)

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)屬支原體科、支原體屬，是介于細(xì)菌和病毒之間的一種病原體[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)雞群的MG感染非常普遍[2-4]，MG感染后主要引起禽類的慢性呼吸道病(chronic respiratory disease，CRD)，呈慢性經(jīng)過，造成產(chǎn)蛋率下降，飼料利用率降低，死亡率不高，但常與其他病原體如大腸桿菌、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)等混合感染，導(dǎo)致病情變得復(fù)雜、癥狀加重、死亡率升高。臨床上雛雞感染MG后，在接種新城疫(Newcastle disease，ND)弱毒活疫苗時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致發(fā)病，造成ND抗體顯著下降[5]。TM-1蛋白是由MG的VlhA5.02基因編碼的一種保護(hù)性蛋白，具有高度的保守性[6]，對(duì)于MG感染后的黏附過程十分重要。SAITO等[7]證明TM-1免疫雞群后，免疫保護(hù)率可達(dá)到80%，能夠有效抵御MG感染，可以作為開發(fā)新型重組疫苗的候選抗原。

ND是由副黏病毒科、禽腮腺炎病毒屬的NDV引起的急性、烈性、高度接觸性的傳染病[8]，具有高發(fā)病率和死亡率，是《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)》指出的優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一[9]。目前，隨著綜合防控措施的不斷加強(qiáng)，對(duì)于ND的防控取得了一定效果，ND流行得到了基本控制，但出現(xiàn)了新的流行病學(xué)特點(diǎn)即地方性、非典型性、免疫帶毒以及免疫失敗時(shí)有發(fā)生等[10]。

目前，養(yǎng)殖場(chǎng)雞群MG感染普遍，與NDV混合感染后會(huì)導(dǎo)致雞群癥狀加重，病情復(fù)雜，死亡率上升。而現(xiàn)存的針對(duì)MG的疫苗不能與ND疫苗同時(shí)使用，需要間隔一段時(shí)間，存在免疫窗口期，增加了雞群患病的風(fēng)險(xiǎn)。因此研制安全有效、免疫程序簡(jiǎn)便的新型疫苗尤為重要。

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒蛋白組成的納米級(jí)生物結(jié)構(gòu)[11]。自1979年首次報(bào)道構(gòu)建成功以來，各種病毒的VLPs不斷被成功研制，VLPs已成為新型疫苗研發(fā)的有利平臺(tái)。VLPs主要有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：不含病毒核酸，無法感染與自我復(fù)制，具有良好的生物安全性；具有與病毒相似的結(jié)構(gòu)與空間形態(tài)，可有效激發(fā)體液免疫、細(xì)胞免疫以及黏膜免疫；VLPs允許外源基因的插入，能夠作為多功能的納米載體將外源蛋白高效展示于表面，構(gòu)成嵌合VLPs，為制備多價(jià)或多聯(lián)疫苗提供可能。鑒于VLPs具有以上優(yōu)點(diǎn)，本研究基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建新型的MG TM-1蛋白嵌合NDV樣顆粒，來補(bǔ)充現(xiàn)有疫苗的缺陷，以期為ND與MG感染的防控提供新方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及載體Sf9昆蟲細(xì)胞，E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，rBv-M、rBv-HN、rBv-F以及pFastBac1空載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，pEASY-T Simple購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑M5HiPer Taq HiFi PCR mix購(gòu)自北京聚合美生物技術(shù)有限公司；昆蟲培養(yǎng)基Sf-900TMⅢ SFM (1X)購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自BI公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；兔抗MG TM-1、兔抗NDV M、兔抗NDV F、兔抗NDV HN高免血清均由本室制備并保存；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent購(gòu)自ROCHE公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank NDV HN(DQ659677.1)的胞外域序列、MG TM-1(NO-004829.2)的核酸序列，分別設(shè)計(jì)上、下游rHN-TM-1-F、rHN-TM-1-R鑒定引物以及M13、pFastBac1通用引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 相關(guān)引物信息

1.4 目的基因的合成根據(jù)GenBank MG TM-1(NO-004829.2)的ORF序列，依次添加柔性肽序列(G4S)與GenBank NDV HN(DQ659677.1)的胞外域序列連接，并在上游添加SalⅠ酶切位點(diǎn)，下游添加KpnⅠ酶切位點(diǎn)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，命名為pUC-rHN TM-1。

1.5 表達(dá)rHN TM-1基因的重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將pFastBac1空載體以及公司合成的pUC-rHN TM-1分別用SalⅠ、KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，膠回收其產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化至E.coliDH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞。次日，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，取鑒定正確的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。利用特異性引物以及pFastBac1通用引物鑒定正確后，送至測(cè)序，將鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒命名為pFastBac1-rHN TM-1。

1.6 表達(dá)rHN TM-1基因的重組桿粒的構(gòu)建及鑒定將pFastBac1-rHN TM-1轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行3次藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定，獲得陽性菌株。提取桿粒，將鑒定正確桿粒命名為rBacmid-rHN TM-1。

1.7 表達(dá)rHN TM-1基因的重組桿狀病毒的拯救與鑒定當(dāng)6孔板內(nèi)Sf9細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)將rBacmid-rHN TM-1與轉(zhuǎn)染試劑按照1∶2的比例混合均勻，27℃培養(yǎng)96 h，收集上清，為P1代。將200 μL的P1代滴加入6孔板內(nèi)細(xì)胞密度為70%～80%的Sf9細(xì)胞內(nèi)，27℃培養(yǎng)96 h，收集上清為P2代，依次傳至P4代。收集P4代桿狀病毒，提取其基因組，分別用特異性引物及通用引物進(jìn)行PCR鑒定，將結(jié)果正確的樣品命名為rBv-rHN TM-1。

1.8 表達(dá)rHN TM-1基因的重組桿狀病毒滴度的測(cè)定使用桿狀病毒滴度快速測(cè)定試劑盒測(cè)定病毒滴度，具體操作見說明書。

1.9 IFA檢測(cè)將rBv-M、rBv-HN、rBv-F、rBv-rHN TM-1以MOI=5共感染Sf9細(xì)胞，并分別設(shè)置未感染組作為對(duì)照，培養(yǎng)48 h后，用多聚甲醛溶液固定10 min，Triton通透10 min，分別以NDV M、NDV HN、NDV F、MG TM-1的多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的豬抗兔IgG抗體為二抗，Hoechst染核處理，制備細(xì)胞爬片，然后利用激光共聚焦顯微鏡觀察各組分蛋白表達(dá)情況。

1.10 MG-ND cVLPs的產(chǎn)生與鑒定

1.10.1MG-ND cVLPs的產(chǎn)生 Sf9細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至密度為2×106，將構(gòu)建成功的P4代rBv-rHN TM-1與實(shí)驗(yàn)室保存的rBv-M、rBv-HN、rBv-F以MOI=5共感染Sf9細(xì)胞，27℃、200 r/min培養(yǎng)96 h,收集細(xì)胞上清,分別經(jīng)20%,30%,60%蔗糖密度梯度超速離心純化獲得cVLPs。

1.10.2MG-ND cVLPs的鑒定 將純化后的cVLPs進(jìn)行Western blot鑒定并利用透射電鏡觀察其形態(tài)特征。

2 結(jié)果

2.1 重組穿梭質(zhì)粒pFastBac1-rHN TM-1的鑒定利用特異性引物以及pFastBac1通用引物對(duì)pFastBac1-rHN TM-1進(jìn)行PCR鑒定，將產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果可見大小為987，1 112 bp的2條條帶，與預(yù)期大小相符，送至測(cè)序結(jié)果無突變(圖1)。

M.DL5000 DNA Marker；1.特異性引物PCR擴(kuò)增rHN TM-1基因產(chǎn)物;2.通用引物PCR擴(kuò)增rHN TM-1產(chǎn)物

2.2 重組桿粒rBacmid-HN-TM-1的鑒定經(jīng)藍(lán)白斑篩選3次后，三抗(Kan+Tet+GM)板所生長(zhǎng)菌落均為白色，隨機(jī)挑取白色菌落，接至液體三抗LB，過夜培養(yǎng)后提取桿粒，分別用特異性引物以及M13通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，特異性引物PCR產(chǎn)物大小為987 bp，通用引物PCR產(chǎn)物大小約為3 187 bp(圖2)。

2.3 重組桿狀病毒rBV-rHN TM-1的鑒定

2.3.1Sf9細(xì)胞病變觀察 將桿粒rBacmid-rHN TM-1轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與正常Sf9細(xì)胞比較可見細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)生變大變圓、呈顆粒變性甚至脫落、破碎等典型病變(圖3)。

M.DL5000 DNA Marker；1～4.特異性引物PCR擴(kuò)增rBacmid-rHN TM-1產(chǎn)物；5～8.通用引物PCR擴(kuò)增rBacmid-rHN TM-1產(chǎn)物

2.3.2重組桿狀病毒rBv-rHN TM-1的鑒定 將桿粒rBacmid-rHN TM-1轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞，依次傳代，收集產(chǎn)生的桿狀病毒，提取P4代桿狀病毒的基因組，用特異性引物以及通用引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，條帶大小與預(yù)期相符(圖4)。

2.3.3IFA檢測(cè) 利用激光共聚焦顯微鏡觀察cVLPs的各組分蛋白表達(dá)情況，可見各試驗(yàn)組與對(duì)應(yīng)未感染組相比均出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，表明各組分蛋白均正確表達(dá)(圖5)。

A.正常Sf9細(xì)胞；B.rBv-rHN TM-1感染后細(xì)胞

M.DL5000 DNA Marker；1.特異性引物PCR擴(kuò)增rBv-rHN TM-1產(chǎn)物；2.通用引物PCR rBv-rHN TM-1產(chǎn)物

圖5 IFA檢測(cè)蛋白表達(dá)

2.4 MG-ND cVLPs的鑒定

2.4.1MG-ND cVLPs的透射電鏡觀察 透射電鏡觀察純化后的cVLPs形態(tài)，粒子呈球形，大小約為100 nm，表面存在纖突結(jié)構(gòu)，與野生型NDV粒子相似(圖6)。

2.4.2MG-ND cVLPs的Western blot分析 將經(jīng)過純化的MG-ND cVLPs進(jìn)行Western blot 鑒定，結(jié)果顯示可與NDV M、NDV HN、NDV F、MG TM-1的多克隆抗體結(jié)合且條帶與預(yù)期的大小相符，其中NDV M因存在糖基化修飾，實(shí)際蛋白略大于40 kDa，NDV HN、NDV F 、rHN TM-1蛋白大小分別為70，55，35 kDa(圖7)。

3 討論

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)雞群MG的平均感染率高，致死率低[2-4]。雛雞感染后抵抗力降低，常與呼吸道有關(guān)疾病并發(fā)，如ND、傳染性支氣管炎等，混合感染后會(huì)導(dǎo)致死亡率上升。ND是由NDV引起的烈性傳染病，具有高發(fā)病率和死亡率。對(duì)于這兩種疾病的最有效防控措施為疫苗接種，然而，廣泛使用的傳統(tǒng)MG和NDV疫苗均為弱毒疫苗，均存在明顯不足。首先，NDV的弱毒苗主要為基因Ⅱ型的La Sota株，與我國(guó)目前流行的基因Ⅶ型NDV同源性僅為82%左右[12]，存在基因型不匹配的問題；第二，目前使用的MG活疫苗F36株，在免疫過程中必須與ND La Sota弱毒苗間隔使用，存在免疫窗口期，增加了雞群患病的風(fēng)險(xiǎn)；第三，活病毒疫苗可能造成輕微的呼吸道或消化道癥狀[13]；第四，作為活疫苗，本身具有基因突變以及與流行的野生毒株發(fā)生基因重組的問題[14]，存在散毒和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)；第五，目前使用的活病毒疫苗以及滅活病毒疫苗，難以區(qū)分野毒感染與疫苗株感染，而野毒抗體與疫苗抗體的區(qū)別對(duì)于疫病防控的監(jiān)測(cè)十分重要。因此，制備一種安全有效、免疫程序簡(jiǎn)便的ND-CRD疫苗刻不容緩。VLPs疫苗可以克服目前ND與MG疫苗使用的大部分問題。與活疫苗相比，VLPs不含病毒核酸，不能感染與自我復(fù)制，且排除了與野毒株重組的可能性，具有良好的生物安全性；與滅活疫苗相比，避免滅活疫苗滅活不徹底導(dǎo)致禽類個(gè)體發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)；與其他亞單位疫苗相比，VLPs作為外源性抗原可被抗原提呈細(xì)胞(APC)，特別是樹突狀細(xì)胞(DC)有效地?cái)z取，然后由MHC Ⅱ類分子進(jìn)行抗原處理和提呈，從而刺激CD4+T輔助細(xì)胞[15]。VLPs與天然病毒類似，也作為內(nèi)源性抗原潛伏在DC細(xì)胞的胞漿中，并由MHC Ⅰ類分子呈現(xiàn)給細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞(CTLs)[16]，這種交叉呈現(xiàn)機(jī)制確保了機(jī)體能夠產(chǎn)生全面且有效的免疫反應(yīng)；此外，VLPs平臺(tái)也是適合應(yīng)用于多種、多型的高突變RNA病毒[17-18]。NDV作為高突變率的RNA病毒，多種ND VLPs已被成功研制。在國(guó)內(nèi)，錢晶等[19]證明了ND VLPs 可以有效誘導(dǎo)DC細(xì)胞的成熟。丁佳欣等[20]成功構(gòu)建不同基因型的ND VLPs并證明了其具有良好的免疫原性以及免疫效果。此外，由于ND VLPs能夠高密度展示表面蛋白以及釋放率高等原因，在作為遞送外源抗原的載體方面也顯示出了巨大優(yōu)勢(shì)。在不影響自身合成的情況下，可以通過GPI錨定或胞外域替換等方式將外源蛋白如布魯菌的BCSP31蛋白[21]，伯氏疏螺旋體的OspA、OspC蛋白[22]等展示于VLPs表面，經(jīng)證明可以發(fā)揮較好的免疫原性以及有效抵御病原菌的攻擊。

A.野生NDV NA-1株;B.MG-ND cVLPs

M.蛋白Marker；A.MG-ND cVLPs M蛋白；B.MG-ND cVLPs HN蛋白；C.MG-ND cVLPs F蛋白；D.MG-ND cVLPs rHN TM-1蛋白

本研究基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，以NDV基質(zhì)蛋白為骨架，利用胞外域替換的方式，將NDV的HN蛋白胞外域替換為MG的TM-1蛋白，從而將TM-1蛋白嵌合至 ND VLPs表面，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察顆粒各組分蛋白均表達(dá)成功，蔗糖密度梯度離心純化后，透射電鏡觀察可見大小約100 nm 的粒子，表面呈纖突結(jié)構(gòu)，與野生型NDV大小一致；Western blot鑒定表達(dá)了NDV M、F、HN以及MG TM-1蛋白。因此，本研究成功構(gòu)建了MG-ND cVLPs。雖然該cVLPs已成功制備，但其免疫原性以及免疫效果仍待進(jìn)一步研究。綜上所述，MG-ND cVLPs的構(gòu)建為防控ND與MG提供了新的解決方案，可達(dá)到簡(jiǎn)化免疫流程、一針二防的目的，同時(shí)也為MG與其他病毒或細(xì)菌的混合感染提供了防控新思路。